Гемопротекторное средство Российский патент 2020 года по МПК A61K45/00 A61P35/00 A61P7/00 A61K31/357 A61K33/242 

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, гематологии и онкологии.

Высокая частота встречаемости миелосупрессивных состояний, развивающихся в результате химиотерапии опухолевых заболеваний [1], является основанием необходимости применения гемостимулирующих (используются после химиотерапии) и гемопротекторных (используются перед химиотерапией) средств в медицинской практике.

Известны гемопротекторные средства [2-5].

Недостатком данных средств является зачастую их низкая эффективность [5, 6].

Задачей, решаемой настоящим изобретением, является расширение арсенала высокоэффективных гемопротекторных средств.

Поставленная задача достигается применением ингибиторов транскрипционного фактора NF-кВ (ядерный фактор «каппа-би», nuclear factor kappaB, nuclear factor κ-light-chain-enhancer of activated В cells) в качестве гемопротекторного средства.

Новым в предлагаемом изобретении является использование в качестве гемопротекторного средства ингибиторов NF-кB.

Химиотерапия представляет собой один из основных методов лечения онкологических заболеваний. Однако применение противоопухолевых средств зачастую приводит к развитию тяжелых побочных эффектов [1]. Мишенью цитостатических агентов являются, в первую очередь, митотически активные клеточные элементы. К данной категории, помимо опухолевых, относятся клетки здоровых тканей с высокой способностью к физиологическому клеточному обновлению, в том числе костный мозг [6].

Одним из путей повышения безопасности химиотерапии является профилактика повреждающего действия цитостатических препаратов на здоровые ткани и органы [3]. Для предупреждения развития миелосупрессивных состояний используют гемопротекторы, вводимые в организм (в отличие от гемостимуляторов) перед проведением химиотерапии либо в промежутках между ее курсами (например, дикарбамин [1].

Согласно современным представлениям, функционирование клеток осуществляется, в том числе посредством системы внутриклеточной сигнальной трансдукции. В связи с этим перспективной выглядит возможность разработки гемопротекторов в рамках «Стратегии фармакологической регуляции внутриклеточной сигнальной трансдукции в регенераторно-компетентных клетках» [7, 8], предполагающей использование в качестве мишеней воздействия отдельных звеньев внутриклеточной сигнальной трансдукции, ответственных за функционирование прогениторных клеток и элементов микроокружения тканей. Принципиальная возможность создания подобных средств для гематологии подтверждена экспериментально при использовании активаторов РКА в качестве средств гемопротекции [9]. Однако существующие на сегодняшний день активаторы РКА имеют ряд недостатков, не позволяющих их применять в клинике [10].

В связи с этим целесообразным является поиск иных мишеней среди элементов внутриклеточной сигнальной трансдукции для таргетных гемопротекторов и гемостимуляторов.

В настоящее время известны лишь общие представления о том, что процессы пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток регулируются cAMP-, PI3K-и МАР-опосредованными сигнальными путями [7, 8]. Вместе с тем известно, что важную роль в регуляции функций различных клеточных элементов играет ядерный фактор транскрипции - NF-кВ (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated В cells). Данная сигнальная молекула участвует в экспрессии более чем 400 генов, вовлеченных, в том числе в управление процессами клеточного цикла (пролиферация, дифференцировка), апоптоза, воспаления и иммунного ответа [11, 12]. Причем, считается, что NF-кВ обладает стимулирующими эффектами в отношении пролиферации и апоптоза клеток. Данные обстоятельства послужили основой разработки иммуносупрессирующих средств - ингибиторов NF-кВ (в том числе ауротиомалата) [11, 12], реализующих свои эффекты за счет антимитотической и апоптозиндуцирующей активностей [12]. Более того, известна способность ингибиторов NF-кВ нарушать процессы кроветворения и вызывать падение числа зрелых клеточных элементов в периферической крови за счет их антипролиферативного действия в отношении кроветворных клеток-предшественников костного мозга [13]. Данные эффекты были выявлены при введении ингибиторов NF-кВ вне курсов химиотерапии. В то же время известно, что участие и роль отдельных внутриклеточных сигнальных молекул в регуляции функций клеток во многом определяются особенностями воздействующих на них внешних факторов [14].

Вместе с тем возможность стимуляции процессов кроветворения с помощью ингибиторов NF-кВ, в том числе при цитостатических воздействиях, не известна. Эксперимент показал непредсказуемые результаты.

Факт применения ингибиторов NF-кВ с достижением нового технического результата, заключающегося в гемопротекции, для специалиста является неочевидным.

Новые свойства не вытекают явным образом из уровня техники в данной области и не обнаружены в патентной и научно-технической литературе.

Предлагаемое изобретение может быть использовано в медицине.

Исходя из вышеизложенного следует считать, что заявляемое техническое решение соответствует критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Эксперименты были проведены на 60 мышах линии С57В 1/6. Животные получены из отдела экспериментальных биологических моделей НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ.

Исследования проводили в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP), Приказом 199н от 15.08.2016 «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики», ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики» (2015), Федеральным Законом от 12 апреля 2010 г. №61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств», «Методическими рекомендациями по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ» Руководства по проведению доклинических исследований новых лекарственных средств (2013) [15].

Пример 1

Эффективность гемопротекции оценивали на модели цитостатической миелосупрессии.

Цитостатическую миелосупрессию моделировали путем однократного внутрибрюшинного введения раствора 5-фторурацила (5-ФУ) (Фторурацил-ЛЭНС, «ЛЭНС-ФАРМ», Россия) в максимально переносимой дозе (МПД) - 228 мг/кг.

Мыши опытных групп однократно за 2 дня до введения цитостатика получали внутрибрюшинно ингибиторы NF-кВ: ауротиомалат («Calbiochem», США) в дозе 2 мг/кг, и оридонин («Calbiochem», США) в дозе 40 мкг/кг. Интактные животные получали растворитель в эквивалентном объеме (0,2 мл). Указанные дозы ингибиторов были эквимолярными и определены в качестве наиболее эффективных на основании данных предварительных экспериментов. Кроме того, в качестве контроля использовали группу мышей, получавших ауротиомалат однократно внутрибрюшинно в дозе 2 мг/кг без 5-ФУ.

На 4, 6, 8 и 12 сутки после введения цитостатика животных умерщвляли путем ингаляции СО₂. У опытных и контрольных мышей стандартными методами определяли показатели периферической крови и костномозгового кроветворения. С помощью культуральных методов оценивали содержание коммитированных клеток-предшественников эритро- (КОЕ-Э) и гранулоцитопоэза (КОЕ-ГМ) в костном мозге [15].

Статистическую обработку полученных данных проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. В случаях отклонения распределения вариант в выборках от нормального для оценки достоверности различий применяли непараметрический критерий Уилкоксона-Манна-Уитни.

Введение 5-ФУ проводило к закономерному [15] развитию миелосупрессии. Отмечалось падение содержания незрелых (4, 6, 8-е сут), зрелых (4-12-е сут) нейтрофильных гранулоцитов, эритроидных клеток (4-12-е сут), а также других морфологически распознаваемых в костном мозге (табл. 1).

Отражением указанных изменений костномозгового кроветворения явилось снижение числа ретикулоцитов, нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов в периферической крови практически на протяжении всего эксперимента (табл. 2).

В основе развития миелосупрессии лежало повреждающее действие цитостатического агента на кроветворные предшественники костного мозга [6, 15]. Имело место резкое падение числа КОЕ-Э и КОЕ-ГМ (табл. 3) При этом в дальнейшем отмечалась активация компенсаторной реакции [6] со стороны пула прекурсоров гемопоэза. Отмечалось увеличение числа КОЕ-Э и КОЕ-ГМ на 8-е сут опыта (табл. 3).

Профилактическое введение обоих ингибиторов NF-кВ существенно корригировало изменения гемопоэза, вызываемые цитостатиком. Наблюдалось увеличение клеточности костного мозга. Имело место значительное возрастание содержания незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов, достигающее максимальных значений при применении ауротиомалата на 4 сут опыта: до 983,3% и 415,4% от цитостатического контроля соответственно. Кроме того, в костном мозге мышей, получавших как оридонин, так и ауротиомалат, наблюдалось увеличение числа эритроидных клеток до 1120% и 1280% от цитостатического контроля на 8 сутки опыта соответственно (табл. 1).

Коррекция нарушений гемопоэза приводило к закономерным изменениям клеточности периферической крови. При профилактическом введении оридонина и ауротиомалата на 8 сут опыта имело место повышение числа циркулирующих сегментоядерных нейтрофилов (до 1200% и 1400% от цитостатического контроля соответственно) и ретикулоцитов (до 191,8% и 235,7%) от цитостатического контроля соответственно). Кроме того, регистрировалось увеличение количества моноцитов в периферической крови (табл. 2).

В то же время введение ауротиомалата интактным животным приводило к подавлению всех ростков кроветворения с 4-х по 8-е сут эксперимента. Восстановление показателей костномозгового кроветворения отмечалось лишь к концу периода наблюдения (на 12 сут) (табл. 1). Отражением снижения интенсивности процессов костномозгового кроветворения интактных мышей после применения ауротиомалата явилось развитие нейропении (табл. 2), что полностью соответствовало сведениям литературы [13].

Исследование механизмов гемопротекторного действия ингибиторов NF-кB выявило зависимость формирования картины крови и костного мозга от состояния пула костномозговых родоначальных клеток. Профилактическое введение исследуемых веществ увеличивало содержание КОЕ-Э и КОЕ-ГМ в гемопоэтической ткани мышей, подвергшихся цитостатическому воздействию: на 4, 6-е и 4, 12-е сут опыта при использовании оридонина и ауротиомалата соответственно (табл. 3). Введение ауротиомалата интактным животным, напротив, уменьшало содержание кроветворных предшественников в костном мозге (табл. 3).

Полученные результаты свидетельствуют о наличии выраженных гемопротекторных свойств [15] у ингибиторов NF-кВ в условиях цитостатического воздействия. Механизмом действия данных модификаторов внутриклеточной сигнальной трансдукции являлось повышение функциональной активности родоначальных гемопоэтических клеток.

В целом, проведенные исследования свидетельствуют о высокой эффективности применения ингибиторов NF-кВ в качестве гемопротекторного средства при цитостатических воздействиях.

Цитируемая литература:

1) Assessment of erythroid and granulocytic hematopoietic lineages in patients with non-small-cell lung carcinoma / T.Y. Polyakova [et al.] // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2017. T. 163. №4. C. 469-474.

2) Моисеенко, B.M. Волков O.H. Симптоматическая терапия больных распространенным раком ободочной кишки / В.М. Моисеенко, О.Н. Волков // Практическая онкология. 2000. №1. С. 38-42.

3) Птушкин, В.В. Профилактика осложнений химиотерапии / В.В. Птушкин // Русский медицинский журнал. 2004. Том 12. №11.

4) Симптоматическое лечение осложнений современной химиотерапии и текущего опухолевого процесса. Краткий обзор работ, посвященных теме преодоления неспецифических расстройств // Научно-информационный медицинский журнал. Весна. 2004. №1.

5) Стенина, М.Б. Поддерживающая терапия при проведении современной химиотерапии (гемоцитокины и антиэметики) / М.Б. Стенина // Русский медицинский журнал. 1999. №10. С. 455-457.

6) Механизмы протективного действия «дикарбамина» в отношении системы крови при цитостатическом воздействии / В.Е. Небольсин [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2010. Т. 150. №9. С. 312-316.

7) Participation of Pi3k, Марк Erk1/2 and P38 in the realization of growth potential of mesenchymal precursor cells under in vitro conditions / G.N. Zyuzkov [et al.] // Bulletin Of Experimental Biology And Medicine. 2014. T. 156. №4. C. 556-559.

8) PI3K, МАРК EPK1/2 and P38 are involved in the realization of growth potential of mesenchymal progenitor cells under the infl uence of basic fibroblast growth factor / G.N. Zyuzkov [et al.] // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2014. T. 157. №4. C. 436-439.

9) Патент (RU) на изобретение №2696586 «Гемопротекторное средство» (опубл. 05.08.2019, Бюл. №22). Авторы: Зюзьков Т.Н., Удут Е.В., Мирошниченко Л.А., Полякова Т.Ю., Ставрова А.А., Симанина Е.В., Жданов В.В.

10) Propper, D.J. Phase I Study of the Novel Cyclic AMP (cAMP) Analogue 8-Chloro-cAMP in Patients with Cancer: Toxicity, Hormonal, and Immunological Effects / Propper D.J., Saunders M.P., Salisbury A.J. e.a. // Clin. Cancer Res. 1999. Vol. 5. P. 1682-1689.

11) Герштейн, Е.С. Ключевые компоненты NF-кВ-сигнального пути в опухолях больных раком молочной железы / Е.С. Герштейн, A.M. Щербаков, Е.В. Ошкина, Н.Е. Кушлинский, Н.А. Огнерубов // Вестник ТГУ. 2013. Т. 18, вып. 6. С. 3292-97.

12) Клаан, Н.К. Ядерный фактор каппа В (NF-кВ) в качестве мишени для действия природных противоопухолевых соединений / Н.К. Клаан, Т.А. Пронина, Л.П. Акиньшина, В.В. Решетникова // Российский биотерапевтический журнал. 2014. №1, Т. 13. С. 3-8.

13) Howell, A. Depression of bone marrow colony formation in gold-induced neutropenia / Howell A., Gumpel J.M., Watts R.W. // Br Med J. 1975. №1(5955). C. 432-34.

14) Зюзьков, Г.Н. Участие цАМФ/РКА-опосредованных сигнальных путей в реализации функций регенераторно-компетентных клеток нервной ткани при этанолиндуцированной нейродегенерации / Зюзьков Г.Н., Мирошниченко Л.А., Полякова Т.Ю., Ставрова Л.А., Ошанина Е.В., Агафонов В.И., Жданов В.В. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2019. Т. 167, №6. С. 677-681.

15) Методические рекомендации по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ Руководство по проведению доклинических исследований новых лекарственных средств. Часть первая Под ред. А.Н. Миронова / A.M. Дыгай [и др.]. М.: Гриф и К, 2013. С. 759-766.

Изобретение относится к области медицины и фармацевтики и может быть использовано для стимуляции процессов кроветворения при химиотерапии опухолевых заболеваний. Для этого в качестве гемопротекторного средства при цитостатических воздействиях используют ингибиторы NF-кВ. Изобретение обеспечивает эффективное гемопротекторное действие при цитостатических воздействиях за счет стимуляции функций гемопоэтических клеток-предшественников в постцитостатическом периоде. 3 табл., 1 пр.

Применение ингибиторов NF-кВ в качестве гемопротекторного средства при цитостатических воздействиях.