ОЧИЩЕННАЯ ДНК-ПОЛИМЕРАЗА, РЕКОМБИНАНТНАЯ ДНК-ПОЛИМЕРАЗА, СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, ВЫДЕЛЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ДНК И НАБОР ДЛЯ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 2004 года по МПК C12N9/10 C12N15/11 C12N15/54 C12N15/70 

Текст описания в факсимильном виде (см. графический материал)

Изобретение относится к биотехнологии и касается модифицированной ДНК-полимеразы. Заявлена очищенная ДНК-полимераза, проявляющая активность обратной транскриптазы в присутствии ионов магния и/или ионов марганца, обладающая пониженной активностью 5'-3'-экзонуклеазы, по существу не обладающая активностью рибонуклеазы Н и получаемая из Carboxydothermus hydrogenoformans. Аминокислотная и нуклеотидная последовательности приведены в описании. Термофильная ДНК-полимераза входит в набор для проведения ПЦР с обратной транскрипцией РНК. Изобретение позволяет получить обратную транскриптазу, действующую при высоких температурах и обеспечивающую продуцирование кДНК без делеций. 6 с. и 4 з.п.ф-лы, 7 ил.

1. Очищенная ДНК-полимераза, проявляющая активность обратной транскриптазы в присутствии ионов магния и/или ионов марганца, обладающая пониженной активностью 5’-3’-экзонуклеазы или ее отсутствием и по существу не обладающая активностью рибонуклеазы Н и получаемая из Carboxydothermus hydrogenoformans, и где указанная полимераза имеет кажущуюся молекулярную массу между 64 и 71 кД, определенную методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS), и содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID No: 11.2. ДНК-полимераза по п.1, отличающаяся тем, что указанная ДНК-полимераза проявляет активность обратной транскриптазы при практическом отсутствии ионов марганца.3. ДНК-полимераза по п.1 или 2, отличающаяся тем, что указанная полимераза проявляет активность обратной транскриптазы, зависимую от марганца.4. ДНК-полимераза по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что активность обратной транскриптазы, зависимая от магния, выше активности обратной транскриптазы указанной полимеразы, зависимой от марганца.5. ДНК-полимераза по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что указанная полимераза обладает пониженной активностью 5’-3’-экзонуклеазы или ее отсутствием, при этом последнюю получают из природной полимеразы, обладающей активностью 5’-3’-экзонуклеазы.6. Рекомбинантная ДНК-полимераза, проявляющая активность обратной транскриптазы в присутствии ионов магния и/или ионов марганца, обладающая пониженной активностью 5’-3’-экзонуклеазы или ее отсутствием и по существу не обладающая активностью рибонуклеазы Н и где указанная полимераза имеет кажущуюся молекулярную массу между 64 и 71 кД, определенную методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS), и содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID No: 11, где указанную полимеразу получают из штамма Е. coli, обозначенного как Е. coli GA 1.7. Выделенная последовательность ДНК, кодирующая ДНК-полимеразу по любому из пп.1-6, включающая нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 10.8. Способ получения ДНК-полимеразы по любому из пп.1-5, включающий стадии (а) культивирования природного штамма Carboxydothermus hydrogenoformans; (b) суспендирования клеток природного штамма в буфере; (с) разрушения клеток; (d) очистки ДНК-полимеразы хроматографическими способами, включая использование одной или нескольких сефарозных колонок.9. Способ получения ДНК-полимеразы по п.6, включающий культивирование рекомбинантного штамма Е. coli, трансформированного вектором, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 10, очистку и выделение ДНК-полимеразы.10. Набор для осуществления полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией PHK (RT-PCR), где набор содержит термофильную ДНК-полимеразу по любому из пп.1-6 и другие традиционные дополнительные компоненты для осуществления RT-PCR.