СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ МОЛОКА Российский патент 2004 года по МПК G01N33/02 G01N33/04 

Изобретение относится к области биохимии, в частности к биохимии молока. Этот способ необходим для оценки биохимических, санитарно-гигиенических и технологических свойств молока. Метод позволяет оценить способность биологически активных веществ молока сдерживать рост микрофлоры, в частности кишечной палочки. Оценка бактерицидной активности молока имеет важное практическое значение, так как молоко является диетическим продуктом питания. Молоко с высокой бактерицидной активностью сдерживает рост кишечной и сенной палочки, гнилостной микрофлоры, что повышает качество и диетические свойства, удлиняет сроки хранения молока. Исследования в данной области позволяют предположить, что бактерицидная активность может служить фактором оценки генотипа животного, так как химический состав молока обусловлен породными особенностями

Известные методики определения бактерицидной активности молока, такие как метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) [1] или общего микробного числа, биокалориметрический метод определения общего количества бактерий [2], а также потенциометрический метод определения длительности бактерицидной фазы [3] молока основаны на измерении бактериальной обсемененности молока.

Сущностью биокалориметического метода является калориметрическое измерение тепловой мощности, выделяемой в процессе жизнедеятельности микрофлоры, которая характеризует физиологическую активность микрофлоры. Определение проводится в исследуемом молоке в сравнении с пастеризованной пробой этого же молока на микрокалориметре МКМ-Ц. Недостатками метода является то, что он в большей степени характеризует не способность молока сдерживать рост микрофлоры, а его бактериальную обсемененность, а также необходимость применения микрокалориметра, редко встречающегося в лабораториях.

Потенциометрический метод определения длительности бактерицидной фазы основан на измерении окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) молока, который уменьшается при интенсивном росте бактерий. Анализ проводится на потенциометре КСП-4. Недостатками этого метода также являются косвенное определение бактерицидной активности по количеству присутствующей микрофлоры, применение специального оборудования.

Наиболее близким и распространенным способом определения бактерицидной активности молока является метод определения КМАФАнМ, основанный на способности мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов размножаться на плотном питательном агаре при (30+1°С) в течение 72 часов. Определение проводится путем посева разведений исследуемого молока на агар через интервалы времени и подсчета выросших за 72 часа колоний микробов. Конец бактерицидной фазы определяется по началу интенсивного роста бактерий. Однако этот способ имеет ряд существенных недостатков. Он трудоемок и неточен, так как конечный результат во многом зависит от первоначальной бактериальной обсемененности молока.

Таким образом, ни один из существующих способов не позволяет оценить непосредственно способность молока сдерживать рост бактерий.

Целью изобретения является разработка способа определения бактерицидной активности молока, позволяющего объективно оценить способность молока сдерживать рост кишечной палочки.

Поставленная цель достигается путем оценки роста тест-культуры кишечной палочки на мясопептонном бульоне (МПБ) с внесенной в него исследуемой молочной сывороткой по изменению оптической плотности. Для этого из пробы молока объемом 50 см³ готовится молочная сыворотка путем добавления 10%-го раствора серной кислоты до образования сгустка казеина с удалением казеина фильтрованием, с последующим восстановлением реакции среды до рН, равной 6, по универсальному индикатору, в МПБ вносится молочная сыворотка и тест-культура E.coli с оптической плотностью 0,45-0,55, измеренной на ФЭКе при красном светофильтре (длина волны 550 нм), оценка бактерицидной активности молока ведется по оптической плотности МПБ с добавлением тест-культуры кишечной палочки и исследуемой молочной сыворотки в сравнении с оптической плотностью МПБ и тест-культуры без добавления исследуемой сыворотки при термостатировании в течение 24 часов при температуре 38±1°С, с дальнейшим расчетам по формулам.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый способ определения бактерицидной активности молока позволяет оценить бактерицидную активность напрямую, а не косвенно, то есть соответствует критерию" новизна".

Признаки, отличающие предлагаемое техническое решение от прототипа:

1. получение молочной сыворотки путем добавления 10% раствора серной кислоты до рН 3-4 до образования сгустка казеина;

2. удаление сгустка казеина фильтрованием;

3. восстановление реакции среды сыворотки 1 н. раствором едкого натра до рН, равной 6, по универсальному индикатору;

4. подготовка тест-культуры E.coli из суточной культуры кишечной палочки, выращенной на агаре, путем смыва физраствором и доведения концентрации бактерий до 0,45-0,55 по ФЭКу при длине волны 550±21 нм;

5. внесение тест-культуры и молочной сыворотки в стерильный МПБ (объем 4,5 мл);

6. измерение оптической плотности МПБ в начале опыта, через 3, 6, 9, 12 и 24 часа термостатирования при температуре 38±1°С;

7. оценку результатов по изменению оптической плотности МПБ с добавлением тест-культуры E.coli и исследуемой молочной сыворотки в сравнении с оптической плотностью МПБ и тест-культуры без добавления исследуемой сыворотки в каждом промежутке времени проводят по расчетным формулам 1, 2, 3.

Расчетные формулы

где НМ - нарастание массы E.coli, в процентах от исходного значения;

Д₁ - первоначальная оптическая плотность пробы;

Д₂ - оптическая плотность пробы через расчетный промежуток времени.

где БА - бактерицидная активность молока через расчетный промежуток времени, %;

НМконтр - нарастание массы E.coli в контрольной пробе, %;

НМоп - нарастание массы E.coli в опытной пробе, %.

где БАср - средняя бактерицидная активность молока в течение 24 часов, %;

БА₃ - бактерицидная активность молока через 3 часа, %;

БА₆ - бактерицидная активность молока через 6 часов, %;

БА₉ - бактерицидная активность молока через 9 часов, %;

EA₁₂ - бактерицидная активность молока через 12 часов, %;

БА₂₄ - бактерицидная активность молока через 24 часа, %.

Анализ известных технических решений в области биохимии и микробиологии молока позволяет сделать вывод об отсутствии в них признаков, сходных с существенными отличительными признаками в заявляемом способе, такими как непосредственная оценка бактерицидной активности молочной сыворотки с внесением тест-культуры E.coli на фотоэлектроколориметре, и признать заявляемый метод соответствующим критерию "существенные отличия".

Пример выполнения.

Способ основан на измерении оптической плотности мясопептонного бульона (МПБ) при росте в нем E.coli с добавлением и без добавления сыворотки исследуемого молока.

При проведении испытания способа анализу подвергали две пробы непастеризованного молока, полученного от разных животных. Обозначили их № 1 и № 2, а исследуемые параллели 1.1-1.5 и 2.1-2.5 соответственно.

Из каждой пробы молока получили сыворотку путем добавления 10%-го раствора серной кислоты до рН 3-4 по универсальному индикатору с целью удаления белка - казеина, не оказывающего влияния на бактерицидность, но не позволяющего исследовать молоко методом колориметрии. Сгусток казеина удаляли фильтрованием, затем реакцию среды (рН) восстанавливали 1 н. раствором едкого натра до рН 6, что необходимо для нормального функционирования ферментов, содержащихся в сыворотке молока и обладающих бактерицидным действием.

Тест-культуру E.coli готовили, используя суточную культуру кишечной палочки, выращенную на агаре. Суточную культуру смывали стерильным физиологическим раствором и доводили концентрацию бактерий до плотности 0,45-0,55 по нижней шкале ФЭКа при длине волны, равной 550±21 нм. Тест-культуру помещали в стерильный МПБ /объем 4,5 мл/ и добавляли исследуемую молочную сыворотку. Параллельно готовили контрольную пробу без добавления молочной сыворотки.

Измерения оптической плотности проводили в начале исследования и через 3, 6, 9, 12 и 24 часа термостатирования при температуре 38°С (таблица 1).

Оценку результатов в каждом из промежутков времени проводили по приведенным формулам 1, 2 и 3 (таблицы 2 и 3).

Таким образом, молочная сыворотка сдерживает рост кишечной палочки в течение 24 часов. Максимальная бактерицидная активность в обеих пробах проявляется через 9-12 часов термостатирования и составляет 83 и 96%. Бактерицидные свойства молока проявляются уже через три часа термостатирования.

Использование предлагаемого способа определения бактерицидной активности обеспечивает по сравнению с существующими методами следующие преимущества.

1. Предлагаемая методика впервые позволяет количественно оценить бактерицидную активность молока по способности молочной сыворотки сдерживать рост кишечной палочки на питательной среде, в то время как существующие аналоги оценивают ее лишь косвенно по бактериальной обсемененности молока.

2. Объективность и точность оценки обеспечиваются за счет применения имеющегося во всех лабораториях ФЭКа.

3. Выполнение методики не требует дорогостоящего оборудования и реактивов.

4. При необходимости оценку бактерицидных свойств молока можно проводить ускоренным методом в течение 3-х часов.

Источники информации

1. ГОСТ 9225-84 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа.

2. ГОСТ 27930-88 Молоко и молочные продукты. Биокалориметрический метод определения общего количества бактерий.

3. Пейнович В., Голубь В., Понамарев А. Бактерицидные свойства молока при хранении его в замороженном виде. - Молочное и мясное скотоводство, 1988, № 1, с.24-25.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к биохимии молока, и касается оценки способности биологически активных веществ молока сдерживать рост микрофлоры, в частности кишечной палочки. Способ предусматривает оценку роста тест-культуры кишечной палочки на мясопептонном бульоне (МПБ) с внесенной в него исследуемой молочной сывороткой по изменению оптической плотности. Из пробы молока объемом 50 см³ готовят молочную сыворотку путем добавления 10%-го раствора серной кислоты до образования сгустка казеина с удалением казеина фильтрованием, с последующим восстановлением реакции среды до рН 6 по универсальному индикатору. В МПБ вносят молочную сыворотку и тест-культуру Е.coli с оптической плотностью 0,45-0,55 по ФЭКу при красном светофильтре (длина волны 550 нм). Оценку бактерицидной активности молока ведут по оптической плотности МПБ с добавлением тест-культуры кишечной палочки и исследуемой молочной сыворотки в сравнении с оптической плотностью МПБ и тест-культурой без добавления исследуемой сыворотки при термостатировании в течение 24 часов при температуре 38±1°С, с дальнейшим расчетам по формулам. Изобретение позволяет объективно оценить способность молока сдерживать рост кишечной палочки. 3 табл.

Способ определения бактерицидной активности молока, предусматривающий внесение исследуемой пробы в питательную среду, термостатирование и оценку бактерицидной активности молока, отличающийся тем, что в питательную среду, в качестве которой используют мясопептонный бульон, наряду с исследуемой пробой молочной сывороткой вносят тест-культуру E.coli с оптической плотностью 0,45-0,55, определенной фотоэлектрокалориметрическим методом при длине волны, равной 550 нм, оценку бактерицидной активности ведут путем сравнения оптической плотности мясопептонного бульона с добавлением тест-культуры E.coli и молочной сыворотки и без добавления последней с последующим термостатированием при температуре (38±1)°С в течение 24 ч, при этом оценку результатов проводят по приведенным ниже формулам:

где НМ - нарастание массы E.coli, в процентах от исходного значения;

Д₁ - первоначальная оптическая плотность пробы;

Д₂ - оптическая плотность пробы через расчетный промежуток времени;

где БА - бактерицидная активность молока через расчетный промежуток времени, %;

НМ_контр - нарастание массы E.coli в контрольной пробе, %;

НМ_оп - нарастание массы E.coli в опытной пробе, %;

где БА_ср - средняя бактерицидная активность молока в течение 24 ч, %;

БА₃ - бактерицидная активность молока через 3 ч, %;

БА₆ - бактерицидная активность молока через 6 ч, %;

БА₉ - бактерицидная активность молока через 9 ч, %;

БА₁₂ - бактерицидная активность молока через 12 ч, %;

БА₂₄ - бактерицидная активность молока через 24 ч, %.