Способ получения ферментного препарата липоксигеназы Советский патент 1983 года по МПК C12N9/02 

1 Изобретение относится к микробио логической промышленности , а именн к способам получения ферментного препарата липоксигеназы, фермента, используемого в хлебопекарном проиэ водстве. Известны способы получения ферме тного препарата липоксигеназы из ра личных продуктов растительного происхождения (сои, гороха, картофеля) 1. Недостатком этих способов является низкая активность полученного препарата, дефицит некоторых видов оастительного сырья, в частности сои, необходимость создания специальных условий хранения сырья для сохранений активности фермента. Кро ме того, использование липоксигенавыделенной из растительного сырья, экономически нецелесообразно, так как получение такого фермента очень дорого. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ получе ния ферментного препарата липоксигеназы путем глубинного культивиров ния ее продуцентов - плесневых гриб на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода осевую муку, минеральные соли азота,фосфо ра , калия и магния, с последующим выделением ферментного препарата из культуральной жидкости, в котором в качестве продуцентов липоксигеназы используют микромицеты из родов Fusarium, Aspergillus, Rhozopus и Реп i ci 1 1 i urn 2 . Недостатком применения указанных продуцентов липоксигеназы является токсичность некоторых продуцентов, а также очень низкая активность фер мента, что не позволило осуществить его использование в промышленности для производства хлеба. Целью изобретения является повышение активности липоксигеназы. Поставленная цель достигается тем, что в способе получения фермен ного препарата липоксигеназы путем глубинного культивирования ее проду центов - плесневых грибов из рода Aspergillus на питательной среде, содержащей в качестве источника yi- лерода соевую муку, минеральные соли азота, фосфора, калия и магния, с последующим выделением ферментного препарата изкультуральной жидкости, культивирование продуцентов осуществляют в присутствии индикатора липоксигеназы - соевого масла в количестве 2-5 мл на 100 мл культуральной жидкости. При этом культивирование продуцентов липоксигеназы осуществляют на питательной среде, содержащей индуктор - соевое масло, муку в качестве источника углерода и минеральные соли азотнокислый натрий, сернокислый магний, однозамещенный фосфорнокислый калий, взятые соответственно в количествах вес.%: Соевое масло 1-5 Соевая мука 8-12 Азотнокислый натрий0,05-0,3 Сернокислый магний0,005-0,015 Однозамещенный фосфорнокислый калий0,05-0,3 ВодаОстальное Способ отличается тем, что в качестве продуцентов используют штаммы Aspergillus oryzae 3-9-15 или Aspergillus awamory 466, Штамм Aspergillus oryzae 3-9-15. Получен путем одноступенчатого воздействия ультрафиолетовых лучей на штамм Aspergillus oryzae. Штамм хранится в коллекции ВНИИгенетика, коллекционный № ЦМПМ F 137. I Токсическими и патогенными свойствами штамм не обладает. Морфолого-физиологическая характеристика штамма. Морфолого-культуральные свойства. Гигантская колония, выращенная на сусле-агаре, на 7 сутки роста имеет диаметр 20-25 мм. форма колонии круглая, размер 20-25 мм. Цвет колонии темно-зеленый, серозеленый . Край колонии ровный, плотный. Центр колонии сильно складчатый, плотный. Поверхность бархатистая, резко складчатая. Пигмент отсутствует. Конидии образуются на 7-е сутки, серо-зеленые до темно-зеленых, форма конидий овальная и круглая, но встремаются грушевидные и эллипсовидные. Зона гидролиза крахмала есть. Физиологические свойства. Потребляет: крахмал, глюкозу, ма тозу, сахарозу. Ассимилируют нитраты. Отношение к кислороду: аэроб, . максимум роста при 28-30 С, рН 6-. Картофель: на ломтиках картофеля образует белый мицелий. Штамм Asperg Mlus awamory -Абб Получен путем рассева на сусло-агаре исходной культуры. Штамм хранитс в коллекции ВНИИгёнетика, коллекцио ный W ЦМПМ F 138, токсическими и патогенными свойствами не обладает. Штамм Asperg Mlus awanrory - Ц66 имеет следующую морфолого-физиологи ческую характеристику. Морфолого-культуральные свойства Гигантская колония на сусло-агар Форма колонии - круглая на 12 су ки роста диаметр колонии мм. Цвет колоний белый, желтоватый. Край колоний неровный. Поверхность бархатистая, плоская Пигмент слабо-желтый. Конидии образуются .на 7-е сутки роста, темно-коричневые. Зона гидролиза крахмала есть. физиологические свойства. Потребляет: крахмал, глюкозу, сахарозу, мальтозу. Ассимилирует нитраты. Отношение к кислороду: аэроб, мак симум роста 37-+0®С, на сусло агаре. Способ осуществляют следующим об разом. Выращивание продуцентов на данной среде ведут, глубинным методом при аэрации среды и температуре 28-30 0 в течение двух суток. В качестве посевного материала применяют выращенную на среде того же состава односуточную культуру, высеянную с сусло-агара, или же споровую суспензию, полученную смывом с косого сусло-агара. Односуточный посевной материал вносят в количестве 3-5% от объема среды, а споровую суспензию в количестве 1 мл в ферментационную среду того же состава. Культивиррвание ведут при умеренной аэрации и перемешивании среды при 28-30°С в течение 2 суток Фермент накапливается в мицелии и в культуральной жидкости максимально к «8 ч. Аактивность фермента определяют каротиноксидазным методом, Активность липоксигеназы в среднем составляет 20000-55000 усл.ед, на 1 мл культуральной жидкости. Внеклеточный фермент выделяют из культуральной жидкости ( после удаления мицелия и неиспользованных остатков осевой муки / этиловым спиртом на холоду, в соотношении вода:спирт 1:5. Фермент действует в широком диапазоне рН среды - от до 8. Оптимум действия при рН 6-7. П р и м е р 1. Для получения липоксигеназы используют культуру плесневого гриба Asperg IIus oryzae 3-9-15 Продуцент липоксигеназы выращивают на питательной среде, содержащей 100 мл водопроводной воды, 10 г соевой муки 0,1 г NaNOj, 0,01 г MgS047H20, 0,1 г- KHgPO и 2,3 мл соевого масла. В качестве посевного материала используется односуточная глубинная культура, выращенная при 28-30 0, Для инокуляции питательной среды используют 3-5 посевного материала. Продуцент липоксигеназы культив 1руют при 28-30с в течение 48 ч. Активность фермента к концу роста достигает 20000 усл.ед. на 1 мл культуральной жидкости, 1 р и м е р 2. Глубинную культуру Asperg illus awamory выращивают на питательной среде, состоящей из 12 г соевой муки, 0,2 г NaNOj, 0,01 г MgSO -7Н20, 0,015 г КН2Р04 и 5 мл соевого масла. Максимум активности фермента 50000 усл.ед. синтезируется к +8 ч роста, при 30-32 С и при аэрации питательной среды. П р и м е р 3. Использования липоксигеназы при приготовлении теста из пшеничной муки. Липоксигеназу выделяют из культуры Aspergillus oryzae 3-9-15; в процессе замешивания теста вводят в количестве 130000 усл.ед. окислилитёльно-восстановительног.о фермента липоксигеназы. При этом продолжительность брожения теста сокращается на 30 мин, продолжительность расстойки - на 10 мин. Предложенный способ позволяет увеличить объем хлеба до 15-20%, пористость до -5, Хлеб, приготовленный с применением фермента липоксигеназы микробного происхождения, 55по сравнению с контрольным хлебом без препарата отличается более нежным и осветленным мякишем, свежесть егр сохраняется более длительное вреJ8885 426

мя, т.е. до ч (до 2 ч в кон-на замена менее активного и более дотроле).рогого фермента растительного происхо

Таким образом, впервые в мире раз-дения. Ожидаемый экономический эфработан способ получения высокоактив-факт от применения иаобретения сосной липоксигеназы микробного происхож-5тавляет 180 руб. на 100 т перерабадения, в результате чего ,стала возмож-тываемоймуки.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ЛИПОКСИГЕНАЗЫ путем глубинного культивирования ее продуцентов - плесневых грибов из рода Aspergillus на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода соевую муку, минеральные соли азота, фосфора, калия и магния, с последующим выделением ферментного препарата из культуральной жидкости, отличающийся тем, .что, с целью повышения активности липоксигеназы, культивирование продуцентов осуществляют в присутствии индуктора липоксигеназы - соевого масла в количестве 2-5 мл на 100 мл культуральной жидкости. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культивирование продуцентов липоксигеназы осуществляют на питательной среде, со-. держащей индуктор - соевое масло, соевую муку в качестве источника углерода и минеральные соли - азотнокислый натрий, сернокислый магний, однозамещенный фосфорнокислый калий, (Л взятые соответственно в количествах, вес.: Соевое масло 1-5 8-12 Соевая мука Азотнокислый 00 0,05-0,3 натрий 00 Сернокислый 00 Oi магний 0,005-0,015 Однозамещенный 4 фосфорнокислый 0,05-0,3 to калий Остальное Вода 3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что из рода Aspergillus используют штаммы Aspergillus oryzae 3-9-15 или Aspergtllus awarory - 66,