СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСНОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ЛИПАЗЫ И ЛИПОКСИГЕНАЗЫ Российский патент 2004 года по МПК C12N9/02 C12N9/20 C12N1/14 C12N9/02 C12R1/845 

Изобретение откосится к биотехнологии и может быть использовано в хлебопекарной промышленности.

Известен способ получения фермента липазы путем культивирования Rhizopus japonicus 1403 на среде состава (%): соевый жмых 1,7; олеиновая кислота 0,35; кукурузный экстракт 0,7; (NH₄)₂HPO₄ 0,4. Начальное значение рН среды 6,8-7,0, температура выращивания - 30°С, продолжительность выращивания - 60 ч. Активность липазы в культуральной жидкости составляет 1350 ед/см³. (Оптимизация условий биосинтеза липазы / С.А. Шеламова, Н.А. Жеребцов, В.В. Щеголев // Ферментная и спиртовая промышленность. - 1984 - №4. - С.26-28).

Известен способ получения фермента липоксигеназы путем глубинного культивирования продуцентов Aspergillus orysae 3-9-15 или Aspergillus awamori 466 на питательной среде, содержащей соевое масло, соевую муку, азотнокислый натрий, сернокислый магний, однозамещенный фосфорнокислый калий, начальное значение рН 6,0-7,0. Выращивание проводят при аэрации среды, температуре 28-32°С в течение 48 ч. Активность липоксигеназы, определенная каротиноксидазным методом, составляет 20000-50000 усл.ед. на 1 см³ культуральной жидкости (а.с. 888542 СССР, МКИ С 12 N 9/02 /Способ получения ферментного препарата липоксигеназы/ Р.Р. Токарева, Е.А. Двадцатова, М.В. Соловьева, В.Л. Яровенко, В.Л. Кретович, Е.В. Будницкая; №2949321 /28-13; заявл. 30.05.80; опубл. 15.08.83, Бюл. №30).

Ферментативные превращения жировых продуктов в технологии хлебопечения необходимы для получения высокого качества изделий.

Фермент липаза гидролизует жиры с образованием жирных кислот, моно- и диглицеридов, являющихся улучшителями - поверхностно-активными веществами, ферментативные гидролизаты жиров оказывают положительное влияние на качество хлеба. Увеличиваются его пористость, удельный объем, замедляется черствение. Сокращается длительность процесса брожения теста.

Фермент липоксигеназа играет немаловажную роль в процессах “созревания” муки после помола. Она окисляет полиненасыщенные жирные кислоты, а образующиеся гидроперекиси окисляют SH-группы в белках муки, протеолитических ферментах и их активаторе - глютатионе. Образование дополнительных дисульфидных связей в третичной и четвертичной структуре белков муки способствует созданию более прочной структуры при их набухании в процессе формирования теста; уровень протеолиза белков также снижается. Активность липоксигеназы пшеницы не очень высока, поэтому в технологии приготовления хлеба используются источники этого фермента с более высокой активностью. Это соевая мука и препараты микробного происхождения.

Липоксигеназа не окисляет этерифицированные жирные кислоты. В связи с этим использование ее в комплексе с липазой необходимо для увеличения эффекта от ее окислительного действия.

Особенно важно применение комплексного ферментного препарата липазы и липоксигеназы при использовании муки с пониженными хлебопекарными характеристиками.

Недостатками известных способов получения ферментов липазы и липоксигеназы является то, что их получают в отдельности, что экономически невыгодно, а для высокой эффективности их влияния на качество хлебобулочных изделий необходим комплекс этих ферментов.

К недостаткам способа получения ферментного препарата липоксигеназы относится использование дорогих компонентов питательной среды - соевого масла и соевой муки.

Техническом задачей изобретения является получение комплексного ферментного препарата липазы и липоксигеназы и снижение себестоимости ферментного препарата и хлебобулочных изделий с его использованием.

Техническая задача достигается тем, что в способе получения комплексного ферментного препарата липазы и липоксигеназы, включающем: подготовку питательной среды, глубинное культивирование штамма-продуцента и выделение фермента, в качестве штамма-продуцента комплексного ферментного препарата используют Rhizopus chinensis 1062, а при подготовке питательной среды в нее вносят (мас.%) соевый жмых 2,5-3,5; подсолнечное масло 0,5-0,8, дрожжевой экстракт 0,9-1,4; гидрофосфат калия 0,32-0,39; дигидрофосфат натрия 0,25-0,29; начальное значение рН среды - 7,0.

Технический результат изобретения выражается в получении комплекса двух ферментов - липазы и липоксигеназы с высокой активностью; снижении себестоимости хлебобулочных изделий при повышении их качества.

Способ реализуется следующим образом.

Штамм-продуцент Rhizopus chinensis 1062 получен из Всероссийской Коллекции Микроорганизмов РАН, где хранится под №ВКМ F-1062.

Чистую культуру Rhizopus chinensis 1062 выращивают на агаризированной среде состава (мас.%): соевая мука - 1,5; глюкоза - 1,0; подсолнечное масло - 0,5; дигидрофосфат аммония - 0,6; начальное значение рН 6,8-7,0 в течение 3-4 сут при температуре (30±1)°С.

При глубинном культивировании штамма-продуцента используют следующие компоненты (мас.%): соевый жмых 2,5-3,5; подсолнечное масло 0,5-0,8; дрожжевой экстракт 0,9-1,4; гидрофосфат калия 0,32-0,39; дигидрофосфат натрия 0,25-0,29; начальное значение рН среды - 7,0.

Питательную среду, содержащую соевый жмых, подсолнечное масло, дрожжевой экстракт, гидрофосфат калия, дигидрофосфат натрия и воду, инокулируют штаммом Rhizopus chinensis 1062 и выращивают в оптимальных для него условиях (рН 7,0; температура 30-32°С; продолжительность 72 ч) при аэрации.

После окончания выращивания штамма-продуцента Rhizopus chinensis 1062 культуральную жидкость отделяют от биомассы фильтрованием. Комплексный ферментный препарат получают из культуральной жидкости, осаждая его ацетоном с концентрацией 70 об.% при температуре минус 2 - минус 4°С.

В предлагаемом изобретении для определения активности липазы ферментного препарата использован титриметрический метод, основанный на определении количества жирных кислот, освобождающихся при гидролизе оливкового масла. За единицу липолитической активности принимают такое количество фермента, которое катализирует образование 1 мкмоля олеиновой кислоты за 1 час гидролиза. (Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов /И.М. Грачева, Ю.П. Грачев, М.Р. Мосичев и др. - М.: Легкая и пищевая пром-сть, 1978. - 271 с.).

Метод определения липоксигеназной активности основан на измерении количества образующихся конъюгированных гидроперекисей жирных кислот, регистрируемых при длине волны 234 нм на спектрофотометре и являющихся конечными продуктами окисления субстрата. Состав реакционной смеси: 0,2-0,3 см³ раствора субстрата; 0,5 см³ раствора фермента, 5 см³ 0,05 М фосфатного буфера. Длительность реакции 1-2 мин; она прекращается при разведении 1 см³ реакционной смеси в 5 см³ 60%-ного этилового спирта. Для приготовления контрольной пробы к 1 см³ реакционной смеси через 5-10 с от начала реакции добавляют этиловый спирт.

В качестве субстрата используют линолевую кислоту.

За единицу липоксигеназной активности принимают изменение экстинции на 0,001 за 1 мин, отнесенное к 1 г препарата. (Оганесян Н.А., Борисова И.Г., Соломатин Д.А., Будницкая Е.В. Изоферментный состав и активность ЛО некоторых сортов пшеницы вида Triticum aestivum //Докл. АН СССР. 1983. Т. 269. №4. С.1002-1005).

Состав питательной среды обеспечивает биосинтез двух ферментов - липазы и липоксигеназы и получение таким образом из культуральной жидкости комплексного ферментного препарата.

Способ поясняется примерами.

Пример 1. Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:

Соевый жмых 2,3

Масло подсолнечное 0,3

Дрожжевой экстракт 0,8

K₂HPO₄ 0,30

NaH₂PO₄ 0,22

Вода Остальное

Начальное значение рН доводят до 7,0.

В колбы Эрленмейера емкостью 750 см³ вносят по 100 см³ питательной среды. Среду стерилизуют 1 ч при 0,1 МПа, затем охлаждают и засевают водно-споровой суспензией штамма-продуцента Rhizopus chinensis 1062 в количестве 1% к объему среды. Водно-споровую суспензию штамма-продуцента Rhizopus chinensis 1062 готовят следующим образом: скос 4-суточной культуры в пробирках 18×180 мм заливают 10 см³ стерильной воды и смывают споры. Штамм-продуцент Rhizopus chinensis 1062 инкубируют на качалке при скорости 1,7-1,8 с^-1, температуре (30±2)°С в течение 72 ч. По окончании выращивания штамма-продуцента мицелий и взвешенные частицы среды отделяют от культуральной жидкости фильтрованием.

Ферментный препарат получают осаждением из культуральной жидкости ацетоном на холоду (минус 2 - минус 4°С) при концентрации его 70 об.% и высушивают под вакуумом.

Активность липазы составляет 260800 ед/г, липоксигеназы - 221300 ед/г.

Пример 2. Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:

Соевый жмых 2,5

Масло подсолнечное 0,5

Дрожжевой экстракт 0,9

K₂HPO₄ 0,32

NaH₂PO₄ 0,25

Вода Остальное

Начальное значение рН доводят до 7,0.

Культивирование продуцента: приготовление споровой суспензии, инокуляцию посевного материала, выращивание, отделение мицелия, осаждение ферментного препарата, определение активности липазы и липоксигеназы проводят аналогично примеру 1.

Полученный ферментный препарат имеет активность липазы - 295200 ед/г, липоксигеназы - 245600 ед/г.

Пример 3. Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:

Соевый жмых 3,5

Масло подсолнечное 0,8

Дрожжевой экстракт 1,4

K₂HPO₄ 0,37

NaH₂PO₄ 0,29

Вода Остальное

Начальное значение рН доводят до 7,0.

Культивирование продуцента: приготовление споровой суспензии, инокуляцию посевного материала, выращивание, отделение мицелия, осаждение ферментного препарата, определение активности липазы и липоксигеназы проводят аналогично примеру 1.

Полученный ферментный препарат имеет активность липазы - 325700 ед/г, липоксигеназы - 252400 ед/г.

Пример 4. Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:

Соевый жмых 3,7

Масло подсолнечное 0,9

Дрожжевой экстракт 1,5

K₂HPO₄ 0,40

NaH₂PO₄ 0,30

Вода Остальное

Начальное значение рН доводят до 7,0.

Культивирование продуцента: приготовление споровой суспензии, инокуляцию посевного материала, выращивание, отделение мицелия, осаждение ферментного препарата, определение активности липазы и липоксигеназы проводят аналогично примеру 1.

Полученный ферментный препарат имеет активность липазы - 280300 ед/г, липоксигеназы - 232700 ед/г.

Как видно из примеров, при культивировании Rhizopus chinensis 1062 наибольший эффект дает следующий состав питательной среды, мас.%: соевый жмых 2,5-3,5; масло подсолнечное 0,5-0,8; дрожжевой экстракт 0,9-1,4; K₂HPO₄ 0,32-0,39; NaH₂PO₄ 0,25-0,29 (примеры 2 и 3). По сравнению с известными способами появляется возможность получения ферментного препарата с наибольшей активностью липазы и липоксигеназы.

Таким образом, предложенный способ позволяет получить комплексный ферментный препарат липазы и липоксигеназы и снизить затраты на производство этих двух ферментов, используемых в хлебопекарной промышленности и позволяющих одновременно снизить себестоимость хлебобулочных изделий при их использовании, повысить их качество, сократить длительность процесса приготовления теста и замедлить процесс черствения.

В хлебопечении более эффективно использовать для улучшения качества хлебобулочных изделий не каждый фермент по отдельности, а одновременно оба. Комплексный ферментный препарат вносится на стадии приготовления опары. Липаза Rhizopus chinensis 1062 гидролизует масла до жирных кислот, моно- и диглицеридов, которые улучшают физические свойства теста и качество изделий. Сокращается время брожения теста, замедляется черствение изделий. Липоксигеназа Rhizopus chinensis 1062 окисляет образующиеся при гидролизе жиров и масел полиненасыщенные жирные кислоты до гидроперекисей. Последние дают дополнительный положительный эффект в технологии приготовления хлебобулочных изделий.

Это подтверждается примером 5.

Пример 5. Готовят тесто для батончика к чаю опарным способом. Муку использовали с пониженными хлебопекарными свойствами - со слабой клейковиной. Рецептура и режим приготовления опары приведены в табл. 1.

Рецептура приготовления теста для контрольных и опытных образцов не отличается - вносится мука до 100 кг, вода - по расчету, соль - 1,5 кг, сахар - 5 кг и маргарин - 8 кг. Продолжительность брожения теста в контрольном случае составляет 160-180 мин, а в опытном - 110-120 мин; кислотность конечная одинаковая - 3,4-3,6 град.

За счет частичного гидролиза жира липазой комплексного ферментного препарата интенсифицируется процесс брожения теста (уменьшается угнетающее действие жира на дрожжи).

Показатели качества батончика к чаю представлены в табл.2.

Опытные образцы изделий имеют лучшую пористость, объем, формоустойчивость даже при использовании муки с пониженными хлебопекарными свойствами.

Таким образом, сущность происходящих процессов сводится к интенсификации окислительного воздействия на белково-протеиназный комплекс муки. Коллоидная система теста получается более упругой, отличающейся высокими механическими свойствами. В результате тесто более стойко сохраняет оптимум своих физических свойств, характеризуется лучшей формоустойчивостью и значительной газоудерживающей способностью. Это особенно важно при переработке муки с пониженными хлебопекарными качествами.

Изделия с добавлением комплексного ферментного препарата липазы и липоксигеназы имеют более эластичный мякиш и дольше сохраняют свежесть, так как общая деформация мякиша, определенная на пенетрометре, у них выше по сравнению с контрольными образцами - у опытных образцов значения деформации снижаются медленнее при хранении (табл.3).

Предложенный способ позволяет получить комплексный ферментный препарат, состоящий из липазы и липоксигеназы. Это не только снижает стоимость производства препарата по сравнению с получением их в отдельности, но и снижает стоимость хлебобулочных изделий, так как дозировка комплексного препарата снижается минимум в 1,5 раза и составляет 0,02-0,03% к муке. Дозировка отдельно липазы или липоксигеназы дается 0,02-0,05%. Использование такого препарата в хлебопечении дает возможность сократить длительность процесса брожения теста, улучшить качество готовых изделий, замедлить их черствение. Особенно важно применение такого препарата при переработке муки со слабой клейковиной или недостаточным ее количеством в муке.

Аналоги изобретения не обнаружены.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в хлебопекарной промышленности. Способ получения ферментного препарата предусматривает глубинное культивирование штамма – продуцента Rhizopus chinensis BKMF- 1062 на питательной среде следующего состава: соевый жмых, подсолнечное масло, дрожжевой экстракт, дигидрофосфат натрия, гидрофосфат калия и дистиллированная вода с последующим выделением ферментного препарата. Изобретение позволяет синтезировать ферментный препарат с высокой липазной и липоксигеназной активностью, снизить стоимость производства и хлебобулочных изделий, сократить длительность процесса брожения теста, улучшить качество теста и готовых изделий, замедлить их черствение. 3 табл.

Способ получения комплексного ферментного препарата липазы и липоксигеназы, предусматривающий глубинное культивирование штамма–продуцента Rhizopus chinensis ВКМ F-1062 на питательной среде следующего состава, мас.%:

соевый жмых 2,5-3,5

подсолнечное масло 0,5-0,8

дрожжевой экстракт 0,9-1,4

дигидрофосфат натрия 0,25-0,29

гидрофосфат калия 0,32-0,39

вода дистиллированная остальное

при начальном значении рН 7,0 с последующим его выделением.