Текст описания в факсимильном виде (см. графический материал)1
Изобретение относится к области медицины к способу характеристики, классификации и дифференцировки тканей и типов клеток, предсказания поведения тканей и групп клеток и идентификации генов с измененной экспрессией путем превращения основания цитозина (не 5-метилцитозина) в геномной ДНК, полученной из любой пробы ткани, в урацил посредством обработки бисульфитным раствором с последующей амплификацией фракции обработанной геномной ДНК, используя очень короткие или вырожденные олигонуклеотиды, и оставшиеся цитозины амплифицированных фракций определяют с помощью гибридизации или полимеразной реакции. Способ представляет новую возможность дифференциальной диагностики раковых заболеваний. 2 с. и 17 з.п.ф-лы, 8 ил., 5 табл.
1. Способ дифференцировки тканей и типов клеток и идентификации генов с модифицированной экспрессией, заключающийся в том, что в геномной ДНК основание цитозин превращают в урацил путем обработки геномной ДНК бисульфитным раствором с последующей амплификацией фракций обработанной таким образом ДНК с использованием или очень коротких или вырожденных олигонуклеотидов, или олигонуклеотидов, комплементарных адаптерным олигонуклеотидам, которые были присоединены к концу расщепленной ДНК перед бисульфитной обработкой, и определением количества оставшегося цитозина на богатой изанином ДНК-цепи и/или изанинов на богатой цитозином ДНК-цепи из амплифицированных фракций путем гибридизации или полимеразной реакции.2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что ДНК разрезают перед обработкой бисульфитом эндонуклеазами рестрикции, для которых характерно наличие цитозина в 5'-CpG-3' контексте в их последовательности узнавания, и что ДНК разрезают в тех последовательностях узнавания, в которых цитозин в 5-CpG-3' контексте находится в неметилированной форме в 5'-положении.3. Способ по п.1, характеризующийся тем, что перед тем как геномную ДНК модифицируют бисульфитным раствором эту геномную ДНК разрезают эндонуклеазой рестрикции, полученные концы снабжают посредством реакции лигирования известными короткими и двухцепочечными последовательностями ДНК, также называемыми адаптерами, и олигонуклеотиды, комплементарные адаптерам, которые подверглись обработке бисульфитом, используют для амплификации.4. Способ по п.1, характеризующийся тем, что реакцию пробы геномной ДНК с бисульфитным раствором для превращения цитозина в урацил с одновременным сохранением метилцитозина проводят при циклическом изменении температур реакции между 0 и 100°С.5. Способ по п.1, характеризующийся тем, что пробу ДНК перед обработкой бисульфитом переносят в нагреваемый пористый капилляр, который проницаем только для маленьких молекул, в котором проводят последующие реакционные стадии бисульфитной обработки путем добавления и удаления реагентов посредством диализа.6. Способ по п.1, характеризующийся тем, что ДНК-пробу перед обработкой бисульфитом переносят в нагреваемый капилляр, который не проницаем для маленьких молекул, в котором последующие реакционные стадии бисульфитной обработки проводят путем добавления и удаления реагентов через присоединенные капилляры.7. Способ по п.1, характеризующийся тем, что полимеразные реакции, которые следуют за бисульфитной обработкой, проводят в том же капилляре, в котором проводят бисульфитную обработку, или в капилляре, соединенном с этим капилляром, или в контейнере, соединенном с этим капилляром.8. Способ по п.1, характеризующийся тем, что в капилляре, в котором проводят полимеразные реакции пробы ДНК, обработанной бисульфитом, проводят разделение по длине полученной фрагментной популяции.9. Способ по п.1, характеризующийся тем, что обработанную ДНК отделяют путем осаждения бисульфита.10. Способ по п.1, характеризующийся тем, что для амплификации проб геномной ДНК, обработанной бисульфитом, комбинируют олигонуклеотиды двух классов, при этом олигонуклеотиды одного класса не содержат основания цитозина или его аналогов, за исключением в контексте 5'-CpG-3', или содержат в очень незначительной степени, или содержат только в тех участках этих олигонуклеотидов, которые не важны для амплификации, и олигонуклеотиды другого класса не содержат основания гуанина или его аналогов, за исключением в контексте 5'-CpG-3', или содержат в очень незначительной степени, или содержат только в таких участках олигонуклеотидов, как например 5'-участки, которые не важны амплификации, и эти два класса олигонуклеотидов или a) настолько короткие, что при амплификации, в которой содержится только один представитель из этих двух классов, амплифицируются более 100 различных фрагментов, или b) содержат столько так называемых вырожденных положений, что при амплификации только с одним представителем из каждого класса амплифицируется более 100 фрагментов, или с) используются в таком большом количестве, что при амплификации амплифицируется более 100 различных фрагментов.11. Способ по п.3 или 10, характеризующийся тем, что обработанную и амплифицированную ДНК смешивают в отдельных препаратах для полимеразной реакции с различными олигонуклеотидами в каждой реакции, которые комплементарны по своим 5'-концам адаптерам или в основном комплементарны для амплификации олигонуклеотидов, обработанных бисульфитом, и которые различаются по своим 3'-концам в каждой реакции и вариабельные 3'-концы которых начинаются ниже известной адаптерной последовательности или олигонуклеотидной последовательности, и их 3'-вариабельные концы продолжаются далее известной адаптерной последовательности на 2-12 нуклеотидов в неизвестную последовательность матричной ДНК пробы.12. Способ по п.11, отличающийся тем, что олигонуклеотиды комплементарны обработанной бисульфитом ДНК и содержат в дополнение к трем нуклеотидам dATP, dTTP и dCTP или аналогам этих трех нуклеотидов нуклеотидный аналог, который комплементарен цитозиновому основанию и который после включения полимеразой блокирует какую-либо дальнейшую элонгацию цепи, либо не содержат его.13. Способ по п.11, отличающийся тем, что олигонуклеотиды, которые комплементарны ДНК, обработанной бисульфитом, и содержат в дополнение к трем нуклеотидам dATP, dTTP и dGTT или их аналогам нуклеотидный аналог, который комплементарен основанию гуанину и который после введения полимеразой блокирует любую дальнейшую элонгацию цепи, либо не содержат его.14. Способ по п.12, характеризующийся тем, что терминацию полимеразной реакции проводят в тех положениях в пробе ДНК, которые ранее содержали метилцитозин, посредством терминаторов, которые сами модифицированы таким образом, что они позволяют обнаружить специфически терминированные продукты полимеразной реакции.15. Способ по п.1, характеризующийся тем, что различные фрагментные смеси отдельных реакционных препаратов, полученные из подходящего сочетания пп.2-14, наносят на отдельные точки ионного источника MALDI-TOF или другого масс-спектрометра и фрагментный состав индивидуальных реакций определяют путем установления массы всех фрагментов ДНК.16. Способ по п.1, характеризующийся тем, что различные фрагментные смеси отдельных реакционных препаратов, полученные из подходящего сочетания пп.2-14, наносят на отдельные дорожки гель-электрофореза и фрагментный состав индивидуальных реакций определяют путем установления длины всех фрагментов ДНК.17. Способ по п.3 или 10, характеризующийся тем, что каждый из олигонуклеотидов по п.11, с которых начинается полимеразная реакция, связывается с олигонуклеотидом, имеющим другую последовательность и различные химические метки, и их химические и/или физические свойства позволяют определять и дифференцировать различные метки стандартными хроматографическими или масс-спектрометрическими методами.18. Способ по п.17, характеризующийся тем, что полученную на первой стадии амплификации фракцию фрагментов исследуемой ДНК, которая была обработана бисульфитом, смешивают одновременно с двумя или более химически различно меченными олигонуклеотидами, эти олигонуклеотиды используют как праймеры для полимеразной реакции, получающуюся сложную смесь фрагментов подвергают электрофоретическому разделению по длине и отдельные фракции с определенной длиной этой смеси фрагментов, полученные в результате электрофореза, подвергают хроматографическому или масс-спектрометрическому анализу, который определяет, в какой фракции с определенной длиной присутствуют или отсутствуют химические метки, которые характеризуют олигонуклеотиды.19. Набор, позволяющий проводить клинически релевантную диагностику ракового заболевания, содержащий олигонуклеотиды для амплификации и олигонуклеотиды, фиксируемые на матрице, соединенные для обработки ДНК бисульфитом и амплификации этой обработанной ДНК.
