Гемостимулирующее средство Российский патент 2018 года по МПК A61K45/00 A61P7/00 A61K31/416 A61K31/4995 A61K39/00 

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии и гематологии.

Высокая частота встречаемости миелосупрессивных состояний и их влияние на продолжительность и качество жизни пациентов [1, 2] являются основанием широкого применения гемостимулирующих средств в медицинской практике.

Известно большое количество гемостимулирующих средств [1, 2].

Недостатком данных средств является зачастую их неэффективность и высокая частота побочных эффектов [3, 4].

Задачей, решаемой настоящим изобретением, является расширение арсенала высокоэффективных гемостимулирующих средств.

Поставленная задача достигается применением ингибитора JNK (c-Jun N-terminal kinase) в качестве гемостимулирующего средства.

Новым в предлагаемом изобретении является использование в качестве гемостимулирующего средства ингибитора JNK.

На сегодняшний день наиболее эффективными гемостимуляторами являются препараты на основе гемопоэтических факторов [1-5]. Указанные средства широко применяются при целом ряде состояний и заболеваний, сопровождающихся депрессией кроветворения: при химио- и радиотерапии опухолей, в том числе лейкозов, миелодиспластическом синдроме, СПИДе; а также при трансплантации костного мозга и мобилизации стволовых кроветворных клеток в периферическую кровь у донора для их трансплантации. Вместе с тем гемостимуляторы на основе цитокинов не соответствуют в полной мере современным требованиям фармакологии, в том числе - по селективности воздействия и перспективным критериям лекарственной безопасности. Во всех случаях, в той или иной мере цитокины (Г-КСФ, ГМ-КСФ, тромбопоэтин, интерлейкины и др.) являются плейотропными и полифункциональными регуляторами физиологических функций, что предопределяет их недостаточную селективность и наличие высокого риска развития целого ряда тяжелых осложнений и побочных эффектов [2, 3]. Кроме того, белковая природа данных веществ делает возможным исключительно парентеральный - низко комплаентный, путь их введения [4]. При этом зачастую сложно контролировать и поддерживать необходимую степень и длительность фармакологического воздействия (особенно для пегилированных форм [6]). Существуют также производственные и экономические недостатки создания подобных средств. Применение геномных технологий при производстве рекомбинантных форм гемопоэтинов делает указанные препараты весьма дорогостоящими [5]. Данные обстоятельства свидетельствуют об отсутствии дальнейшей перспективности разработки гемостимуляторов на основе ростовых факторов (данная стратегия исчерпала свое развитие). В связи с этим представляется актуальным поиск принципиально новых молекулярных мишеней фармакологического воздействия среди сложной системы регуляции кроветворения, способных обеспечить эффективное таргетное терапевтическое воздействие при миелосупрессивных состояниях.

Согласно современным представлениям характер развития компенсаторных процессов при заболеваниях системы крови и ятрогенных миелосупрессивных состояниях определяется как состоянием кроветворных клеток, так и функциональной способностью различных элементов регуляторных систем [5]. При этом ключевая роль, во многом, принадлежит отдельным популяциям клеток гемопоэзиндуцирующего микроокружения (ГИМ). Данные элементы путем межклеточной кооперации и продукции гуморальных факторов (цитокинов, ростовых факторов) определяют пролиферативно-дифференцировочный статус кроветворных клеток-предшественников и, в конечном итоге - клеточность костного мозга и периферической крови. Реализация описанных эффектов, в свою очередь, происходит посредством функционирования системы внутриклеточной сигнальной трансдукции. В связи с этим перспективной выглядит разработка гемоститмуляторов в рамках «Стратегии фармакологической регуляции внутриклеточной сигнальной трансдукции в регенераторно-компетентных клетках» [7-9], предполагающей использование в качестве мишеней воздействия отдельных звеньев внутриклеточной сигнальной трансдукции, вовлеченных в процесс реализации ростового потенциала прогениторных клеток и элементов микроокружения. Тем не менее в настоящее время известны лишь общие представления о том, что процессы пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток регулируются сАМР-, NF-кВ-, PI3K- и МАР-опосредованными сигнальными путями [7, 9].

Возможность влияния ингибиторов (и/или модификаторов активности) внутриклеточной сигнальной молекулы c-Jun N-terminal kinase (JNK) на процессы кроветворения, в том числе стимуляция гемопоэза при миелосупрессии под их воздействием, до сих пор не известна. Эксперимент показал непредсказуемые результаты.

Факт применения ингибитора JNK с достижением нового технического результата, заключающегося в стимуляции гемопоэза, для специалиста является не очевидным.

Новые свойства не вытекают явным образом из уровня техники в данной области и не обнаружены в патентной и научно-технической литературе.

Предлагаемое изобретение может быть использовано в медицине.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Эксперименты были проведены на 86 мышах линии СВА. Животные получены из отдела экспериментальных биологических моделей НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ.

Исследования проводили в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP), Приказом МЗСР РФ №708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики», Федеральным Законом от 12 апреля 2010 г. №61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств», «Методическими рекомендациями по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ» Руководства по проведению доклинических исследований новых лекарственных средств (2013).

Пример 1

Эффективность стимуляции гемопоэза определялась на модели цитостатической миелосупрессии в соответствии с методическими указаниями по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ [5].

Цитостатическую миелосупрессию моделировали путем однократного внутрибрюшинного введения раствора 5-фторурацила (5-ФУ) в максимально переносимой дозы (МПД) (114 мг/кг). Начиная со второго дня после введения цитостатика мыши опытных групп получали внутрибрюшинно 30 мг/кг ингибитора JNK («IQ-1S», Montana State University, Bozeman, Montana, USA), или ингибитор JNK (JNK ingibitor, «SP600125», InvivoGen, USA) подкожно в дозе 11 мг/кг (в обоих случаях 1 раз в сутки в течение 5 дней). Указанные дозы ингибиторов были определены в предварительных эксперимнтах в качестве наиболее эффективных. Контрольным животным в аналогичных условиях вводили растворитель в эквивалентном объеме (0,2 мл).

На 4, 8, 12 и 14 сут после введения цитостатика животных умерщвляли путем ингаляции CO². У опытных и контрольных мышей стандартными методами определяли показатели периферической крови и костномозгового кроветворения. С помощью культуральных методов оценивали содержание коммитированных клеток-предшественников эритро- (КОЕ-Э) и гранулоцитопоэза (КОЕ-ГМ) в костном мозге [5].

Статистическую обработку полученных данных проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. В случаях отклонения распределения вариант в выборках от нормального для оценки достоверности различий применяли непараметрический критерий Уилкоксона-Манна-Уитни.

В ходе эксперимента введение 5-ФУ проводило к закономерному [5] развитию миелосупрессии. Отмечалось падение содержания незрелых нейтрофильных гранулоцитов, моноцитов и эритроидных клеток (4 и 8 сут), зрелых нейтрофильных гранулоцитов (4, 8 и 12 сут) и лимфоидных клеток (4, 8 и 14 сут) в гемопоэтической ткани (табл. 1).

Отражением указанных изменений костномозгового кроветворения явилось падение числа сегментоядерных нейтрофилов, моноцитов и ретикулоцитов в периферической крови на 4 и 8 сут и увеличение данных параметров на 14 сут опыта (табл. 2). В основе описанных феноменов лежало снижение содержания кроветворных предшественников в костном мозге и развитие выраженной компенсаторной реакции [3, 5] со стороны пула прекурсоров эритро-поэза уже на 4 сут и гранулоцитопоэза - к концу эксперимента (12 сут) (табл. 3).

Введение ингибиторов JNK «IQ-1S» и JNK «SP600125» приводило к значительному повышению интенсивности процессов регенерации кроветворной ткани. Наблюдалось увеличение содержания зрелых нейтрофильных гранулоцитов и эритроидных клеток в костном мозге: до 238,2% и 160,4% (для ингибитора JNK «IQ-1S») и 250,2% и 169,2% (для ингибитора JNK «SP600125») от цитостатического контроля на 12 сут опыта соответственно (табл. 1). В периферической крови имело место повышение числа сегментоядерных нейтрофилов (до 155,1% и 151,8% (для ингибитора JNK «IQ-1S») и 157,7% и 149,3% (для ингибитора JNK «SP600125» на 12 и 14 сут соответственно) и ретикулоцитов (до 155,1% и % на 14 сут и до 166,8% и 168,9% для ингибитора JNK «SP600125» и ингибитора JNK «IQ-1S» на 14 сут соответственно) (табл. 2).

Исследование механизмов гемостимулирующего действия ингибиторов JNK выявило зависимость формирования картины крови и костного мозга от состояния пула костномозговых родоначальных клеток. Введение растворов исследуемых фармакологических веществ сопровождалось резким увеличением содержания КОЕ-Э и КОЕ-ГМ в гемопоэтической ткани на 8-е сут опыта (до 232,5% и 214,6% от цитостатического контроля соответственно при введении ингибитора JNK «IQ-1S» и до 239,0% и 212,8% при введении ингибитора JNK «SP600125») (табл. 3). При этом компенсаторная реакция со стороны гранулоцитарных предшественников сохранялась также на 14 сутки эксперимента.

Полученные результаты свидетельствуют о выраженных гемопоэзстимулирующих свойствах ингибитора JNK [5]. При этом механизмом ускорения регенерации кроветворной ткани является активация родоначальных гемопоэтических клеток.

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о высокой эффективности применения ингибитора JNK в качестве средства, стимулирующего гемопоэз при гипопластических состояниях кроветворения. Использование данного средства позволит расширить номенклатуру гемостимулирующих препаратов.

Примечание: в таблицах 1-3 * - статистически значимые отличия от интактной группы; # - статистически значимые различия между группами 1 и 2,1 и 3 (p≤0,05)

Цитируемая литература

1. Metcalf D. Hemopoietic growth factors. 1. // The Lancet. - 1989. - Vol. 15. - P. 825-827.

2. Машковский М.Д. Лекарственные средства: 15-е изд. - М: 00 «Изд-во Новая Волна», 2008. - 1206 с.

3. Волкова М.А. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор граноцит и его клиническое применение // Тер. архив. - 1998. - №4. - С. 80-84.

4. Anderson J.A. Allergic reactions to drugs and biologic agents. JAMA. - 1992 - vol. 268. - p. 2845-2857.

5. Дыгай A.M., Жданов B.B., Гольдберг B.E., Зюзьков Г.Н. и др. Методические рекомендации по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ // Руководство по проведению доклинических исследований новых лекарственных средств. Часть первая / Под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2013. - С. 759-766.

6. Dygai A.M., G.N., Zhdanov V.V., Udut E.V., Miroshnichenko L.A., Simanina E.V., Khrichkova T.Yu., Minakova M.Yu., Madonov P.G. Specific Activity of Electron-Beam Synthesis Immobilized Hyaluronidase on G-CSF Induced Mobilization of Bone Marrow Progenitor Cells // Stem Cell Reviews and Reports, 2013, Vol. 9 - issue 2 - P. 140-147.

7. Зюзьков Г.Н., Жданов B.B., Удут E.B., Мирошниченко Л.А., Чай-ковский А.В., Симанина Е.В., Полякова Т.Ю., Минакова М.Ю., Удут В.В., Толстикова Т.Г., Шульц Э.Э., Ставрова Л.А., Бурмина Я.В., Суслов Н.И.,. Дыгай А.М Участие цАМФ- и IKK-зависимых сигнальных путей в стимуляции функций мезенхимных клеток-предшественников алкалоидом зонгорином // Бюл. эксперим. биол. и медицины, 2015. - №5. - С. 601-604.

8. G.N., Zhdanov V.V., Udut Е.V., е.а. Involvement of JAK1, JAK2, and JAK3 in Stimulation of Functional Activity of Mesenchymal Progenitor Cells by Fibroblast Growth Factor // Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 2016, Volume 162, Issue 2, pp. 240-243.

9. G.N. Zyuz'kov, V.V. Zhdanov, E.V. Udut e.a. Role of JNK and Involvement of p53 in Stimulation of Growth Potential Realization of Mesenchymal Precursor Cells by Alkaloid Songorine // Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 2015, Volume 160, Issue 1, pp. 64-67.

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии и гематологии. Предложено применение ингибитора JNK (c-Jun N-terminal kinase) в качестве гемостимулирующего средства в условиях цитостатической миелосупрессии. Технический результат: ингибиторы JNK IQ-IS и SP600125 до 238,2% и до 250,2%, соответственно, увеличили содержание зрелых нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге мышей после цитостатической миелосупрессии, вызванной 5-ФУ, также увеличили содержание эритроидных клеток. Изобретение обеспечивает расширение арсенала высокоэффективных гемостимулирующих средств. 3 табл., 1 пр.

Применение ингибитора JNK (c-Jun N-terminal kinase) в качестве гемостимулирующего средства в условиях цитостатической миелосупрессии.