ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ Российский патент 2010 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к общей и медицинской микробиологии и может быть использовано в научно-исследовательской и практической работе для бактериологической диагностики ряда условно-патогенных микроорганизмов.

В настоящее время существует достаточное количество питательных сред для культивирования микроорганизмов: мясо-пептонный бульон, жидкая среда Хоттингера, с различным содержанием аминного азота, сердечно-мозговой бульон и т.д. В последнее время широкое распространение получили казеиново-соевые среды - триптон-соевые и трипказо-соевые бульоны. Как правило, питательная среда состоит из белковой и углеводной основы, а также дополнительных компонентов, которые усиливают рост микроорганизмов: витаминов, аминокислот, минеральных компонентов. Для приготовления белковой основы чаще всего используют мясные, рыбные бульоны или белковые гидролизаты. Основным источником сырья для производства таких бульонов является мясо, рыба, боенская кровь, сердце и т.п. (Белковые гидролизаты в производстве питательных сред. - М.: ВНИИ систем управления, 1990, 50 с.).

Известна питательная среда для культивирования условно патогенных бактерий рода Listeria. Она состоит из белковой основы, в качестве которой используют мясо-пептоный бульон, раствора натрия хлорида и воды (патент Франции № 2671561, кл. C12Q 1/04).

Недостатком вышеуказанных питательных сред является недостаточный аминокислотный состав, который приводит к неравномерному росту таких притязательных микроорганизмов, как бактерии, относящиеся к роду Listeria. Кроме того, эти среды дорогостоящие и, как правило, импортного производства, поэтому недоступны широкой сети практических лабораторий, занимающихся диагностикой условно патогенных микроорганизмов. В этой связи разработка простых, недорогих, питательных сред для культивирования бактерий, в частности листерий, иерсиний и им подобным, весьма актуальна.

Наиболее близким техническим решением к заявляемому изобретению, по совокупности признаков, является питательная среда на основе триптиказо-соевого бульона с дрожжевым экстрактом («HiMedia LabLtd», Индия (http://www.himedialabs.ru/ml417/)), включающая белковую основу из гидролизата казеина (17,0 г/л) и папаинового отвара соевой муки (3,0 г/л), углеводную основу в виде глюкозы (2,5 г/л), а также хлорид натрия (5,0 г/л), гидрофосфат калия (2,5 г/л), дрожжевой экстракт (6,0 г/л). Цена данной питательной среды около 30$.

Причинами, препятствующими достижению указанного технического результата при использовании известной среды, принятой за прототип, является то, что ее белковая основа содержит недостаточный для стабильного культивирования бактерий аминокислотный состав. Поэтому для приготовления данной питательной среды приходится использовать такие дорогостоящие ингредиенты, как гидролизат казеина и папаинового отвара соевой муки, в результате данная среда многокомпонентная, сложна в приготовлении, дорогостоящая и малодоступна практическим лабораториям.

Задача предлагаемого изобретения - повышение стабильности и скорости роста бактерий за счет обеспечения в питательной среде постоянного аминокислотного состава, удешевление ее, расширение сырьевой базы для приготовления белковой основы питательной среды за счет использования отходов рыбного производства, доступность в применении практическим лабораториям.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается за счет того, что при приготовлении питательной среды для культивирования бактерий в качестве белковой основы используют раствор отвара из молок рыб в соотношении 1:2 (жидкий отвар из молок рыб:дистиллированная вода) или 4,45 г сухого отвара из молок рыб на 1 л дистиллированной воды, со следующим соотношением компонентов, г/л:

дрожжевой экстракт 10,0 глюкоза 1,0 хлорид натрия 5,0 раствор отвара из молок рыб до 1 л

рН среды 7,2-7,4.

Использование в предлагаемой питательной среде в качестве белковой основы отвара из молок рыб обуславливает быстрый и стабильный рост микроорганизмов за счет содержания в нем достаточного количества аминокислот и микроэлементов. Молоки рыб - доступный, недорогой источник сырья. Они содержат нуклеопротеиды, состоящие из нуклеиновых кислот и простейших белков - протаминов и гистонов. Протамины и гистоны построены из аминокислот, среди которых преобладают аргинин, лизин и гистидин; в состав протаминов входят тирозин, триптофан, серин, валин и пролин, а в состав гистонов - серин, валин, аланин, фенилаланин и тирозин. В молоках ряда рыб присутствуют такие водорастворимые витамины: B₁₂ в количествах от 7 до 50 мкг %; B₁ (тиамин) - 50-185 мкг %; В₂ (рибофлавин) - 40-600 мкг %; В_с (фолиевая кислота) - 125-1300 мкг %; РР (никотиновая кислота) - 1,1-5,7 мг % и др. (В.П.Зайцев, И.В.Кизеветтер, Л.Л.Лагунов и др. «Технология рыбных продуктов. М.: Пищевая промышленность, 1965, с.73-74). Химический состав молок кеты 6-й стадии зрелости отражен в табл.№1 (Ю.И.Касьяненко, Т.Н.Пивненко. «Сравнительные физико-химические характеристики низкомолекулярной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из морских гидробионтов» - «Известия ТИНРО», 1999, т.125, с.152-158).

Таблица 1 Химический состав молок кеты 6-й стадии зрелости, % Наименование вещества Содержание Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) 12,0 Рибонуклеиновая кислота (РНК) 0,3 Кислоторастворимые продукты 0,1 Белок 8,7 Вода 78,5 Другие 0,4

При приготовлении белковой основы для питательной среды можно использовать отвар из молок рыб как в жидком, так и в сухом виде. При этом существенными признаками предложения следует считать качественный и количественный состав питательной среды, т.к. величины содержания компонентов в заявляемой питательной среде являются оптимальными и обусловливают относительную сбалансированность стоимости среды с ее ростовыми характеристиками. Выход за пределы заявленных значений компонентов приводит либо к перерасходу сырья, либо к снижению ее ростовых свойств.

Приготовление питательной среды: заранее готовится отвар из молок рыб. Для этого берут 500 г молок различных видов рыб (лососевых, тресковых, сельдевых и т.п.), которые предварительно измельчают, добавляют дистиллированную воду в соотношении 1:2. Кипятят 1 час. Далее фильтруют и стерилизуют давлением 1 атм 30 мин. Отвар можно готовить впрок, хранить в бытовом холодильнике при температуре +(4-8)°С, до шести месяцев, или высушить, а затем использовать по мере необходимости. Сухой отвар из молок рыб можно хранить в течение длительного времени в бытовом холодильнике или при комнатной температуре, его можно транспортировать в другие регионы, при этом его качества сохраняются.

Полученный отвар содержит широкий спектр аминокислот, играющих важную роль в метаболизме бактерий.

Питательную среду можно готовить как на основе жидкого отвара молок рыб, так и на основе сухого отвара молок рыб.

Приготовление питательной среды на основе жидкого отвара молок рыб.

Белковую основу для питательной среды готовят путем разведения жидкого отвара молок рыб дистиллированной водой в соотношении 1:2. Далее к 10 г дрожжевого экстракта, 1 г глюкозы, 5 г хлорида натрия добавляют до 1 л белковой основы питательной среды. Смесь перемешивают. Полученную питательную среду разливают по емкостям, общеизвестным методом. При помощи 20% NaOH pH питательной среды в каждой емкости доводят до 7,2-7,4, а затем стерилизуют по 0,5 атм в течение 20 минут.

Полученная питательная среда представляет собой прозрачную жидкость янтарного цвета, без запаха.

Для определения ростовых свойств заявляемой питательной среды, приготовленной на основе жидкого отвара молок различных видов рыб, использовали следующие тест-штаммы бактерий: Listeria monocytogenes NCTC 10527 (4b серовариант); L. monocytogenes CLIP 75936 (1/2a серовариант); L. ivanovii NCTC 11846; L. innocua SLCC 3379; L. seeligeri SLCC 5921; L. grayi; Yersinia pseudotuberculosis 2781; Y. enterocolitica 164; Escherihia coli.

Результаты исследований представлены в табл.2.

Численность бактерий, культивируемых в заявляемой питательной среде и в среде-прототипе, определяли чашечным методом Коха после суточного культивирования бактерий при температуре 37°С. Как видно из данных таблицы, ростовые свойства тест-штаммов бактерий при культивировании в питательной среде на основе триптиказо-соевого бульона (прототип) и в заявляемой питательной среде, приготовленной на основе отвара молок различных видов рыб, стабильны. За сутки культивирования численность бактерий увеличивается на 9 порядков. Таким образом, ростовые свойства заявляемой среды не уступают прототипу.

Приготовление питательной среды на основе сухого отвара молок рыб.

Масса сухого бульона из молок рыб была определена экспериментально исходя из необходимого количества аминокислот в питательной среде. Для получения 1 л белковой основы питательной среды берут 4,45 г сухого отвара молок рыб, растворяют в 1 л дистиллированной воды. Далее к 10 г дрожжевого экстракта, 1 г глюкозы, 5 г хлорида натрия добавляют до 1 л раствора белковой основы питательной среды. Смесь перемешивают. Полученную питательную среду разливают по емкостям, общеизвестным методом. При помощи 20% NaOH pH питательной среды в каждой емкости доводят до 7,2-7,4, а затем стерилизуют по 0,5 атм в течение 20 минут.

Полученная питательная среда представляет собой прозрачную жидкость янтарного цвета без запаха.

Сравнительные данные динамики численности тест-штаммов бактерий в заявляемой питательной среде, приготовленной на основе жидкого или сухого отвара из молок лососевых рыб, представлены в табл.3.

Как видно из таблицы, ростовые свойства тест-штаммов бактерий заявляемой питательной среды, приготовленной на основе как жидкого, так и сухого отвара из молок рыб, идентичны. Однако рост листерий в заявляемой питательной среде, приготовленной на основе как жидкого, так и сухого отвара молок лососевых рыб, начинается уже через 1 час культивирования бактерий, в то время как в среде-прототипе только через 8 часов (см. чертеж).

Заявленное техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень» в виду того, что впервые для культивирования бактерий в качестве белковой основы используется жидкий или сухой отвар, приготовленный из молок рыб (лососевых, тресковых, сельдевых и т.п.).

Существенным отличием предлагаемого технического решения является:

- возможность использования предлагаемой среды для ускорения культивирования условно-патогенных бактерий;

- замена дорогостоящей импортной питательной среды дешевой легкодоступной питательной средой, приготовленной на основе отвара из молок рыб;

- использование отвара из молок рыб как в жидком, так и в сухом виде.

В результате этого достигается:

- увеличение стабильности и скорости роста бактерий;

- удешевление питательной среды;

- расширение сырьевой базы для ее приготовления.

Заявляемое техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость», так как среда проста в изготовлении, ее можно готовить как в любой микробиологической лаборатории, так и в промышленном масштабе.

Примеры конкретного получения питательной среды.

Пример 1

При приготовлении 1 л питательной среды для культивирования бактерий рода Listeria готовят жидкий отвар из молок лососевых рыб. Для этого берут 500 г молок лососевых рыб (горбуши), которые предварительно измельчают, добавляют дистиллированную воду в соотношении 1:2. Кипятят 1 час. Далее фильтруют и стерилизуют давлением 1 атм 30 мин.

Из жидкого отвара готовят белковую основу питательной среды. Для этого отвар молок разводят дистиллированной водой в соотношении 1:2 соответственно.

Далее к 10 г дрожжевого экстракта, 1 г глюкозы, 5 г хлорида натрия добавляют до 1 л раствора белковой основы питательной среды. Смесь перемешивают. Полученную питательную среду разливают по емкостям, общеизвестным методом. При помощи 20% NaOH pH питательной среды в каждой емкости доводят до 7,2-7,4, а затем стерилизуют по 0,5 атм в течение 20 минут.

Полученная питательная среда представляет собой прозрачную жидкость янтарного цвета, без запаха.

Пример 2

Приготовление 1 литра питательной среды на основе сухого отвара из молок кеты осуществляют следующим образом: из 4,45 г сухого отвара из молок кеты и 1 л дистиллированной воды готовят белковую основу питательной среды. Затем к 10 г дрожжевого экстракта, 1 г глюкозы, 5 г хлорида натрия добавляют до 1 л раствора белковой основы питательной среды. Смесь перемешивают. Полученную питательную среду разливают по емкостям, общеизвестным методом. При помощи 20% NaOH pH питательной среды в каждой емкости доводят до 7,2-7,4, а затем стерилизуют по 0,5 атм в течение 20 минут.

Полученная питательная среда накопления представляет собой прозрачную жидкость янтарного цвета, без запаха.

Пример 3

Питательную среду для культивирования бактерий рода Yersinia готовят аналогично примеру 1.

Только в качестве сырья для приготовления бульона используют молоки сельди.

Полученная питательная среда представляет собой прозрачную жидкость янтарного цвета, без запаха.

Пример 4

Питательную среду для культивирования бактерий рода Yersinia готовят аналогично примеру 2.

Только в качестве сырья для приготовления бульона используют молоки трески.

Полученная питательная среда представляет собой прозрачную жидкость янтарного цвета, без запаха.

Пример 5

Питательную среду готовят аналогично примеру 1.

Только в качестве сырья для приготовления бульона используют молоки наваги.

Полученная питательная среда представляет собой прозрачную жидкость янтарного цвета, без запаха.

Пример 6

Питательную среду для культивирования бактерий рода Escherihia coli готовят аналогично примеру 2.

Только в качестве сырья для приготовления бульона используют молоки красноперки.

Полученная питательная среда представляет собой прозрачную жидкость янтарного цвета, без запаха.

Питательная среда разработана на основе дешевого, отечественного сырья, проста в изготовлении, значительно дешевле среды-прототипа. Для ее приготовления можно использовать некондиционные молоки рыб 5-6 степени зрелости, т.е. текучие, которые нельзя использовать для приготовления пищевых продуктов. При этом ее ростовые свойства не уступают контрольным средам, а технология приготовления значительно проще, что позволяет расширить сырьевую базу и удешевить питательную среду для культивирования бактерий.

Изобретение относится к общей и медицинской микробиологии и может быть использовано в научно-исследовательской и практической работе для бактериологической диагностики ряда условно-патогенных микроорганизмов. Питательная среда содержит глюкозу, дрожжевой экстракт, хлорид натрия, а в качестве белковой основы раствор отвара из молок рыб в соотношении 1:2 (жидкий отвар из молок рыб:дистиллированная вода) или 4,45 г сухого отвара из молок рыб на 1 л дистиллированной воды, в заданном соотношении. Изобретение позволяет повысить стабильность питательной среды, сократить сроки культивирования бактерий. 1 ил., 1 табл.

Питательная среда для культивирования бактерий, включающая белковую основу, глюкозу, дрожжевой экстракт и хлорид натрия, отличающаяся тем, в качестве белковой основы используют раствор отвара из молок рыб в соотношении 1:2 (жидкий отвар из молок рыб: дистиллированная вода) или 4,45 г сухого отвара из молок рыб на 1 л дистиллированной воды со следующим соотношением компонентов, г/л:
дрожжевой экстракт 10,0 глюкоза 1,0 хлорид натрия 5,0 раствор отвара из молок рыб до 1 л,