АНТИТЕЛА ПРОТИВ IDE И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2025 года по МПК C07K16/40 A61K39/395 A61P17/02 A61P25/28 A61P3/10 G01N33/53 G01N33/564 

Ссылка на родственные заявки

Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на выдачу патента США №62/964139, поданной 22 января 2020 года, содержание которой полностью включено посредством ссылки.

Заявление о перечне последовательностей

Файл ASCII под названием 85636, созданный 10 декабря 2020 года, объемом 45056 байтов, представленный одновременно с материалами настоящей заявки, включен в настоящий документ посредством ссылки.

Область техники, к которой относится настоящее изобретение, и предшествующий уровень техники

Настоящее изобретение в некоторых вариантах его осуществления относится к антителам против IDE (анти-IDE антителам) и их применению.

Разрушающий инсулин фермент (IDE), представляет собой крупную цинкевязывающую протеазу (тиолцинк-металлоэндопептидаза, с молекулярной массой приблизительно 110 кДа), расположенную в цитозоле, пероксисомах, эндосомах и на поверхности клеток. Этот фермент расщепляет небольшие белки с различными последовательностями, многие из которых имеют общую склонность к образованию амилоидных фибрилл, богатых β-складками, включая амилоидный β-белок ( инсулин, глюкагон, амилин, предсердный натрийуретический фактор и кальцитонин. Также известно, что IDE расщепляет несколько коротких полипептидов, и он играет важную роль в деградации различных белков, таких как инсулин и IGF-1, которые, как сообщалось ранее, модулируют активность иммунного ответа.

С момента своего открытия ингибиторы IDE были предложены для лечения ряда заболеваний, включая, например, диабет, ожирение, аутоиммунные заболевания центральной нервной системы, нейродегенеративные заболевания и инфекцию, вызванную вирусом ветряной оспы (VZV) (см., Maianti et al. (2014) Nature 511, 94-98; Tang, W.-J. (2016) Trends Endocrinol, etab. 27, 24-34; и публикации международных заявок WO 2012/017439 и WO 2010/086867). Например, в публикации РСТ №WO 2010/086867 этого же заявителя описано применение выделенного пептида, содержащего аминокислотную последовательность длиной не более 25 аминокислот, где аминокислотная последовательность содержит по меньшей мере один аспартат или его гомолог, и этот пептид, обладающий ингибирующей активностью в отношении разрушающего инсулин фермента (IDE), предложен для изготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из диабета, ожирения, гипергликемии, повреждения сетчатки, почечной недостаточности, повреждения нервов, повреждения микрососудов и ветряной оспы (инфекция, вызванная вирусом VZV). В публикации РСТ №WO 2012/017439 этого же заявителя предложен ингибитор разрушающего инсулин фермента (IDE) (например, антитело), для применения при лечении заболевания, выбранного из группы, состоящей из аутоиммунного заболевания центральной нервной системы и нейродегенеративного заболевания.

В данной области описано несколько моноклональных и поликлональных антител против IDE, используемых для обнаружения in vitro IDE грызунов и/или человека в различных вариантах применения, включая вестерн-блоттинг, иммунопреципитацию, иммуноцитохимию, иммуногистохимию и количественный сэндвич-ELISA [см., например, Delledonne A. et al. Mol Neurodegener. (2009) 4:39].

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Согласно одному аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается выделенное антитело, содержащее область распознавания антигена, которая специфически связывается с IDE, в котором домен распознавания антигена содержит аминокислотные последовательности определяющей комплементарность области (CDR), представленные в:

(i) SEQ ID NO: 4 (CDR1), SEQ ID NO: 6 (CDR2) и SEQ ID NO: 8 (CDR3), последовательно расположенные от N до С на тяжелой цепи антитела; и SEQ ID NO: 12 (CDR1), RNN(CDR2) и SEQ ID NO: 16 (CDR3), последовательно расположенные от N до С на легкой цепи антитела;

(ii) SEQ ID NO: 20 (CDR1), SEQ ID NO: 22 (CDR2) и SEQ ID NO: 24 (CDR3), последовательно расположенные от N до С на тяжелой цепи антитела; и SEQ ID NO: 28 (CDR1), DAS(CDR2) и SEQ ID NO: 32 (CDR3), последовательно расположенные от N до С на легкой цепи антитела; или

(iii) SEQ ID NO: 36 (CDR1), SEQ ID NO: 38 (CDR2) и SEQ ID NO: 40 (CDR3), последовательно расположенные от N до С на тяжелой цепи антитела; и SEQ ID NO: 44 (CDR1), DND(CDR2) и SEQ ID NO: 48 (CDR3), последовательно расположенные от N до С на легкой цепи антитела.

Согласно одному аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента антитело (ii) или (iii) и фармацевтически приемлемый носитель.

Согласно одному аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается способ лечения заболевания, связанного с активностью IDE, у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающий введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела (ii) или (iii), или фармацевтической композиции, обеспечивая тем самым предотвращение или лечение заболевания, связанного с активностью IDE.

Согласно одному аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается антитело (ii) или (iii) для применения при лечении заболевания, связанного с активностью IDE, у субъекта, нуждающегося в этом.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения способ дополнительно предусматривает введение субъекту терапевтического средства для лечения заболевания.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения антитело для применения дополнительно включает терапевтическое средство для лечения этого заболевания.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения субъект имеет уровень IDE в биологическом образце выше заданного порога по сравнению с контрольным биологическим образцом.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения способ включает определение уровня IDE в биологическом образце от субъекта при применении антитела, перед его введением.

Согласно одному аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается изделие, предназначенное для лечения заболевания, связанного с активностью IDE, содержащее антитело (ii) или (iii) и терапевтическое средство для лечения этого заболевания.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения антитело и терапевтическое средство находятся в отдельных контейнерах.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения антитело и терапевтическое средство находятся вместе в составе одного препарата.

Согласно одному аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается способ диагностики заболевания, связанного с активностью IDE, у субъекта, предусматривающий определение уровня IDE в биологическом образце от субъекта, при применении антитела, где, когда уровень IDE выше заданного порога по сравнению с контрольным биологическим образцом, то у субъекта диагностируется заболевание.

Согласно одному аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается способ мониторинга эффективности терапии заболевания, связанного с активностью IDE, у субъекта, у которого диагностировано заболевание, где способ включает определение уровня IDE в биологическом образце от субъекта, проходящего терапию или после терапии с применением антитела, и при этом считается, что терапия эффективна, когда уровень IDE снижается по отношению заданного порога после терапии.

Согласно одному аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается способ лечения заболевания, связанного с активностью IDE, у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающий:

(a) диагностику субъекта согласно способу по изобретению; и при этом, когда уровень IDE выше заданного порога,

(b) лечение субъекта, используя терапию по изобретению обеспечивая тем самым лечение заболевания у субъекта.

Согласно одному аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается способ лечения заболевания, связанного с активностью IDE, у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающий:

(a) диагностику субъекта согласно способу по изобретению; и при этом, когда уровень IDE выше заданного порога,

(b) выбор терапии по изобретению на основе уровня IDE, обеспечивая тем самым лечение заболевания у субъекта.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения терапия включает применение антитела (ii) или (iii).

Согласно одному аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается композиция, содержащая биологический образец от субъекта, у которого диагностировано заболевание, связанное с активностью IDE, и антитело.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения заболевание, связанное с активностью IDE, выбрано из группы, состоящей из аутоиммунного заболевания центральной нервной системы, нейродегенеративного заболевания, метаболического синдрома, диабета, ожирения, гипергликемии, повреждения сетчатки, почечной недостаточности, повреждения нерва, повреждения микрососудов, инфекции вируса ветряной оспы (VZV) и раны.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения заболевание, связанное с активностью IDE, выбрано из группы, состоящей из аутоиммунного заболевания центральной нервной системы, нейродегенеративного заболевания, диабета, ожирения, гипергликемии, повреждения сетчатки, почечной недостаточности, повреждения нерва, повреждения микрососудов, инфекции вируса ветряной оспы (VZV) и раны.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения заболевание, связанное с активностью IDE, выбрано из группы, состоящей из метаболического синдрома, диабета и ожирения.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения заболевание представляет собой диабет.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения диабет представляет собой диабет 1 типа.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения диабет представляет собой диабет 2 типа.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения заболевание представляет собой метаболический синдром.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь Паркинсона.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения аутоиммунное заболевание центральной нервной системы выбрано из группы, состоящей из рассеянного склероза, синдрома Гийена-Барре, миастенического синдрома Ламберта-Итона, миастении гравис, поперечного миелита, прогрессирующей многоочаговой лейкознцефалопатии, хронической головной боли и церебрального паралича.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения аутоиммунное заболевание центральной нервной системы представляет собой рассеянный склероз.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения рана выбрана из группы, состоящей из хронической раны, острой раны, диабетической раны, ишемической раны, язвы, ожога и хирургической раны.

Согласно одному аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается выделенный полинуклеотид, кодирующий антитело.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие аминокислотные последовательности CDR, представлены в:

(i) SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, aggaataat и SEQ ID NO: 15;

(ii) SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, gatgcatcc и SEQ ID NO: 31; или

(iii) SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, gacaatgat и SEQ ID NO: 47.

Согласно одному аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая полинуклеотид и цис-действующий регуляторный элемент для направления экспрессии полинуклеотида.

Согласно одному аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается клетка-хозяин, экспрессирующая антитело, полинуклеотид или конструкцию нуклеиновой кислоты.

Согласно одному аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается способ получения антитела против IDE (анти-IDE антитела), предусматривающий экспрессию полинуклеотида или конструкции нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения способ предусматривает выделение антитела.

Согласно одному аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается способ получения антитела против IDE, предусматривающий:

(a) предоставление множества антител;

(b) скрининг антител для выбора антител, которые связываются с IDE дикого типа и не мутантные IDE, обладающие сниженной каталитической активностью по сравнению с IDE дикого типа.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения IDE дикого типа имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 50.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения мутантный IDE содержит конверсию E111Q в соответствующей последовательности SEQ ID NO: 50.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения способ дополнительно предусматривает скрининг антител для выбора антител, которые ингибируют разрушающую инсулин активность IDE.

Если не указано иное, все используемые здесь технические и/или научные термины имеют значение, которое обычно понимается специалистом в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Ниже описаны иллюстративные способы и/или материалы; однако способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, что описаны здесь, могут быть использованы при практическом применении или тестировании вариантов осуществления изобретения. В случае возникновения противоречий, настоящее описание, включая определения терминов, будет иметь преимущественную силу. Кроме того, описанные материалы, способы и примеры являются только иллюстративными, и они не предназначены для каких-либо ограничений.

Краткое описание фигур

Некоторые варианты осуществления изобретения описаны здесь только в качестве примера со ссылкой на прилагаемые фигуры. Обращаясь к подробностям, представленным на фигурах, следует подчеркнуть, что показанные детали даны в качестве примера, а также в целях иллюстративного обсуждения вариантов осуществления изобретения. В этом отношении описание, рассматриваемое вместе с фигурами, обеспечивает специалистов в данной области техники информацией, каким образом варианты осуществления изобретения могут быть реализованы на практике.

На фигурах представлено следующее.

На фигурах 1A-G показаны результаты в отношении полученных антител против IDE (анти-IDE антител). На фигурах 1A-D показаны результаты экспрессии и очистки рекомбинантного IDE человека дикого типа (WT) и неактивного мутанта IDE (E111Q). На фигуре 1А показана графическая карта плазмиды рЕТ28а+, содержащей рекомбинантный IDE: рекомбинантная конструкция была заказана в компании Genewiz Company и встроена в вектор между Ndel и HindIII. Также отмечены гистидиновая метка (His tag) и сайт однонуклеотидной мутации для каталитически неактивного IDE (E1111Q). На фигуре 1В показаны результаты SDS-PAGE для полного клеточного экстракта (15 мкг) из клеток Е. coli Rosetta BL21, несущих вектор pET28a-IDE, до и после индукции с помощью 0,5 мМ IPTG (обозначены как «unind» и «IPTG» соответственно); очищенный белок (3 мкг), элюированный с колонок GE HisTrap с использованием имидазола (обозначен как «риге»); белок (15 мкг), смытый с колонок-ловушек GE His (обозначен как «FT»). На фигуре 1С показан вестерн-блоттинг общего клеточного экстракта (15 мкг) из клеток ii. coli Rosetta BL21, несущих вектор рЕТ28а+: пустой вектор (обозначен как «mock»); вектор с rhIDE дикого типа (WT) до и после индукции (обозначен как «unind» и «IPTG» соответственно). IDE обнаруживали с использованием поликлонального анти-IDE антитела, а затем вторичного антитела с красителем (IR). Флуоресцентный сигнал регистрировали при сканировании мембраны на сканере Oddisey (Licor; размер пикселя 21 мкм, смещение 0,5 мм, интенсивность 6 и среднее качество). На фигуре 1D представлена гистограмма, демонстрирующая результаты анализа активности IDE. 1,5 мкг/л человеческого инсулина инкубировали с PBS, 12 мкг/мл rhIDE WT или E111Q в течение 2 часов при 37°С.Затем остаточный инсулин анализировали с помощью ультрачувствительного анализа ELISA для мышиного инсулина (Mercodia). Детектирование осуществляли с помощью планшетного ридера для ELISA при 450 нм. Результаты представлены как среднее значение±SEM (стандартная ошибка среднего) (n=3). ** р<0,01; *** р<0,001, однофакторный дисперсионный анализ ANOVA с поправкой Бонферрони. На фигуре 1Е показаны результаты экспрессии и очистки анти-IDE MBP-scFv. Типичная оценка MBP-scFv А9 методом FPLC показана на верхнем изображении. Растворимую фракцию бактериального лизата наносили на колонку-ловушку GE His Trap. Элюирование проводили 0,5 М имидазолом при скорости потока 2 мл/мин (пик). Результаты анализа SDS-PAGE трех выбранных клонов MBP-scFv (А9, В1 и Н3) показаны на нижнем изображении. Дорожки 1 и 2: 15 мкг общего клеточного экстракта из клеток Е. coli Rosetta BL21, несущих вектор pMALc-NHNN-scFv, до и после индукции 0,5 мМ IPTG, соответственно; дорожка 4: 3 мкг очищенного белка, элюированного с колонок-ловушек GE His Trap с использованием имидазола; дорожка 3:15 мкг белка, смытого с колонок-ловушек GE His Trap.На фигуре 1F показаны результаты экспрессии и очистки анти-IDE инклональных IgG. На верхнем изображении показан анализ SDS-PAGE легких и тяжелых цепей нерастворимой фракции клеточных лизатов клеток Е. coli Rosetta pUBS500, несущих цепи анти-IDE антител в векторах рНАК. На каждую дорожку загружали 10 мкг клеточного лизата до и после индукции IPTG (соответственно нечетные и четные номера дорожек). Дорожки 1-2: А9 V_H; дорожки 3-4: B1 V_H; дорожки 5-6: НЗ V_H; дорожки 7-8: А9 V1; дорожки 9-10: Bl Vl; дорожки 11-12 Н3 V_L. Репрезентативная оценка инклональных B1 IgG методом FPLC показана на среднем изображении. Раствор для рефолдинга легких и тяжелых цепей В1 наносили на колонку GE MabSelect. Элюирование проводили цитратным буфером с рН=3,0 при скорости потока 2 мл/мин (пик). Нижнее изображение представляет результаты репрезентативного анализа SDS-PAGE включений в легкие и тяжелые цепи, очищенных из клеток Е. coli Rosetta pUBS500, несущих легкие и тяжелые цепи анти-IDE в векторе рНАК после индукции IPTG (обозначены соответственно как «VL» и «VH»); V_L и V_H после инкубации в растворе для рефолдинга (обозначены как «Refold»); Инклональный IgG после очистки с использованием колонок MabSelect (обозначен как «IgG»); коммерческий IgG в качестве положительного контроля (эрбитукс) в восстанавливающем и невосстанавливающем состояниях. На фигуре 1G показаны результаты очистки обратного химерного антитела НЗ (rcH3-IgG). Показаны результаты анализа SDS-PAGE (12% гель) полученного и очищенного rcH3-IgG в виде мышиного IgGl. Дорожка 1: кондиционированная среда через 7 дней после трансфекции (загрузка 10 мкг); дорожка М: маркер молекулярной массы; дорожка 2: очищенный белок-G rcH3-IgG (загрузка 5 мкг).

На фигурах 2A-F показаны результаты связывания анти-IDE антител и соответствующих «инклональных» IgG методом фагового дисплея. На фигурах 2А-С представлены графики, демонстрирующие результаты связывания IDE с scFv клонов А9 (фигура 2А), В1 (фигура 2В) и Н3 (фигура 2С), полученных с помощью ELISA для метода фагового дисплея. Анализируемые дисплейные фаги с scFv добавляли в последовательных разведениях в лунки планшета для ELISA, покрытые 2,5 мкг/мл rhIDE IDE дикого типа (обозначены как «IDE») или нерелевантными белками: BSA, очищенным рекомбинантным белком HisTrap (обозначен как «His») и MBP-LacZ. Связанные фаги выявляли с помощью мышиного анти-М13 антитела, а затем с помощью конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP) вторичного козьего антимышиного антитела. Результаты представлены как среднее ±SEM (n=3). На фигурах 2D-F представлены графики, демонстрирующие связывание IDE очищенными инклональными IgG клонов А9 (фигура 2D), В1 (фигура 2Е) и Н3 (фигура 2F), определенное с помощью ELISA. Анализируемые антитела добавляли в серийных разведениях в лунки планшета для ELISA, покрытые 2 мкг/мл rhIDE IDE дикого типа (обозначены как «IDE») или BSA. Связанные антитела обнаруживали с помощью конъюгированного с HRP вторичного козьего антитела против антитела человека. Результаты представлены как среднее ±SEM (n=4).

На фигурах 3А-В показаны результаты анализа ингибирования IDE с использованием анти-IDE MBP-scFv или инклональных IgG. На фигурах показано ингибирование активности IDE, определенное по остаточному уровню инсулина после инкубации с полученными антителами. Для этого 1,5 мкг/мл IDE инкубировали с указанными концентрациями анти-IDE scFv клонов А9, В1 или Н3 или контрольного scFv (фиг. 3А); или с инклональными анти-IDE IgG клонов А9 или Н3, или с нерелевантным инклональным IgG (обозначенным как «AF») (фиг. 3В) и с пептидом-ингибитором IDE ADT21 в течение 1 часа при комнатной температуре, с последующей инкубацией с 2 мкг/л человеческого инсулина в течение 2 часов при 37°С. Затем остаточный инсулин анализировали с помощью ультрачувствительного анализа ELISA для мышиного инсулина (Mercodia). Детектирование осуществляли с помощью планшетного ридера для ELISA при 450 нм. Результаты представлены как среднее ±SEM (n=3). *** - Р<0,001, однофакторный дисперсионный анализ ANOVA с поправкой Бонферрони.

На фигурах 4А-С показаны результаты оценки конформационной специфичности полученных анти-IDE антител. На фигуре 4А показано репрезентативное изображение дот-блоттинга, демонстрирующее связывание полученного MBP-scFv с нативным IDE. Для этого rhIDE WT в серийных разведениях (0,1-1 мкг) и 20 мкг клеточного лизата спленоцитов мыши наносили на мембрану в нативном или денатурированном состоянии (после 5-минутного кипячения при 95°С). Затем добавляли анти-IDE MBP-scFv (клоны А9, В1 или Н3), затем мышиное анти-МВР-антитело, а затем конъюгированное с HRP вторичное козье антимышиное антитело. Детекцию осуществляли с помощью реакции ECL. На фигуре 4В представлен график, демонстрирующий связывание обратного химерного rcH3-IgG с rhIDE WT или с мутантным rhIDE, определенное с помощью ELISA. 5 Для этого мкг/мл rhIDE WT, неактивного мутанта IDE (E111Q, обозначен как «мутант IDE») или BSA инкубировали с серийными разведениями rcH3-IgG или с антителом отрицательного контроля rc2E12-IgG (начиная с 100 нМ). Антитела выявляли с использованием конъюгированных с HRP вторичных козьих антимышиных антител. Результаты представлены как среднее ±SEM (n=3). На фигуре 4С представлена гистограмма, демонстрирующая ингибирование активности IDE, определенное по остаточным уровням инсулина после инкубации с rcH3-IgG или отрицательным контролем rc2E12-IgG. Для этого 0,1 мкг/мл IDE инкубировали с rcH3-IgG или rc2E12-IgG в течение 1 часа при комнатной температуре с последующей инкубацией с 1,5 мкг/л человеческого инсулина в течение 1 часа при 37°С. Затем остаточный инсулин анализировали с использованием ультрачувствительного анализа ELISA для мышиного инсулина (Mercodia). Детектирование осуществляли с помощью планшетного ридера ELISA при 450 нм. Результаты представлены как среднее ±SEM (n=3).

На фигурах 5А-С показаны результаты оценки терапевтического эффекта обратного химерного анти-IDE антитела Н3 на мышиной модели диабета, индуцированного STZ. На фигурах 5А-В показаны графики определения уровней инсулина после внутрибрюшинного введения rcH3-IgG или отрицательного контроля rc2E12-IgG через 2 дня после инъекции STZ, определеных с помощью анализа oGTT (n=5 мышей в каждой группе; # р<0,01 между группами; фигура 5А) или с помощью анализа ITT (n=5 мышей в каждой группе; * р<0,05, *** р<0,001 внутри группы, фигура 5В). На фигуре 5С представлен график, показывающий уровни rcH3-IgG в разные дни после внутрибрюшинного введения мышам, получавшим STZ (n=2-4 мыши в каждой группе). Результаты представлены как среднее ±SEM.

На фигурах 6А-В показаны результаты оценки in vitro эффекта действия Fab2-сегментов обратного химерного анти-IDE антитела НЗ (обозначенного здесь как «Fab Н3) на снижение уровней активных форм кислорода (АФК) в микроглии с нокдауном (KD) DJ-I, представляющей нейротоксический фенотип микроглии при болезни Паркинсона. Кроме того, клетки обрабатывали ротеноном, где это указано (обозначено как «Rot»), для увеличения продукции АФК. Показаны уровни АФК определенные с помощью метиленового голубого (MB) (фиг. 6А) и значения МС после инкубации с Fab антитела НЗ по сравнению с контрольной средой. Микроглия с нокдауном DJ-1 (DJ-1-KD) показала более высокие уровни АФК по сравнению с контрольной микроглией, и увеличение, вызванное ротеноном, можно уменьшить с помощью анти-IDE Fab Н3. Кроме того, результаты с использованием теста с МС показывают, что обработка инсулином или Fab НЗ не оказывает значительного влияния на выживаемость клеток после их обработки ротеноном. (N=3, 2-4 повтора в каждом опыте, всего n=6-12). Обозначения: Rot=ротенон; ins=инсулин. Результаты представлены как среднее ±SEM. *** р<0,001, NS различие незначимое.

На фигурах 7А-С показаны результаты анализа ELISA по обнаружению IDE в сыворотке человека. На фигуре 7А показано схематическое представление процедуры ELISA: (I) 96-луночные планшеты для ELISA покрывали в течение ночи рекомбинантным IgG А9, который служит в качестве захватывающего антитела; (II) лунки однократно промывали PBS и блокировали 3% обезжиренным молоком; (III) в планшет добавляли сыворотку и использовали известные концентрации рекомбинантного IDE человека в качестве контроля; (IV) лунки инкубировали с поликлональным кроличьим анти-IDE антителом, которое служило в качестве детектирующего антитела; (V) лунки промывали и инкубировали с конъюгированными с HRP козьими антикроличьими антителами, а затем обрабатывали, как описано в методах анализа. На фигуре 7В показана кривая чувствительности анализа ELISA. На фигуре 7С показано, что IgG А9 распознает конформационный эпитоп на rhIDE. Для этого готовили раствор 5 мкг/мл rhIDE в PBS и либо использовали его непосредственно для покрытия половины планшета для ELISA, либо денатурировали путем нагревания при 80°С в течение 20 минут с последующим охлаждением на льду перед использованием для покрытия другой половины планшета для ELISA. После стадий покрытия, блокировки и промывки, IgG А9 в концентрациях 100, 33,3, II, 1 или 3,7 нМ наносили в трех повторностях на лунки, покрытые нативным или денатурированным нагреванием rhIDE. Результаты представлены как среднее±SEM (n=3).

На фигурах 8А-В показано, что IgG А9 распознает конформационный эпитоп на rhIDE. Для этого готовили раствор 5 мкг/мл rhIDE в PBS и либо использовали его непосредственно для покрытия половины планшета для ELISA, либо денатурировали путем нагревания при 80°С в течение 20 минут с последующим охлаждением на льду перед использованием для покрытия другой половины планшета для ELISA. Планшет покрывали в течение ночи при 4°С из расчета 50 мкл/лунку. На следующий день планшет однократно промывали PBST (300 мкл/лунку) и блокировали 3%-ным раствором обезжиренного молока в PBS (300 мкл/лунку) в течение 1 часа при 37°С. Далее планшет трижды промывали PBST (300 мкл/лунку), и на лунки из трех колонок лунок, покрытых нативным или термо-денатурированным rhIDE наносили IgG А9 в концентрациях 100, 33,3, 11,1, 3,7 нМ (фигура 8А). Затем эти лунки промывали три раза PBST (300 мкл/лунку) с последующим добавлением 50 мкл/лунку конъюгированного с HRP козьего антитела против IgG человека, разбавленного в 5000 раз в PBST (фигура 8В). Для количественного определения общего количества rhIDE, нанесенного на лунки, другую половину планшета инкубировали с конъюгированным с HRP козьим антителом против His-метки, разбавленным в 2000, в 4000, в 8000, в 16000 раз в PBST. Планшет оставляли на 1 час при комнатной температуре, а затем трижды промывали PBST (300 мкл/лунку). Наконец, добавляли ТМВ для субстрата HRP из расчета 50 мкл/лунку до появления окраски. Реакцию останавливали через 2 минуты путем добавления 1 М H2SO4 (50 мкл/лунку), и анализировали с помощью ридера для микропланшетов BioTek Epoch. Оптическую плотность измеряли при длинах волн 450 и 620 нм. Результаты представлены как среднее ±SEM (n=3).

На фиг. 9 показано, что у больных с MS (n=51) имеются более высокие уровни IDE в сыворотке по сравнению со здоровыми людьми (контроль; n=24). Результаты представлены как среднее ±SEM; *** р<0,001.

На фигурах 10А-С показана корреляцию между уровнями IDE в сыворотке и компонентами при MS: триглицериды; r=0,423, р<0,01 (фиг. 10А), инсулин; r=0,294, р<0,05 (фиг. 10В); и HDLc; r=-0,366, р<0,05 (фиг. 10С).

Описание конкретных вариантов осуществления изобретения

Настоящее изобретение в некоторых вариантах его осуществления относится к антителам против IDE (анти-IDE антителам) и их применению.

Принципы и варианты осуществления настоящего изобретения могут быть лучше поняты с учетом прилагаемых фигур и их описания.

Перед подробным объяснением по меньшей мере одного варианта осуществления изобретения следует понимать, что изобретение не обязательно ограничено в своем осуществлении деталями, изложенными в последующем описании или в иллюстративных примерах. Изобретение допускает другие варианты осуществления, и оно может быть осуществлено или реализовано на практике различными способами. Кроме того, следует понимать, что фразеология и терминология, используемые здесь, предназначены только для целей описания, и они не должны рассматриваться как ограничивающие.

Разрушающий инсулин фермент (IDE), представляет собой крупную цинкевязывающую протеазу, которая, как известно, расщепляет несколько коротких полипептидов и играет важную роль в деградации инсулина. Несколько моноклональных и поликлональных антител к IDE были описаны в области применения in vitro [см., например, Delledonne A. et al. Mol Neurodegener. (2009) 4:39] и in vivo (см. публикацию PCT №WO 2012/017439). Кроме того, ранее были описаны ингибиторы IDE, включая пептидные ингибиторы (см. публикацию PCT №WO 2010/086867), для различных терапевтических применений.

Реализовав конкретные варианты осуществления настоящего изобретения на практике, авторы настоящего изобретения создали новые моноклональные анти-IDE антитела, которые специфически нацелены на разрушающую инсулин активность IDE, и ингибируют ее. Следовательно, в конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения предлагается использовать эти анти-IDE антитела в качестве средств диагностики и терапии заболеваний и состояний, связанных с IDE.

Как показано ниже в разделе "Примеры", авторы настоящего изобретения получили плазмиды для экспрессии разрушающего инсулин фермента (IDE) человека и мутантного IDE (E111Q)в бактерияхЕ. coli (Пример 1, фиг. 1А). Мутированный IDE (E111Q) содержит сайт-специфическую мутацию, которая ухудшает каталитическую активность из-за неспособности осуществлять нуклеофильную атаку на субстрат.Таким образом, оба пептида использовали для выделения специфических клонов антител, которые с высокой аффинностью связываются с каталитически активной формой IDE (т.е. IDE дикого типа). Для этого белки IDE экспрессировали в Е. coli, а затем их очищали, при этом очистка белков и их идентичность была подтверждена (см. фигуры 1B-D). Используя технику фагового дисплея, очищенный IDE использовали в качестве затравки для выделения клонов специфических одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv), которые распознают и связываются с высокоаффинными эпитопами рекомбинантного IDE человека дикого типа. Для этого отбирали три клона фагов, а именно, А9, Н3 и В1 (Пример 1, фиг. 2А-С). Затем scFv переформатировали для получения растворимых антител, и их тестировали в трех форматах: MBP-scFv, IgG1 человека, продуцируемые в виде «инклонов», и обратные химерные IgG, продуцируемые в культуре клеток млекопитающих. Специфичность и ингибирующие свойства этих антител в отношении IDE были дополнительно подтверждены in vitro (Примеры 1-2, фиг. 1Е-4С). Кроме того, обратное химерное антитело Н3 IgG улучшало уровни глюкозы и активность инсулина в мышиной модели диабета, индуцированного STZ (Пример 2, фиг. 5А-С). Кроме того, фрагменты Fab₂ обратного химерного антитела Н3 IgG снижали продукцию активных форм кислорода in vitro в клетках микроглии, имеющих фенотип болезни Паркинсона (Пример 3, фиг. 6А-В). Далее авторы настоящего изобретения разработали высокочувствительный анализ ELISA с использованием полученных антител (Пример 4, фиг. 7А-С). С помощью этого анализа ELISA авторы изобретения смогли продемонстрировать сильную корреляцию между уровнями IDE в сыворотке человека и наличием и/или тяжестью метаболического синдрома (MS) (Пример 4, фиг. 9-10С).

Следовательно, согласно одному аспекту настоящего изобретения предлагается выделенное антитело, содержащее область распознавания антигена, которая специфически связывается с IDE, где указанный домен распознавания антигена содержит аминокислотные последовательности определяющей комплементарность области (CDR), представленные в:

(i) SEQ ID NO: 4 (CDR1), SEQ ID NO: 6 (CDR2) и SEQ ID NO: 8 (CDR3), последовательно расположенные от N до С на тяжелой цепи указанного антитела; и SEQ ID NO: 12 (CDR1), RNN (CDR2) и SEQ ID NO: 16 (CDR3), расположенные последовательно от N до С на легкой цепи указанного антитела;

(ii) SEQ ID NO: 20 (CDR1), SEQ ID NO: 22 (CDR2) и SEQ ID NO: 24 (CDR3), последовательно расположенные от N до С на тяжелой цепи указанного антитела; и SEQ ID NO: 28 (CDR1), DAS (CDR2) и SEQ ID NO: 32 (CDR3), последовательно расположенные от N до С на легкой цепи указанного антитела; или

(iii) SEQ ID NO: 36 (CDR1), SEQ ID NO: 38 (CDR2) и SEQ ID NO: 40 (CDR3), последовательно расположенные от N до С на тяжелой цепи указанного антитела; и SEQ ID NO: 44 (CDR1), DND (CDR2) и SEQ ID NO: 48 (CDR3), последовательно расположенные от N до С на легкой цепи указанного антитела.

Используемый здесь термин «разрушающий инсулин фермент (IDE)» относится к инсулизину или инсулиновой протеазе, большой цинксвязывающей протеазе подсемейства металлопротеаз М16А, которая участвует в клеточном процессинге множества коротких полипептидов, включая амилоидный β-белок Аβ), инсулин, глюкагон, амилин, предсердный натрийуретический фактор и кальцитонин (например, как представлено в GenBank, номера доступа No. NM 004969 и NP 004960). Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения IDE представляет собой человеческий IDE. Пример IDE настоящего изобретения представлен в ЕС 3.4.24.56.

Используемый здесь термин «расщепляющий инсулин фермент человека дикого типа», также называемый IDE WT, относится к продукту экспрессии гена IDE функционального IDE человека, который имеет сродство к инсулину 100 нМ и расщепляет инсулин со скоростью, когда 36,6 мкмоль человеческого рекомбинантного IDE расщепляет 1 мкмоль человеческого инсулина за одну минуту. Типичный IDE WT представлен в SEQ ID NO: 50.

Используемый здесь термин «мутантный IDE типа E111Q» относится к измененной форме со сниженной каталитической активностью IDE человека, в которой имеется по меньшей мере одна мутация каталитического сайта (замена глутаминовой кислоты 111 на глутамин в соответствующей последовательности SEQ ID NO: 50). Типовой мутантный IDE типа E111Q представлен в SEQ ID NO: 52.

Термин «выделенный» относится по меньшей мере к частично отделенному от естественной среды, например, от сыворотки, или к преобладающей форме антитела в образце, который содержит множество антител, или к единственному антителу в биологическом образце.

Термин «антитело», используемый здесь, включает интактные молекулы, а также их функциональные фрагменты (которые способны связываться с эпитопом антигена).

Используемый здесь термин «эпитоп» относится к любой антигенной детерминанте антигена, с которой связывается паратоп антитела. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи углеводов, и они обычно имеют специфические трехмерные структуры, а также специфические характеристики заряда.

Согласно одному конкретному варианту осуществления настоящего изобретения фрагменты антител включают, но без ограничения, одноцепочечные фрагменты, Fab, Fab' и F(ab')₂ фрагменты, Fd, Fcab, Fv, dsFv, scFv, MBP-scFv, диатела, минитела, нанотела, библиотеки экспрессии Fab или однодоменные молекулы, такие как VH и VL, которые способны связываться с эпитопом антигена ограниченным по HLA образом.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения антитело является целым или интактным антителом.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения антитело является фрагментом антитела.

Фрагменты антител, подходящие для осуществления некоторых вариантов осуществления изобретения, включают определяющую комплементарность область (CDR) легкой цепи иммуноглобулина (обозначаемую в настоящем документе как «легкая цепь»), определяющую комплементарность область тяжелой цепи иммуноглобулина (обозначаемую в настоящем документе как «тяжелая цепь»), вариабельную область легкой цепи, вариабельную область тяжелой цепи, легкую цепь, тяжелую цепь, фрагмент Fd и фрагменты антител, содержащие по существу целые вариабельные области как легкой, так и тяжелой цепей, такие как Fv, одноцепочечный Fv (scFv), стабилизированный дисульфидом Fv (dsFv), Fab, Fab' и F(ab')₂, или фрагменты антител, содержащие Fc-область антитела.

Используемые здесь термины «определяющая комплементарность область» или «CDR» используются взаимозаменяемо для обозначения антигенсвязывающих областей, представленных в вариабельной области полипептидов тяжелой и легкой цепей. Как правило, антитела содержат по три CDR в каждой из VH (CDR H1 или H1; CDR Н2 или Н2; и CDR Н3 или Н3) и по три в каждой из VL (CDR L1 или L1; CDR L2 или L2; и CDR L3 или L3).

Идентичность аминокислотных остатков в конкретном антителе, которые составляют вариабельную область или CDR, можно определить с использованием методов, хорошо известных в данной области, включая такие методы, как вариабельность последовательности, в соответствии с определением Kabat et al. (см., например, Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological hiterest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C.), расположение областей структурных петель, в соответствии с определением Chothia et al. (см., например, Chothia et al., Nature 342:877-883, 1989), компромиссного метода между Kabat и Chothia с использованием программного обеспечения для моделирования антител Oxford Molecular AbM (теперь Accelrys®, см. Martin et al., 1989, Proc. Natl Acad Sci USA, 86: 9268 и на веб-сайте www.bioinf-org.uk/abs), а также доступны методы для сложных кристаллических структур, охарактеризованных определением контакта (см. MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745, 1996) и методы «конформационного определения» (см., например, Makabe et al., Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166, 2008).

Используемые здесь термины «вариабельные области» и «CDR» могут относиться к вариабельным областям и CDR, охарактеризованным любым известным в данной области подходом, включая комбинации подходов и методов.

В соответствии с конкретными вариантами осуществления настоящего изобретения идентичность аминокислотных остатков в антителе, которые составляют вариабельную область и/или CDR, определяют по выведенной аминокислотной последовательности транслируемого кодирующего гена.

Функциональные фрагменты антител, содержащие целые или по существу целые вариабельные области как легкой цепи, так и тяжелой цепи, определяются следующим образом:

(i) Fv, определяемый как генетически сконструированный фрагмент, состоящий из вариабельной области легкой цепи (VL) и вариабельной области тяжелой цепи (VH), представленный в виде двух цепей;

(ii) одноцепочечный Fv («scFv»), генетически сконструированная одноцепочечная молекула, содержащая вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, соединенных подходящим полипептидным линкером в виде генетически слитой одноцепочечной молекулы.

(iii) дисульфид-стабилизированный Fv («dsFv»), генетически сконструированное антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, соединенных генетически сконструированной дисульфидной связью.

(iv) Fab, фрагмент молекулы антитела, содержащий моновалентную антигенсвязывающую часть молекулы антитела, который может быть получен путем обработки полноразмерного антитела ферментом папаином с получением интактной легкой цепи и фрагмента Fd тяжелой цепи, состоящего из их вариабельных доменов и доменов СН1;

(v) Fab', фрагмент молекулы антитела, содержащий моновалентную антигенсвязывающую часть молекулы антитела, который может быть получен путем обработки полноразмерного антитела ферментом пепсином с последующим восстановлением (из одной молекулы антитела получают два фрагмента Fab');

(vi) F(ab')₂, фрагмент молекулы антитела, содержащий моновалентную антигенсвязывающую часть молекулы антитела, который может быть получен путем обработки полноразмерного антитела ферментом пепсином (т.е. димер из фрагментов Fab', соединенных вместе двумя дисульфидными связями);

(vii) однодоменные антитела или нанотела состоящие из отдельных доменов VH или VL, которые проявляют достаточную аффинность к антигену; и

(viii) Fcab, фрагмент молекулы антитела, содержащий Fc-часть антитела, полученный в виде антигенсвязывающего домена путем придания антигенсвязывающей способности Fc-области антитела.

Согласно одному конкретному варианту осуществления настоящего изобретения антитело представляет собой scFv.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения антитело представляет собой scFv, который стабилизирован за счет слияния со связывающим мальтозу белком Е. coli, также известное как MBP-scFv, описанное, например, в Bach Н, et al. J Mol Biol. (2001) Sep 7;312(l):79-93, а также ниже в разделе «Примеры».

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения антитело представляет собой антитело IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgD или IgE.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения антитело представляет собой антитело IgG.

Согласно одному конкретному варианту осуществления настоящего изобретения изотип антитела представляет собой IgG1 или IgG4.

Антитело может быть моноспецифическим (способным распознавать один эпитоп или белок), биспецифическим (способным связывать два эпитопа или белка) или мультиспецифическим (способным распознавать несколько эпитопов или белков).

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения антитело представляет собой моноспецифическое антитело.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения антитело является полиспецифическим, например биспецифическим, триспецифическим, тетраспецифическим.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения антитело является биспецифическим антителом.

Биспецифические антитела, также известные как бифункциональные антитела, имеют по меньшей мере один сайт распознавания антигена для первого антигена и по меньшей мере один сайт распознавания антигена для второго антигена. Такие антитела могут быть получены способами рекомбинантной ДНК или химическими способами, известными в данной области. Химически созданные биспецифические антитела включают, но без ограничения, антитела, которые были восстановлены и преобразованы таким образом, чтобы сохранить свои бивалентные характеристики, и антитела, которые были химически связаны, чтобы они имели по меньшей мере два сайта распознавания антигена для каждого антигена. Биспецифические антитела включают все антитела или конъюгаты антител, или полимерные формы антител, которые способны распознавать два разных антигена.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения антитело представляет собой моноклональное антитело.

Способы получения антител, а также их фрагментов хорошо известны в данной области (см., например, руководство Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988, содержание которого включено в настоящее описание посредством ссылки).

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения антитело получают рекомбинантно в клетках млекопитающих.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения антитело получают рекомбинантно в бактериях.

Фрагменты антител могут быть получены обычными способами расщепления полноразмерных антител пепсином или папаином. Например, фрагменты антител могут быть получены путем ферментативного расщепления антител пепсином с получением 5S-фрагмента, обозначаемого как F(ab')₂. Этот фрагмент может быть дополнительно расщеплен с использованием тиолового восстанавливающего агента и, необязательно, блокирующей группы для сульфгидрильных групп, образующихся в результате расщепления дисульфидных связей, с получением моновалентных фрагментов 3,5S Fab'. Альтернативно, ферментативное расщепление с использованием пепсина дает непосредственно два моновалентных фрагмента Fab' и фрагмент Fc. Эти способы описаны, например, Goldenberg, в патентах США №№4036945 и 4331647, включая приведенные в них ссылки, содержание которых полностью включено в настоящий документ посредством ссылки. См. также Porter, R.R. [Biochem. J. 73: 119-126 (1959)]. Другие методы расщепления антител, такие как разделение тяжелых цепей с образованием моновалентных фрагментов легкой цепи и тяжелой цепи, дополнительное расщепление фрагментов или другие ферментативные, химические или генетические методы, также могут быть использованы при условии, что полученные фрагменты связываются с антигеном, который распознается интактным антителом.

Фрагменты Fv содержат ассоциацию цепей VH и VL. Эта ассоциация может быть нековалентной, как описано mbar et al. [Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659-62 (1972)]. Альтернативно, вариабельные цепи могут быть связаны межмолекулярной дисульфидной связью или сшиты химическими веществами, такими как глутаровый альдегид. Фрагменты Fv предпочтительно содержат цепи VH и VL, соединенные пептидным линкером. Эти одноцепочечные антигенсвязывающие белки (sFv) получают путем конструирования структурного гена, содержащего последовательности ДНК, кодирующие домены VH и VL, соединенные олигонуклеотидом. Структурный ген встраивают в вектор экспрессии, который затем вводят в клетку-хозяина, такую как Е. coli. Рекомбинантные клетки-хозяева синтезируют одну полипептидную цепь с линкерным пептидом, соединяющим два V домена. Способы получения sFv описаны, например, в Whitlow and Filpula, Methods 2: 97-105 (1991); Bird et al., Science 242:423-426 (1988), Pack et al., Bio/Technology 11:1271-77 (1993) и в патенте США №4946778, содержание которых полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

Другая форма фрагмента антитела представляет собой пептид, кодирующий одну определяющую комплементарность область (CDR). Пептиды CDR («минимальные единицы распознавания») могут быть получены путем конструирования генов, кодирующих CDR интересующего антитела. Такие гены получают, например, с помощью полимеразной цепной реакции для синтеза вариабельной области из РНК клеток, продуцирующих антитела. См., например, Larrickand Fry [Methods, 2: 106-10 (1991)].

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения антитело представляет собой химерное антитело.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения антитело представляет собой гуманизированное антитело. Гуманизированные формы антител, происходящих не от человека (например, мышиных антител), представляют собой химерные молекулы иммуноглобулинов, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина, происходящего не от человека. Гуманизированные антитела включают иммуноглобулины человека (реципиентное антитело), в которых остатки, образующие определяющую комплементарность область (CDR) реципиента, заменены остатками из CDR вида, отличного от человека (донорное антитело), такого как мышь, крыса или кролик, имеющие желаемую специфичность, аффинность и связывающую емкость. В некоторых случаях каркасные остатки Fv человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими остатками, происходящими не от человека. Гуманизированные антитела могут также содержать остатки, которые не обнаружены ни в реципиентном антителе, ни в импортированных последовательностях CDR или каркаса. Как правило, гуманизированное антитело будет содержать по существу по меньшей мере один, а обычно два вариабельных домена, в которых все или по существу все области CDR соответствуют областям иммуноглобулина, происходящего не от человека, и все или по существу все области FR относятся к консенсусной последовательности человеческого иммуноглобулина. Оптимально, когда гуманизированное антитело также содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, иммуноглобулина человека [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op.Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].

Способы гуманизации антител, происходящих не от человека, хорошо известны в данной области. Как правило, гуманизированное антитело содержит один или несколько аминокислотных остатков, введенных в него из источника, который не является человеком. Эти аминокислотные остатки часто называют импортными остатками, которые обычно берут из импортного вариабельного домена. Гуманизация по существу может быть осуществлена по методу Винтера [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], путем замены CDR грызунов или последовательностей CDR грызунов на соответствующие последовательности антитела человека. Соответственно, такие гуманизированные антитела представляют собой химерные антитела (см. патент США №4816567), которые существенно меньше, чем антитела с интактным вариабельным доменом человека за счет замены на соответствующую последовательность от вида, не относящегося к человеку. На практике гуманизированные антитела обычно представляют собой антитела человека, в которых некоторые остатки CDR и, возможно, некоторые остатки FR заменены остатками из аналогичных областей антител грызунов.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения антитело представляет собой человеческое антитело.

Человеческие антитела также могут быть получены с использованием различных способов, известных в данной области, включая библиотеки фагового дисплея [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et. al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991); Bitton A, Nahary L, Benhar I. Methods Mol Biol. 1701:349-363 (2018)]. Методы, предложенные в публикациях Cole et al. и Boerner et al., также доступны для получения человеческих моноклональных антител (см. Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985) и Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86). - 95 (1991)]. Аналогично, человеческие антитела могут быть получены путем введения локусов иммуноглобулина человека трансгенным животным, например мышам, у которых гены эндогенного иммуноглобулина частично или полностью инактивированы. Наблюдаемый ответ на такие антитела у человека во всех отношениях очень похож на ответ на человеческие антитела, включая реаранжировку генов, сборку и репертуар антител. Этот подход описан, например, в патентах США №№5545807, 5545806, 5569825, 5625126, 5633425, 5661016, а также в следующих научных публикациях: Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368 812-13 (1994); Fishwild et al.., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (199). 6); и Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13, 65-93 (1995).

Следует понимать, что нацеливание на конкретный компартмент внутри клетки может быть достигнуто с использованием внутриклеточных антител (также известных как «интратела»). По существу, это SCA, к которым добавлены сигналы внутриклеточной локализации (например, такие как ER, митохондриальные, ядерные, цитоплазматические). Эта технология успешно применялась в данной области техники (см. обзор в Richardson and Marasco, 1995, TIBTECH vol. 13). Было показано, что интратела практически устраняют экспрессию рецепторов клеточной поверхности, которых, в противном случае, было бы много, и они ингибируют функцию белка внутри клетки (см., например, Richardson et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3137-3141; Deshane et al., 1994, Gene Ther. 1: 332-337; Marasco et al., 1998 Human Gene Ther 9: 1627-42; Shaheen et al., 1996 J. Virol. 70: 3392-400; Werge, Т.M. et al., 1990, FEBS Letters 274:193-198; Carlson, J.R. 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7427-7428; Biocca, S. et al., 1994, Bio/Technology 12: 396-399; Chen, S-Y. et al., 1994, Human Gene Therapy 5:595-601; Duan, Letal., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5075-5079; Chen, S-Y. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5932-5936; Beerli, R.R. et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:23931-23936; Mhashilkar, A.M. et al., 1995, EMBO J. 14:1542-1551; публикацию PCT №WO 94/02610, Marasco et al.; и публикацию PCT№WO 95/03832, Duan et al.).

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения антитело представляет собой внутриклеточное антитело, поскольку IDE экспрессируется на клеточной поверхности, а также в цитозоле, пероксисомах и эндосомах.

В этом отношении было показано, что внутриклеточные антитела могут блокировать транслокацию белков в соответствующий компартмент, ингибируя тем самым их активность (см., например, Boldicke J. Cell. Mol. Med. Vol 11, No 1, 2007, p.54-70; Persic et al. Gene 187 (1997) 1-8; и Shaki-Loewenstein et al. Journal of Immunological Methods 303 (2005) 19-39). Таким образом, внутриклеточное антитело в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения не обязательно должно ингибировать внутреннюю каталитическую активность IDE как таковую.

Для получения вектора экспрессии внутриклеточного антитела сначала выделяют кДНК, кодирующую легкую и тяжелую цепи антитела, специфичные в отношении интересующего белка-мишени, обычно из гибридомы, которая секретирует моноклональное антитело, специфичное в отношении APLP1. Гибридомы, секретирующие моноклональные антитела против APLP1 или рекомбинантные моноклональные антитела, могут быть получены с использованием способов, известных в данной области. Как только моноклональное антитело, специфичное к белку APLP1, идентифицировано (например, моноклональное антитело, полученное из гибридомы, или рекомбинантное антитело из комбинаторной библиотеки), то стандартными методами молекулярной биологии выделяют ДНК, кодирующие легкую и тяжелую цепи моноклонального антитела. Для гибридомных антител кДНК легкой и тяжелой цепи могут быть получены, например, с помощью ПЦР-амплификации или скрининга библиотеки кДНК. Для рекомбинантных антител, таких как из библиотеки фагового дисплея, кДНК, кодирующие легкую и тяжелую цепи, могут быть извлечены из упаковки дисплея (например, фага), выделенной в процессе скрининга библиотеки, и определены нуклеотидные последовательности генов легкой и тяжелой цепей антитела. Например, многие такие последовательности описаны в Kabat, Е. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, и в базе данных последовательностей зародышевой линии человека "Vbase". После получения последовательности легкой и тяжелой цепи антитела клонируют в рекомбинантный вектор экспрессии с использованием стандартных методов.

Для цитоплазматической экспрессии легкой и тяжелой цепей удаляют нуклеотидные последовательности, кодирующие гидрофобные лидеры легкой и тяжелой цепей. Вектор экспрессии внутриклеточного антитела может кодировать внутриклеточное антитело в одной из нескольких различных форм. Например, в одном варианте осуществления настоящего изобретения вектор кодирует легкую и тяжелую цепи полноразмерного антитела, так что полноразмерное антитело экспрессируется внутриклеточно. В другом варианте осуществления изобретения вектор кодирует полноразмерную легкую цепь и только область VH/CH1 тяжелой цепи, и при этом Fab-фрагмент экспрессируется внутриклеточно. В другом варианте осуществления изобретения вектор кодирует одноцепочечное антитело (scFv), в котором вариабельные области легкой и тяжелой цепей связаны гибким пептидным линкером [например, (Gly₄Ser)₃], и экспрессируются в виде одноцепочечной молекулы. Чтобы ингибировать активность APLP1 в клетке, вектор экспрессии, кодирующий внутриклеточное антитело, вводят в клетку стандартными методами трансфекции, как обсуждалось выше.

В некоторых вариантах осуществления предложенное в настоящем документе антитело может быть функционально связано с агентом, проникающим в клетку. Используемая здесь фраза «агент, проникающий в клетку» относится к агенту, который усиливает транслокацию антитела через клеточную мембрану.

Типичным агентом, проникающим в клетку, является пептид, проникающий в клетку.

Используемый здесь термин «пептид, проникающий в клетку» представляет собой пептид, содержащий короткую (приблизительно 12-30 остатков) аминокислотную последовательность или функциональный мотив, который придает свойства независимой от энергии (т.е. неэндоцитотической) транслокации, связанные с транспортом мембранопроницаемого комплекса через плазматическую и/или ядерную мембраны клетки. Пептид, проникающий в клетку, используемый в мембранопроницаемом комплексе, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения предпочтительно содержит по меньшей мере один нефункциональный остаток цистеина, который либо свободен, либо дериватизирован с образованием дисульфидной связи с двухцепочечной рибонуклеиновой кислотой, которая была изменена для такой связи. Репрезентативные аминокислотные мотивы, придающие такие свойства, описаны в патенте США№6348185, содержание которого полностью включено в настоящий документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления изобретения пептиды, проникающие в клетку, могут включать, но без ограничения, пенетратин, транспортан, plsl, ТАТ(48-60), pVEC, MTS и MAP.

Дополнительно или альтернативно в качестве агентов, проникающих в клетки, можно использовать липидные частицы, такие как липосомы.

Липосомы включают любую синтетическую (т.е. не встречающуюся в природе) структуру, состоящую из липидных бислоев, которые охватывают внутренний объем. Липосомы включают эмульсии, пены, мицеллы, нерастворимые монослои, жидкие кристаллы, дисперсии фосфолипидов, пластинчатые слои и подобные структуры. Липосомы могут быть получены любым из известных в данной области методов [Monkkonen, J. et al., 1994, J. Drug Target, 2:299-308; Monkkonen, J. et al., 1993, Calcif. Tissue Int., 53:139-145; Lasic D.D., Liposomes Technology Inc., Elsevier, 1993, 63-105. (chapter 3); Winterhalter M, Lasic D D, Chem Phys Lipids, 1993 September; 64(1-3):35-43]. Липосомы могут быть положительно заряжены, нейтральны или отрицательно заряжены.

Любой метод, известный в данной области техники, может быть использован для включения антитела в липосому, как описано, например, Alfonso et al., [The science and practice of pharmacy, Mack Publishing, Easton Pa 19th ed., (1995)], и как описано Kulkarni et al., [J. Microencapsul. 1995, 12 (3) 229-46].

Для определения липосом, которые особенно подходят в соответствии с настоящим изобретением, может быть проведен скрининговый анализ, такой как анализы, описанные в публикации патента США №20040266734 и в заявке на выдачу патента США №20040266734; а также см. Danenberg et al., Journal of cardiovascular pharmacology 2003, 42:671-9; Circulation 2002, 106:599-605; Circulation 2003, 108:2798-804.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения антитела для некоторых вариантов осуществления изобретения получают следующим образом. Очищенный IDE используют для выделения клонов специфических одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv), которые распознают эпитопы IDE человека. Для этого применяют технику фагового дисплея с использованием библиотеки фагового дисплея синтетических антител человека. В частности, используют библиотеку scFv человека, например, библиотеку Ronit 1 [описана в публикации Azriel-Rosenfeld et al. J Mol Biol. (2004) 335(1):177-192, содержание которой полностью включено в настоящее описание посредством ссылки]. Библиотеку подвергают истощению в отношении неспецифических белков и белков, очищенных из бактерий, с использованием аффинных колонок, и проводят отбор с использованием рекомбинантной IDE человека дикого типа (WT) (SEQ ID NO: 50). В течение нескольких циклов (например, двух циклов) обогащенный фаг истощают (т.е. осуществляют отрицательный отбор) на мутантном IDE (например, E111Q) для обогащения по положительным фагам, которые распознают IDE дикого типа или, в соответствии с другим конкретным вариантом осуществления изобретения, которые распознают мутантный IDE. За каждой из этих стадий истощения следует стадия отбора (т.е. положительного отбора) в отношении IDE WT. После циклов аффинной селекции отбирают и выращивают отдельные клоны инфицированных бактерий. Затем фаги из каждого клона тестируют (например, с помощью ELISA) на связывание IDE с неспецифическими белками в качестве отрицательного контроля. Положительные клоны анализируют с помощью ПЦР-амплификации с последующим обнаружением различных клонов методом «отпечатков пальцев», а затем секвенируют для проверки целостности и различий между клонами.

Важной особенностью выделения антител в некоторых вариантах осуществления изобретения является стадия селекции. Таким образом, в соответствии с одним вариантом осуществления изобретения способ получения антитела предусматривает (а) получение множества антител (например, как описано выше); и (b) скрининг антител для выбора антител, которые связываются с IDE дикого типа и немутантным IDE, обладающим сниженной каталитической активностью по сравнению с IDE дикого типа.

После получения антител их можно проверить на активность. Методы тестирования активности антител включают, например, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и анализ разрушения инсулина in vitro.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения антитела тестируют в отношении ингибирующей активности в отношении IDE. Ингибирующая активность в отношении IDE относится к специфическому подавлению ферментативной активности IDE. Например, IC50 для IDE находится в диапазоне 10-200 нМ (например, 1-100 нМ, 1-50 нМ, 1-20 нМ или 1-10 нМ), как определено для пептида ADT-21, ингибирующего IDE.

В соответствии с типичными вариантам осуществления настоящего изобретения антитело способно подавлять активность по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или не менее чем на 100% ферментативной активности IDE.

В соответствии с типичными вариантами осуществления настоящего изобретения антитело способно подавлять активность по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или не менее чем на 100% разрушающей инсулин активности IDE.

Согласно одному конкретному варианту осуществления настоящего изобретения антитело способно подавлять по меньшей мере на 50% разрушающей инсулин активности IDE.

В соответствии с иллюстративными вариантами осуществления антитело способно снижать разрушающую инсулин активность IDE на 5-10%, на 10-20%, на 20-30%, на 30-40%, на 40-50%, на 50-60%, на 60-70%, на 70-80%, на 80-90%, на 90-100%, на 10-50%, на 50-100% или на 10-100%.

В соответствии с типичными вариантами осуществления антитело способно снижать активность IDE, так что IDE разлагает инсулин со скоростью, соответствующей разрушению 1 мкмоля человеческого инсулина за одну минуту человеческим рекомбинантным IDE в количестве 25-50 мкмоль, 25-75 мкмоль 25-100 мкмоль, 50-75 мкмоль, 50-100 мкмоль или 75-100 мкмоль.

Как отмечено выше, в соответствии с конкретными вариантам осуществления настоящего изобретения антитела (например, одноцепочечные Fv) могут быть получены с помощью технологии рекомбинантной ДНК, посредством которой нуклеиновую кислоту антитела лигируют в вектор экспрессии, который затем вводят в клетку-хозяина.

Таким образом, в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения предлагается выделенный полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело в соответствии с некоторыми вариантам осуществления настоящего изобретения.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения последовательность нуклеиновой кислоты антитела содержит последовательности SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, aggaataata SEQ ID NO: 15.

Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения последовательность нуклеиновой кислоты антитела содержит последовательности SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, gatgcatcc и SEQ ID NO: 31.

Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения последовательность нуклеиновой кислоты антитела содержит последовательности SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, gacaatgat и SEQ ID NO: 47.

Неограничивающие примеры последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих легкую цепь, тяжелую цепь, CDR и вариабельные области, составляющие антитело, которые можно использовать с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения, представлены в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 41.

Таким образом, в соответствии с конкретными вариантам осуществления настоящего изобретения полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 41, где каждый выбор представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

Используемый здесь термин «полинуклеотид» или «последовательность нуклеиновой кислоты» относится к последовательности одноцепочечной или двухцепочечной нуклеиновой кислоты, которая выделена и предоставлена в виде последовательности РНК, комплементарной полинуклеотидной последовательности (кДНК), геномной полинуклеотидной последовательности и/или составных полинуклеотидных последовательностей (например, как комбинация вышеперечисленных последовательностей).

Для экспрессии экзогенного антитела в клетках млекопитающих полинуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, предпочтительно лигируют в конструкцию нуклеиновой кислоты, пригодную для экспрессии в клетках млекопитающих.

Таким образом, в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения предлагается конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая выделенный полинуклеотид.

Такая конструкция нуклеиновой кислоты или система включает по меньшей мере один цис-действующий регуляторный элемент для направления экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты. Цис-действующие регуляторные последовательности включают такие последовательности, которые управляют конститутивной экспрессией нуклеотидной последовательности, а также те, которые управляют индуцируемой экспрессией нуклеотидной последовательности только при определенных условиях. Так, например, в конструкцию нуклеиновой кислоты включают промоторную последовательность для управления транскрипцией полинуклеотидной последовательности в клетке конститутивным или индуцируемым образом. Следует отметить, что последовательности нуклеиновых кислот по изобретению могут также использоваться для применения в условиях in vivo, когда их вводят субъекту, нуждающемуся в этом (например, субъекту с диабетом), в виде «голой» ДНК, или когда ее лигируют в конструкцию нуклеиновой кислоты, пригодную для генной терапии, например, в вирусный вектор.

Также предлагаются клетки-хозяева, которые содержат полинуклеотиды/векторы экспрессии, как описано в настоящем документе.

Такие клетки обычно выбирают для повышенной экспрессии рекомбинантных белков (например, бактериальные, растительные или эукариотические клетки, например, клетки СНО, HEK-293), но они также могут быть иммунными клетками (например, макрофагами, дендритными клетками, Т-клетками, В-клетками или NK-клетками), когда, например, CDR субъекта имплантируют в Т-клеточный рецептор, или когда CAR трансдуцируют в указанные клетки, которые затем используют в адоптивной клеточной терапии.

Таким образом, в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения предлагается способ получения антитела против IDE, предусматривающий экспрессию полинуклеотидной/экспрессирующей конструкции в клетке-хозяине.

Тем не менее, когда антитело продуцируют в условиях in vitro, то в соответствии с конкретными вариантам осуществления настоящего изобретения извлечение или выделение рекомбинантного антитела осуществляют после соответствующего времени культивирования. Выражение «извлечение рекомбинантного антитела» или «выделение рекомбинантного антитела» относится к сбору всей ферментационной среды, содержащей антитело, и не обязательно подразумевает дополнительные стадии выделения или очистки. Альтернативно, «извлечение рекомбинантного антитела» или «выделение рекомбинантного антитела» относится к извлечению продукта из лизата клеток-продуцентов. Несмотря на вышеизложенное, антитела в соответствии с некоторыми вариантам осуществления настоящего изобретения могут быть очищены с использованием различных стандартных методов очистки белков, таких как, но без ограничения, аффинная хроматография, ионообменная хроматография, фильтрация, электрофорез, хроматография гидрофобного взаимодействия, гель-фильтрационная хроматография, обращенно-фазовая хроматография, хроматография с конканавалином А, хроматофокусирование и дифференциальная солюбилизация. Согласно одному конкретному варианту осуществления настоящего изобретения антитело очищают по меньшей мере на 80%, на 85%, на 90%, на 95% или на 97%. Используемый здесь термин «очищенный» означает, что композиция, содержащая очищенное антитело, не содержит других белковых веществ, которые не являются представляющим интерес антителом.

С использованием описанной здесь методологии, как описано ниже в разделе «Примеры», был получен ряд анти-IDE антител.

Таким образом, в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения предлагается выделенное антитело, содержащее область распознавания антигена, которая включает аминокислотные последовательности определяющей комплементарность области (CDR), указанные в SEQ Ш NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, RNNh SEQ ID NO: 16.

В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8 расположены в последовательном порядке (от N к С, как CDR 1-3, соответственно) на тяжелой цепи антитела, в то время как SEQ ID NO: 12, RNNh SEQ ID NO: 16 расположены в последовательном порядке (от N к С, как CDR 1-3, соответственно) на легкой цепи антитела.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения тяжелая цепь антитела содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, например, на 100%, гомологична или идентична аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2.

Таким образом, в соответствии с аспектом настоящего изобретения предлагается выделенное антитело, содержащее область распознавания антигена, которая включает аминокислотные последовательности определяющей комплементарность области (CDR), указанные в SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, DASh SEQ ID NO: 32.

Согласно одному конкретному варианту осуществления настоящего изобретения SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 24 расположены в последовательном порядке (от N к С, как CDR 1-3, соответственно) на тяжелой цепи антитела, в то время как SEQ ID NO: 28, DASh SEQ ID NO: 32 расположены в последовательном порядке (от N к С, как CDR 1-3, соответственно) на легкой цепи антитела.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения тяжелая цепь антитела содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, например, на 100% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 18.

Таким образом, в соответствии с аспектом настоящего изобретения предлагается выделенное антитело, содержащее область распознавания антигена, которая содержит аминокислотные последовательности определяющей комплементарность области (CDR), указанные в SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, DND и SEQ ID NO: 48.

Согласно одному конкретному варианту осуществления настоящего изобретения SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 40 расположены в последовательном порядке (от N к С, как CDR 1-3, соответственно) на тяжелой цепи антитела, тогда как SEQ ID NO: 44, DND и SEQ ID NO: 48 расположены в последовательном порядке (от N к С, как CDR 1-3, соответственно) на легкой цепи антитела.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения тяжелая цепь антитела содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, например, на 100% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 34.

Гомология (например, процент гомологии, идентичность+сходство) может быть определена с использованием любого программного обеспечения для сравнения гомологии, включая, например, программное обеспечение BlastP или TBLASTN Национального центра биотехнологической информации (NCBI), например, с использованием параметров по умолчанию, когда поиск начинается с полипептидной последовательности; или алгоритм tBLASTX (доступный от NCBI), например, с использованием параметров по умолчанию, в котором сравнивают продукты концептуальной шестирамочной трансляции нуклеотидной последовательности запроса (обе цепи) с базой данных белковых последовательностей.

Например, параметры по умолчанию для tBLASTX включают: максимальное количество целевых последовательностей: 100; ожидаемый порог: 10; размер слова: 3; максимальное количество совпадений в диапазоне запроса: 0; параметры оценки: матрица - BLOSUM62; фильтры и маскирование: фильтр - области низкой сложности.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения антитела могут быть использованы для лечения заболевания, связанного с активностью IDE, у субъекта, нуждающегося в этом.

Таким образом, в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения предлагается способ лечения заболевания, связанного с активностью IDE, у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающий введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела (ii) или (iii), как описано в настоящем документе, обеспечивая тем самым предотвращение или лечение заболевания, связанного с активностью IDE.

В соответствии с дополнительным или альтернативным аспектом настоящего изобретения предлагается антитело (ii) или (iii), раскрытое в настоящем документе, для применения при лечении заболевания, связанного с активностью IDE, у субъекта, нуждающегося в этом.

В этом отношении, как отмечалось выше, поскольку IDE экспрессируется на клеточной поверхности, а также в цитозоле, пероксисомах и эндосомах, антитело в соответствии с некоторыми вариантам осуществления настоящего изобретения, способное проникать в клетки (либо внутриклеточное антитело, либо антитело, функционально связанное с агентом, проникающим в клетку) может ингибировать активность IDE, блокируя его транслокацию в нужный компартмент; и, таким образом, для лечения заболевания, связанного с активностью IDE, не обязательно ингибировать внутреннюю каталитическую активность IDE как таковую.

Таким образом, в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения предлагается способ лечения заболевания, связанного с активностью IDE, у субъекта, нуждающегося в этом, где способ предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела, включающего область распознавания антигена, которая специфически связывается с IDE, где указанный домен распознавания антигена содержит аминокислотные последовательности CDR, представленные в:

(i) SEQ ID NO: 4 (CDR1), SEQ ID NO: 6 (CDR2) и SEQ ID NO: 8 (CDR3), последовательно расположенные от N до С на тяжелой цепи указанного антитела; и SEQ ID NO: 12 (CDR1), RNN(CDR2) и SEQ ID NO: 16 (CDR3), расположенные последовательно от N до С на легкой цепи указанного антитела;

(ii) SEQ ID NO: 20 (CDR1), SEQ ID NO: 22 (CDR2) и SEQ ID NO: 24 (CDR3), последовательно расположенные от N до С на тяжелой цепи указанного антитела; и SEQ ID NO: 28 (CDR1), DAS(CDR2) и SEQ ID NO: 32 (CDR3), последовательно расположенные от N до С на легкой цепи указанного антитела; или

(iii) SEQ ID NO: 36 (CDR1), SEQ ID NO: 38 (CDR2) и SEQ ID NO: 40 (CDR3), последовательно расположенные от N до С на тяжелой цепи указанного антитела; и SEQ ID NO: 44 (CDR1), DND(CDR2) и SEQ ID NO: 48 (CDR3), последовательно расположенные от N до С на легкой цепи указанного антитела,

где, когда указанное антитело представляет собой антитело (iii), указанное антитело представляет собой внутриклеточное антитело или антитело, которое функционально связано с агентом, проникающим в клетку,

обеспечивая тем самым предотвращение или лечение заболевания, связанного с активностью IDE.

В соответствии с дополнительным или альтернативным аспектом настоящего изобретения предлагается антитело, содержащее область распознавания антигена, которая специфически связывается с IDE, где указанный домен распознавания антигена содержит аминокислотные последовательности CDR, представленные в:

(i) SEQ ID NO: 4 (CDR1), SEQ ID NO: 6 (CDR2) и SEQ ID NO: 8 (CDR3), последовательно расположенные от N до С на тяжелой цепи указанного антитела; и SEQ ID NO: 12 (CDR1), RNN(CDR2) и SEQ ID NO: 16 (CDR3), расположенные последовательно от N до С на легкой цепи указанного антитела;

(ii) SEQ ID NO: 20 (CDR1), SEQ ID NO: 22 (CDR2) и SEQ ID NO: 24 (CDR3), последовательно расположенные от N до С на тяжелой цепи указанного антитела; и SEQ ID NO: 28 (CDR1), DAS(CDR2) и SEQ ID NO: 32 (CDR3), последовательно расположенные от N до С на легкой цепи указанного антитела; или

(iii) SEQ ID NO: 36 (CDR1), SEQ ID NO: 38 (CDR2) и SEQ ID NO: 40 (CDR3), последовательно расположенные от N до С на тяжелой цепи указанного антитела; и SEQ ID NO: 44 (CDR1), DND(CDR2) и SEQ ID NO: 48 (CDR3), последовательно расположенные от N до С на легкой цепи указанного антитела,

где, когда указанное антитело представляет собой антитело (iii), указанное антитело представляет собой внутриклеточное антитело или антитело, функционально связанное с агентом, проникающим в клетку,

для применения при лечении заболевания, связанного с активностью IDE, у субъекта, нуждающегося в этом.

Используемый здесь термин «заболевание, связанное с активностью ГОЕ» относится к медицинскому состоянию, заболеванию или синдрому, при котором активность IDE способствует его возникновению или прогрессированию.

Как упоминалось выше, IDE представляет собой фермент, который расщепляет множество небольших белков различной последовательности, включая инсулин, амилоидный β-белок (Аβ), глюкагон, амилин, предсердный натрийуретический фактор и кальцитонин. Таким образом, в ситуациях, когда повышенные уровни этих субстратов могут способствовать облегчению симптомов и даже излечению заболевания, можно использовать антитела согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения.

Согласно одному конкретному варианту осуществления настоящего изобретения для лечения заболевания или расстройства требуется повышение уровней инсулина.

Такие заболевания и расстройства включают, но без ограничения, аутоиммунные заболевания центральной нервной системы, нейродегенеративные заболевания, метаболический синдром, диабет, ожирение, гипергликемию, поражение сетчатки, почечную недостаточность, повреждение нерва, повреждение микрососудов, инфекцию вируса ветряной оспы (VZV) и раны. Используемый здесь термин «аутоиммунное заболевание центральной нервной системы» относится к заболеванию, при котором иммунная система организма атакует собственную нервную систему (предпочтительно ЦНС).

Примеры аутоиммунных заболеваний ЦНС включают, но без ограничения, рассеянный склероз, синдром Гийена-Барре, миастенический синдром Ламберта-Итона, миастению гравис, поперечный миелит, прогрессирующую многоочаговую лейкоэнцефалопатию, хроническую головную боль, церебральный паралич, волчанку, иммунную мышечную дисфункцию с расстройством центральной нервной системы, первичный васкулит ЦНС, аутоиммунная дегенерация мозжечка, атаксию походки с полинейропатией позднего возраста (GALOP), оптиконейромиелит, синдром скованности и HTLV-1-ассоциированную миелопатию (НАМ)/тропический спастический парапарез (TSP).

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения аутоиммунное заболевание центральной нервной системы выбрано из группы, состоящей из рассеянного склероза, синдрома Гийена-Барре, миастенического синдрома Ламберта-Итона, миастении гравис, поперечного миелита, прогрессирующей многоочаговой лейкоэнцефалопатии, хронической головной боли и церебрального паралича.

Согласно одному конкретному варианту осуществления настоящего изобретения аутоиммунное заболевание центральной нервной системы включает рассеянный склероз (PC).

Используемый здесь термин «нейродегенеративное заболевание» относится к нарушению, заболеванию или состоянию нервной системы (предпочтительно ЦНС), которое характеризуется постепенной и прогрессирующей потерей нервной ткани нейротрансмиттерной или нервной функции.

Примеры нейродегенеративного расстройства включают, но без огранияения, боковой амиотрофический склероз (ALS или болезнь Лу Герига), аутоиммунный энцефаломиелит, дегенеративные заболевания нервов, энцефалит (например, энцефалит Расмуссена), болезнь Альцгеймера, эпилепсию, генетические нарушения головного мозга, инсульт, болезнь Паркинсона и болезнь Гентингтона.

Согласно одному конкретному варианту осуществления настоящего изобретения нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь Паркинсона.

Согласно одному конкретному варианту осуществления настоящего изобретения нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения заболевание выбирают из группы, состоящей из метаболического синдрома, диабета и ожирения.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения заболевание представляет собой метаболический синдром.

Используемый здесь термин «метаболический синдром» относится к группе или кластеру метаболических состояний [абдоминальное ожирение, повышенный уровень глюкозы натощак, «дислипидемия» (т.е. повышенный уровень липидов) и повышенное кровяное давление (НВР)], которые возникают вместе чаще, чем случайно, и они вместе способствуют развитию диабета 2 типа и сердечно-сосудистых заболеваний. Метаболический синдром характеризуется специфическим липидным профилем с повышенным уровнем триглицеридов, сниженным уровнем холестерина с липопротеидами высокой плотности (холестерин ЛПВП), и, в некоторых случаях, умеренно повышенным уровнем холестерина с липопротеидами низкой плотности (холестерин ЛПНП), а также ускоренным прогрессированием атеросклеротического заболевания из-за воздействия компонентов факторов риска.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения заболевание представляет собой диабет.

Используемый здесь термин «диабет» относится к заболеванию, возникающему либо в результате абсолютного дефицита инсулина (диабет 1 типа) из-за дефекта биосинтеза или выработки инсулина, либо в результате относительного дефицита инсулина при наличии резистентности к инсулину (диабет 2 типа), т.е. нарушения действия инсулина в организме. Таким образом, у больного сахарным диабетом имеется абсолютный или относительный дефицит инсулина, и среди других симптомов и признаков у него может проявляться повышенная концентрация глюкозы в крови, присутствие глюкозы в моче, обильное выделение мочи (полиурия), повышенная жажда (полидипсия) и повышенное чувство голода (полифагия). При диабете 1 типа симптомы могут развиваться довольно быстро (например, в течение нескольких недель или месяцев), особенно у детей. Однако при диабете 2 типа симптомы могут развиваться намного медленнее и могут быть малозаметными или полностью отсутствовать. Диабет (оба типа) также может вызывать быструю, но значительную потерю веса (несмотря на нормальное или даже усиленное питание) и непреодолимую умственную усталость. Диабет, рассматриваемый здесь, охватывает любую стадию или тип диабета, включая, но без ограничения, явный диабет, преддиабет и латентный аутоиммунный диабет взрослых (LADA).

Согласно конкретным вариантам осуществления диабет представляет собой диабет 1 типа.

В соответствии с другими конкретными вариантам осуществления настоящего изобретения диабет представляет собой диабет 2 типа.

Примеры заболеваний, связанных с диабетом, включают, но без ограничения, диабет I типа, диабет II типа, гестационный диабет, резистентность к инсулину, ожирение, гипергликемию, заболевания глаз (например, глаукому, катаракту), кожные инфекции, гипертонию, гастропарез, кетоацидоз (DKA), невропатию (например, диабетическую невропатию), гиперосмолярный гипергликемический некетотический синдром (HHNS), заболевание почек (нефропатия) и заболевание периферических артерий (PAD). Согласно другим конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения заболевание представляет собой рану.

Используемый здесь термин «рана» в широком смысле относится к повреждениям кожи и подкожной клетчатки, а также внутренних органов, инициированным любым из множества способов (например, пролежням в результате длительного постельного режима, ранам, вызванным травмой, ранам, полученным во время или после хирургической процедуры и т.п.) и с различными характеристиками. Типичные примеры ран включают, но без ограничения, ушибы, царапины, ожоговые раны, солнечные ожоги, резаные раны, эксцизионные раны, хирургические раны, некротизирующий фасцит, язвы, язвы венозного застоя, диабетические язвы, пролежни, афтозные язвы, пролежневые язвы, рубцы, очаговую алопецию, дерматит, аллергический контактный дерматит, атопический дерматит, брелоковый дерматит, пеленочный дерматит, дисгидротический дерматит, псориаз, экзему, эритему, бородавки, анальные бородавки, ангиому, старческую гемангиому, эпидермофитию стопы, атипичные родинки, базально-клеточную карциному, старческуюпурпуру Бейтмана, буллезный пемфигоид, кандидоз, хондродерматит завитка ушной раковины, невус Кларка, герпес, кондиломы, кисты, болезнь Дарье, дерматофиброму, дискоидную красную волчанку, нуммулярную экзему, атопическую экзему, дисгидротическую экзему, экзему рук, мультиформную узелковую эритему, болезнь Фордайса, келоидалльный затылочный фолликулит, кольцевидную гранулему, болезнь Гровера, потницу, простой герпес, опоясывающий герпес (опоясывающий лишай), гнойный гидраденит, крапивницу, гипергидроз, ихтиоз, импетиго, фолликулярный кератоз, келоиды, кератоакантому, красный плоский лишай, плоский лишай, подобный кератозу, простой хронический лишай, склерозирующий лишай, лимфоматоидный папулез, кожную волчанку, болезнь Лайма, полосатый лишай, миксоидные кисты, фунгоидный микоз, контагиозный моллюск, родинки, грибок ногтей, липоидный некробиоз, диабетический дерматит, нумулярный дерматит, онихошизию, онихомикоз, лихеноидный лишай, розовый лишай, отрубевидный лишай, подошвенные бородавки, дерматит, вызванный контактом с ядовитым плющом, дерматит, вызванный контактом с ядовитым дубом, дисгидроз, пс ев до фолликулит бороды, зуд Ани и белый отрубевидный лишай. Раны обычно классифицируют по одной из четырех степеней тяжести в зависимости от глубины раны: (i) степень I: раны, ограниченные эпителием; (ii) степень II: раны, проникающие в дерму; (iii) степень III: раны, проникающие в подкожную клетчатку; и (iv) степень IV (или полнослойные раны): раны, при которых обнажены кости (например, точка давления кости, такой как большой вертел бедренной кости или крестец).

Используемый здесь термин «неполнослойная рана» относится к ранам степени I-III; примеры неполнослойных ран включают ожоговые раны, пролежни, язвы венозного застоя и диабетические язвы.

Используемый здесь термин "глубокая рана" включает раны степени III и степени IV.

Используемый здесь термин «хроническая рана» относится к ране, которая не зажила в течение тридцати дней.

Термин «заживление» по отношению к ране относится к процессу заживления раны, например, путем образования рубца (в иллюстративных вариантах осуществления изобретения заживление происходит без образования фиброзной ткани).

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения некоторые варианты композиций по изобретению способствуют процессу заживления, т.е. ускоряют процесс заживления.

Фраза «индуцирование или ускорение процесса заживления кожной раны» относится либо к индукции образования грануляционной ткани при стягивании раны, либо к индукции эпителизации (т.е. генерации новых клеток в эпителии). Заживление раны удобно измерять по уменьшению площади раны.

Конкретные варианты осуществления настоящего изобретения предусматривают лечение всех типов ран, включая глубокие раны, острые раны, хронические раны, диабетические раны, ишемические раны, язвы, ожоги и хирургические раны.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения рана выбрана из группы, состоящей из хронической раны, острой раны, диабетической раны, ишемической раны, язвы, ожога и хирургической раны.

Дополнительные заболевания и расстройства, которые можно лечить в соответствии с конкретными вариантам осуществления настоящего изобретения, включают, но без ограничения, гиперосмолярную некетоническую кому, вирусную инфекцию [например, инфекцию вируса ветряной оспы (VZV)], атеросклероз, гипертензию, сердечно-сосудистые заболевания, такие как врожденные пороки сердца, кардиомиопатию, аортальный стеноз, дефект межпредсердной перегородки (ASD), дефект атриовентрикулярного (A-V) канала, дефект артериального протока, стеноз легочной артерии, субаортальный стеноз, дефект межжелудочковой перегородки (VSD), заболевания клапанов, инфаркт миокарда, туберозный склероз, склеродермию, осложнения при трансплантации, эндометриоз, фертильность, синдром фон Хиппеля-Линдау (VHL), цирроз печени, расстройства, связанные с трансплантацией, гемофилию, гиперкоагуляцию, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, иммунодефициты, пигментный ретинит, аутосомно-доминантный пигментный ретинит, аутосомно-рецессивный пигментный ретинит, мпондилометаэпифизарная дисплазия (SEMD) пакистанского типа, урофациальный синдром, болезнь накопления эфиров холестерина, дистрофия роговицы по типу Тиля-Бенке, синдром Дубина-Джонсона, лейкоз, Т-клеточный острый лимфоцитарный, Т-клеточную острую лимфоцитарную лейкемию, спиноцеребеллярную атаксию с инфантильным началом с сенсорной невропатией, раздельную аномалию кисти/стопы типа 3, замедленный метаболизм толбутамида, чувствительность к варфарину, болезнь Вольмана, мезенхимальную дисгенезию переднего сегмента с катарактой, врожденную катаракту, нейрофибросаркому, повреждение сетчатки, такое как непролиферативная диабетическая ретинопатия (NPDR) и пролиферативная диабетическая ретинопатия (PDR), хроническую почечную недостаточность, диабетическую нефропатию, повреждение нерва, такое как диабетическая невропатия, повреждение микрососудов, связанные с диабетической язвой стопы и реакцией «трансплантат против хозяина».

Термин «лечение» относится к ингибированию, предотвращению или остановке развития патологии (заболевания, расстройства или состояния) и/или к уменьшению, ремиссии или регрессии патологии. Специалистам в данной области техники понятно, что для оценки развития патологии можно использовать различные методологии и анализы, и аналогичным образом можно также использовать различные методологии и анализы для оценки уменьшения, ремиссии или регрессии патологии. Следует понимать, что лечение можно проводить отдельно как таковое или в сочетании с другими видами лечения.

Используемый здесь термин «профилактика» относится к недопущению возникновения заболевания, расстройства или состояния у субъекта, который может подвергнуться риску заболевания, но у которого еще не диагностировано заболевание.

Используемый здесь термин «субъект» относится к субъекту-млекопитающему (например, человеку) любого пола и любого возраста, включая новорожденных, младенцев, детей, подростков, взрослых и пожилых людей.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения у субъекта диагностировано вышеуказанное медицинское состояние, субъект страдает вышеуказанным медицинским состоянием или субъект предрасположен к вышеуказанным медицинским состояниям.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения субъект имеет уровень IDE выше заданного порога в биологическом образце по сравнению с контрольным биологическим образцом, как дополнительно описано ниже.

Следовательно, в соответствии с конкретными вариантам осуществления настоящего изобретения способ, раскрытый в настоящем документе, предусматривает определение уровня IDE в биологическом образце от субъекта, при применении антитела, раскрытого здесь, перед его введением.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения антитела можно вводить субъекту как таковые или как часть фармацевтической композиции.

В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента антитело (ii) или (iii), раскрытое здесь, и фармацевтически приемлемый носитель.

Используемый здесь термин «фармацевтическая композиция» относится к препарату из одного или нескольких активных ингредиентов, описанных здесь, с другими химическими компонентами, такими как физиологически подходящие носители и эксципиенты. Назначение фармацевтической композиции состоит в облегчении введения соединения в организм.

Используемый здесь термин «активный ингредиент» относится к мультиспецифическим антителам, ответственным за биологический эффект.

В дальнейшем выражения «физиологически приемлемый носитель» и «фармацевтически приемлемый носитель», которые могут использоваться взаимозаменяемо, относятся к носителю или разбавителю, который не вызывает значительного раздражения в организме, и которые не ухудшают биологической активности и свойств вводимого соединения. Адъювант также охватывается этими выражениями.

Используемый здесь термин «эксципиент» относится к инертному веществу, добавляемому к фармацевтической композиции для дополнительного облегчения введения активного ингредиента. Примеры эксципиентов, но без ограничения, включают карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара и типы крахмалов, производные целлюлозы, желатин, растительные масла и полиэтиленгликоли.

Способы изготовления и методы введения лекарственных средств можно найти в справочнике «Remington's Pharmaceutical Sciences», Mack Publishing Co., Easton, PA, последнее издание, содержание которого включено в настоящее описание посредством ссылки.

Подходящие пути введения могут, например, включать пероральный, ректальный, транс мукозальный, особенно транс назальный, кишечный или парентеральный путь введения, включая внутримышечные, подкожные и интрамедуллярные инъекции, а также интратекальные, прямые внутрижелудочковые, внутривенные, внутрибрюшинные, интраназальные или внутриглазные инъекции.

Альтернативно, фармацевтическую композицию можно вводить не системно, а локально, например, путем инъекции фармацевтической композиции непосредственно в определенную область ткани пациента.

Согласно одному конкретному варианту осуществления настоящего изобретения антитело вводят трансназально.

Согласно одному конкретному варианту осуществления настоящего изобретения антитело вводят подкожно.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения фармацевтические композиции могут быть изготовлены способами, хорошо известными в данной области техники, например, с помощью обычных процессов смешивания, растворения, гранулирования, приготовления драже, порошка, эмульгирования, инкапсулирования, включения/иммобилизации или лиофилизации.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения фармацевтические композиции для применения в соответствии с некоторыми вариантами изобретения могут быть изготовлены обычным образом с использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей, включая эксципиенты и вспомогательные вещества, используемые в фармацевтике, которые облегчают обработку активных ингредиентов при изготовлении лекарственных препаратов. Соответствующий состав препарата зависит от выбранного пути введения.

Активные ингредиенты фармацевтической композиции для инъекции могут быть представлены в виде водных растворов, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хенкса, раствор Рингера или физиологический солевой буфер. Для введения препарата через слизистую оболочку в его составе используются пенетранты, выбранные в соответствии с барьером, через который необходимо проникнуть. Такие обычные пенетранты известны в данной области техники.

Фармацевтическую композицию для перорального введения можно легко изготовить путем объединения активных соединений с фармацевтически приемлемыми носителями, хорошо известными в данной области. Такие носители позволяют изготавливать фармацевтическую композицию в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и т.п. для перорального приема пациентом. Фармакологические препараты для перорального введения могут быть изготовлены с использованием твердого эксципиента, с необязательным измельчением полученной смеси и обработки гранул смеси после добавления подходящих вспомогательных веществ, если их присутствие является желательным, с получением ядер таблеток или драже. Подходящими эксципиентами являются, в частности, наполнители, такие как сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; препараты целлюлозы, такие как метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натрийкарбометилцеллюлоза; крахмалы, такие как, например, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал; желатин, трагакантовая камедь; и/или физиологически приемлемые полимеры, такие как поливинилпирролидон (PVP). При желании могут быть добавлены дезинтегранты, такие как сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота или ее соль, такая как альгинат натрия.

На ядра драже наносят подходящие покрытия. Для этой цели можно использовать концентрированные растворы сахаров, которые могут необязательно содержать гуммиарабик, тальк, поливинилпирролидон, гель карбопола, полиэтиленгликоль, диоксид титана, растворы лаков для глазури и подходящие органические растворители или смеси растворителей. Красители или пигменты могут быть добавлены в состав покрытий таблеток или драже для их идентификации или для обозначения различных доз и комбинаций активного соединения.

Фармацевтические композиции, которые можно вводить перорально, включают твердые капсулы, изготовленные из желатина, а также мягкие герметичные капсулы, изготовленные из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит.Твердые капсулы могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителем, таким как лактоза, со связующими веществами, такими как крахмалы, смазывающими веществами, такими как тальк или стеарат магния, и, необязательно, стабилизаторами. В мягких капсулах активные ингредиенты могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как жирные масла, жидкий парафин или жидкие полиэтиленгликоли. Кроме того, могут быть добавлены стабилизаторы. Все препараты для перорального введения должны быть представлены в дозировках, подходящих для выбранного пути введения.

Для трансбуккального введения композиции могут иметь форму таблеток или пастилок, изготовленных обычным образом.

Для введения путем назальной ингаляции активные ингредиенты для применения в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения удобно представлять в форме аэрозольного спрея из емкости под давлением или из распылителя, с использованием подходящего пропеллента, например дихлордифтор метана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана или диоксида углерода. В случае использования аэрозоля из емкости под давлением стандартная дозировка может быть обеспечена за счет использования клапана для подачи отмеренного количества. Капсулы и картриджи, например, из желатина, для использования в дозирующем устройстве, могут быть изготовлены таким образом, чтобы содержать порошкообразную смесь соединения и подходящую порошковую основу, такую как лактоза или крахмал.

Описанная здесь фармацевтическая композиция может быть изготовлена в форме для парентерального введения, например такого, как путем болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Препараты для инъекций могут быть представлены в виде единичной дозированной формы, например, в ампулах, или могут быть представлены в многодозовых контейнерах с необязательно добавленным консервантом. Композиции могут представлять собой суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных носителях, и они могут содержать рецептурные агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты.

Фармацевтические композиции для парентерального введения включают водные растворы активных ингредиентов в водорастворимой форме. Кроме того, активные ингредиенты могут быть представлены в виде подходящих суспензий для инъекций на масляной или водной основе. Подходящие липофильные растворители или носители включают жирные масла, такие как кунжутное масло, или сложные эфиры синтетических жирных кислот, такие как этилолеат, триглицериды, или липосомы. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, повышающие вязкость суспензии, такие как натрийкарбоксиметилцеллюлозу, сорбит или декстран. Суспензия может необязательно содержать подходящие стабилизаторы или агенты, повышающие растворимость активных ингредиентов, что позволяет получать высококонцентрированные растворы.

Альтернативно, активный ингредиент может быть представлен в форме порошка для разведения его перед применением подходящим носителем, например, стерильным апирогенным раствором на водной основе.

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения фармацевтическая композиция также может быть изготовлена в виде ректальных композиций, таких как суппозитории или удерживаемые микроклизмы, с использованием, например, обычных основ для суппозиториев, таких как масло какао или другие глицериды.

Фармацевтические композиции, пригодные для использования в контексте некоторых вариантов осуществления изобретения, включают композиции, в которых активные ингредиенты представлены в количестве, эффективном для достижения намеченной цели. Более конкретно, терапевтически эффективное количество означает количество активных ингредиентов (т.е. антитела), эффективное для предотвращения, облегчения или улучшения симптомов расстройства (например, заболеваний, связанных с IDE) или для продления жизни субъекта, проходящего лечение.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективное количество приводит к повышению уровня инсулина в крови субъекта после введения.

В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективное количество приводит к уменьшению разрушения бета-клеток поджелудочной железы у субъекта после введения.

В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективное количество приводит к повышению уровней инсулинового фактора роста 1 (IGF1) в крови субъекта после введения.

Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективное количество приводит к снижению секреции IL-17 из Т-лимфоцитов субъекта после введения.

В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективное количество приводит к снижению секреции IFN-γ из Т-лимфоцитов субъекта после введения.

Оценка уровней инсулина, IGF1, IL-17 или IFN-γ может быть проведена с использованием любого метода, известного специалисту в данной области, включая, например, ELISA.

Оценку разрушения бета-клеток поджелудочной железы можно проводить с использованием любого метода, известного специалисту в данной области, включая, например, измерение функции β-клеток (например, путем измерения уровней метаболических маркеров, таких как С-пептид) или путем визуализации массы β-клеток [например, с помощью эмиссионной томографии (PET) или с помощью однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (SPECT)], как описано в публикации Lebastchi J. and Herold K.С, Cold Spring Harb Perspect Med. June 2012; 2(6): a007708, содержание которой включено сюда посредством ссылки.

Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективное количество приводит к ингибированию или снижению активности IDE. Снижение или ингибирование активности IDE может включать по меньшей мере приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% снижения активности IDE. Оценка снижения активности IDE может быть выполнена с использованием любого метода, известного специалисту в данной области, включая, например, флуорометрический анализ активности IDE или анализы деградации инсулина и IGF-1 in vitro, как подробно описано ниже в разделе «Примеры».

Определение терапевтически эффективного количества находится в пределах компетенции специалистов в данной области, особенно в свете подробного описания, представленного здесь.

Для любого препарата, используемого в способах настоящего изобретения, терапевтически эффективное количество или доза могут быть первоначально оценены на основании анализов in vitro и клеточных культур. Например, доза может быть оценена на основании результатов, полученных на животных моделях, для достижения желаемой концентрации или титра. Такая информация может быть использована для более точного определения доз, пригодных для применения у человека.

Токсичность и терапевтическую эффективность описанных здесь активных ингредиентов можно определить стандартными фармацевтическими процедурами in vitro, в клеточных культурах или на экспериментальных животных. Данные, полученные в результате анализов in vitro и клеточных культур, а также исследований на животных, можно использовать для определения диапазона доз, приемлемых для человека. Дозы могут варьироваться в зависимости от используемой лекарственной формы и используемого пути введения. Точный состав, способ введения и дозы могут быть выбраны врачом в зависимости от состояния пациента. См., например, Fingl, et al., 1975, в справочнике «The Pharmacological Basis of Therapeutics», Ch. 1 p.1.

Величина дозы и интервал введений могут быть скорректированы индивидуально, чтобы обеспечить уровни активного ингредиента в плазме, достаточные для индукции или подавления биологического эффекта (минимальная эффективная концентрация, МЕС). Величина МЕС будет варьироваться для каждого препарата, но ее можно оценить по данным in vitro. Дозы, необходимые для достижения МЕС, будут зависеть от индивидуальных особенностей и пути введения. Для определения концентрации в плазме можно использовать анализы обнаружения.

В зависимости от тяжести состояния, подлежащего лечению, и восприимчивости, дозирование может быть однократным или многократным, при этом курс лечения длится от нескольких дней до нескольких недель или до тех пор, пока не будет достигнуто излечение или уменьшение тяжести состояния при заболевании.

Количество вводимой композиции будет, конечно, зависеть от субъекта, который подвергается лечению, тяжести заболевания, способа введения, решения лечащего врача и т.п.

Например, в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения антитело по изобретению можно вводить внутривенно (в/в) в дозе от 0,1 мг/кг до 10 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 5 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 1 мг/кг, от 1 мг/кг до 10 мг/кг, от 1 мг/кг до 5 мг/кг, 2,5 мг/кг до 5 мг/кг, от 0,5 мг/кг до 5 мг/кг или в дозе от 5 мг/кг до 10 мг/кг. Согласно другому варианту осуществления изобретения антитело по изобретению можно вводить внутривенно в дозе от 10 мг/кг до 100 мг/кг, от 10 мг/кг до 50 мг/кг, от 25 мг/кг до 50 мг/кг или в дозе от 50 мг/кг до 100 мг/кг. Согласно еще одному варианту осуществления изобретения антитело по изобретению можно вводить внутривенно в дозе от 100 мг/кг до 1000 мг/кг, от 100 мг/кг до 500 мг/кг, от 250 мг/кг до 500 мг/кг или в дозе от 500 мг/кг до 1000 мг/кг.

Следует понимать, что существуют животные модели, с помощью которых можно протестировать антитела по изобретению перед лечением человека. Например, STZ-индуцируемая модель диабета или модель диабета без ожирения (NOD) у мышей может быть использована в качестве модели диабета. Животные модели рассеянного склероза включают, например, мышиную модель ЕАЕ (например, индукцию заболевания у мышей NOD путем их иммунизации MOG (35-55) в CFA). Животные модели болезни Альцгеймера включают, например, мышиную модель APP/PSI и крысиную модель болезни Альгреймера (крысы Samaritan Alzheimer's доступны от Samaritan Pharmaceuticals). Для процесса заживления ран можно использовать модель с раной у диабетической мыши, как описано ранее в Galeano et al., Diabetes. (2004) 53(9):2509-17 (содержание включено сюда посредством ссылки), или может быть использована модель на крысах с диабетом, как описано ранее в Qiu et al., J Surg Res. (2007) 138(l):64-70 (содержание включено сюда посредством ссылки). Животные модели болезни Паркинсона включают, например, мышей А53Т Tg, экспрессирующих человеческий мутантный альфа-синуклеин в нейронах ЦНС (Giasson et al. 2002) и C57BU6-Tg(Thy1-SNCA*E35K*E46K*E61K)3798Nuber/J (Nuber et al., 2018).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиции, при желании, могут быть представлены в виде набора или в дозирующем устройстве, таком как одобренный FDA набор, который может содержать одну или несколько единичных дозированных форм, содержащих активный ингредиент.Например, набор в виде упаковки может содержать металлическую или пластиковую фольгу, такую как блистерная упаковка. Упаковка или дозирующее устройство могут сопровождаться инструкциями по применению. На упаковку или дозирующее устройство также может быть нанесено уведомление, связанное с этим контейнером, в форме, предписанной государственным органом, регулирующим производство, использование или продажу фармацевтических или ветеринарных препаратов. Такое уведомление, например, может быть маркировкой, одобренной Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) для отпускаемых по рецепту лекарств, или листком-вкладышем для одобренного продукта. Композиции, содержащие препарат по изобретению в совместимом фармацевтическом носителе, также могут быть изготовлены и помещены в соответствующий контейнер с маркировкой, касающейся лечения указанного состояния, как подробно описано выше.

Следует понимать, что терапевтические композиции по изобретению могут содержать, помимо антител, другие известные лекарственные средства или терапевтические средства для лечения заболеваний, связанных с IDE (например, диабета, аутоиммунных заболеваний ЦНС, нейродегенеративных заболеваний), таких как, но без ограничения, стероиды, кортикостероиды, иммунодепрессанты, антигистаминные препараты и т.п. Эти лекарства могут быть включены в набор в одной или в отдельных упаковках.

Следовательно, в соответствии с аспектом настоящего изобретения предлагается изделие, предназначенное для лечения заболевания, связанного с активностью IDE, содержащее антитело (ii) или (iii), раскрытое здесь, и терапевтическое средство для лечения указанного заболевания.

Согласно конкретным вариантам реализации антитело и терапевтическое средство находятся в отдельных контейнерах.

В соответствии с другими конкретными вариантами осуществления антитело и терапевтическое средство представлены вместе в составе одного препарата.

Кроме того, в соответствии с конкретными вариантами осуществления способы и применения, раскрытые в настоящем документе, дополнительно предусматривают введение субъекту терапевтического средства (отличного от антител, раскрытых в настоящем документе) для лечения заболевания.

Как показано ниже в разделе «Примеры», авторы настоящего изобретения разработали высокочувствительный анализ ELISA с использованием полученных антител, и использовали этот анализ ELISA для демонстрации сильной корреляции между уровнями IDE в сыворотке человека и наличием и/или тяжестью метаболического синдрома. Следовательно, конкретные варианты осуществления настоящего изобретения дополнительно предусматривают анализ уровня IDE с целью диагностики, мониторинга лечения и/или определения эффективности лечения.

Следовательно, в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения предлагается способ диагностики заболевания, связанного с активностью IDE, у субъекта, предусматривающий определение уровня IDE в биологическом образце от субъекта с использованием описанного здесь антитела, при этом, когда указанный уровень указанного IDE превышает заданный порог по сравнению с контрольным биологическим образцом, у субъекта диагностируется заболевание.

Используемый здесь термин «диагностика» относится к определению наличия или отсутствия патологии (например, рака, относящегося к опухолям семейства Юинга), к классификации патологии или симптома, к определению тяжести патологии (например, степени или стадии), к мониторингу прогрессирование патологии, к прогнозированию исхода патологии и/или перспективы выздоровления и к скринингу субъекта в отношении конкретного заболевания.

Следовательно, в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения предлагается способ прогнозирования заболевания, связанного с активностью IDE, у субъекта, предусматривающий определение уровня IDE в биологическом образце от субъекта, у которого диагностировано заболевание, с использованием антитела по изобретению, и при этом, когда указанный уровень указанного IDE превышает заданный порог по сравнению с контрольным биологическим образцом, то прогноз является неблагоприятным.

В соответствии с конкретными вариантам осуществления настоящего изобретения указанный способ (например, определение, приведение в контакт) осуществляется in vitro или ex vivo.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения указанный способ предусматривает получение биологического образца перед указанным определением.

Неограничивающие примеры биологических образцов, которые можно использовать с некоторыми вариантам осуществления настоящего изобретения, включают клетку или клетки, полученные при биопсии любой ткани, ткань, орган, клетку крови, клетку костного мозга, жидкости организма, такие как кровь, сыворотка, плазма и промывная жидкость, которые могли контактировать с пораженными клетками/тканью.

Биологический образец может быть получен с использованием способов, известных в данной области техники, таких как использование шприца с иглой, скальпеля, тонкоигольной биопсии, пункционной биопсии, толстоигольной биопсии, тонкоигольной аспирационной биопсии (FNA), хирургической биопсии, буккального мазка, лаважа и подобных способов.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения молекулы белка экстрагируют из биологического образца от субъекта. Таким образом, в соответствии с конкретными вариантам осуществления настоящего изобретения способ дополнительно предусматривает экстракцию белка из биологического образца перед определением. Способы выделения белковых молекул из биологических образцов хорошо известны в данной области.

Используемое здесь выражение «заданный порог» или «заданное пороговое значение» относится к уровню IDE, который характеризует здоровый образец или образец с известным прогнозом в отношении заболевания, такого же происхождения и который анализируют в тех же условиях. Такой уровень может быть определен экспериментально путем сравнения образцов с известными уровнями IDE (например, образцов, полученных от здоровых субъектов или от субъектов с известным прогнозом в отношении заболевания) с образцами, полученными от субъектов, у которых диагностировано заболевание, связанное с активностью IDE. В качестве альтернативы такой уровень можно получить из данных в научной литературе и из баз данных.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения заданное пороговое значение получают из контрольного образца.

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения можно использовать несколько контрольных образцов.

Поскольку биологические характеристики зависят, среди прочего, от вида и возраста, предпочтительно, чтобы контрольный образец был получен от субъекта того же вида, возраста, пола и из той же субпопуляции (например, курящих/некурящих субъектов).

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения контрольный образец содержит биологический образец того же типа, что и биологический образец от субъекта.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения контрольный образец представляет собой контрольный образец от здорового человека.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения контрольный образец представляет собой образец от субъекта, страдающего легким заболеванием или заболеванием с хорошим прогнозом.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения контрольный образец получают из данных в научной литературе или из базы данных.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения увеличение/уменьшение выше или ниже заданного порога является статистически значимым.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения заданный порог по меньшей мере в 1,5, по меньшей мере в 2, по меньшей мере в 3, по меньшей мере в 5, по меньшей мере в 10 или по меньшей мере в 20 раз отличается от уровня IDE в контрольном образце, измеренным с использованием того же анализа, такого как вестерн-блоттинг, ELISA, IP.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения заданный порог по меньшей мере в 1,5 раза превышает уровень IDE в контрольном образце.

Согласно конкретным вариантам осуществления заданный порог составляет по меньшей мере 2%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, например, 100%, по меньшей мере 200%, по меньшей мере 300%, по меньшей мере 400%, по меньшей мере 500%, по меньшей мере 600% от уровня IDE в контрольном образце.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения уровень IDE может быть определен в биологическом образце с использованием любого метода, известного в данной области техники, в котором используются описанные здесь антитела, такого как, помимо прочего, ELISA, вестерн-блоттинг, IP.

Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантам осуществления настоящего изобретения определение уровня IDE проводят путем контакта с биологическим образцом, тканью, клеткой или их фракциями или экстрактами с описанным здесь антителом.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения контактирование осуществляют в условиях, которые обеспечивают образование комплекса, включающего IDE, который присутствует в биологическом образце, и антитело (т.е. с получением иммунокомплекса).

Иммунокомплекс может образовываться при различных температурах, концентрациях солей и значениях рН, которые могут варьировать в зависимости от используемого метода и биологического образца, и специалисты в данной области техники способны подобрать условия, подходящие для образования каждого иммунокомплекса.

Таким образом, в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения предлагается композиция, содержащая биологический образец от субъекта (или лизат биологического образца от субъекта), у которого диагностировано заболевание, связанное с активностью IDE, и раскрытое здесь антитело по изобретению.

В соответствии с дополнительным или альтернативным аспектом настоящего изобретения предлагается изделие, содержащее биологический образец от субъекта (или лизат биологического образца от субъекта), у которого диагностировано заболевание, связанное с активностью IDE, и раскрытое здесь антитело по изобретению в отдельном контейнере.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения композиция или изделие дополнительно содержат ингибитор протеазы.

Согласно одному конкретному варианту осуществления настоящего изобретения композиция или изделие дополнительно содержат вторичное антитело, способное связываться с антителом по изобретению.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения раскрытое здесь антитело по изобретению связано с поддающимся обнаружению компонентом.

Примеры поддающихся обнаружению компонентов, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают, но без ограничения, радиоактивные изотопы, фосфоресцентные химические вещества, хемилюминесцентные химические вещества, флуоресцентные химические вещества, ферменты, флуоресцентные полипептиды, радиоактивный изотоп (такой как ¹²⁵йод) и эпитопные метки. Поддающийся обнаружению компонент может быть членом пары связывания, который идентифицируется посредством его взаимодействия с дополнительным членом пары связывания, или меткой, которая непосредственно визуализируется. В одном примере метка представляет собой флуоресцентный белок или фермент, вызывающий колориметрическую реакцию.

Примеры подходящих флуорофоров включают, но без ограничения, фикоэритрин (РЕ), изотиоцианат флуоресцеина (FITC), Су-хром, родамин, зеленый флуоресцентный белок (GFP), синий флуоресцентный белок (BFP), техасский красный, РЕ-Су5 и подобные. Дополнительные рекомендации по выбору флуорофоров и методам связывания флуорофоров с различными типами молекул см. в документах Richard P. Haugland, "Molecular Probes: Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 1992-1994", 5th ed., Molecular Probes, Inc. (1994); патент США №6037137, Oncoimmunin Inc.; Hermanson, "Bioconjugate Techniques", Academic Press New York, N.Y. (1995); Kay M. et al., 1995. Biochemistry 34:293; Stubbs et al., 1996. Biochemistry 35:937; Gakamsky D. et al., "Evaluating Receptor Stoichiometry by Fluorescence Resonance Energy Transfer" в монографии "Receptors: A Practical Approach," 2nd ed., Stanford C. and Horton R. (eds.), Oxford University Press, UK. (2001); патент США №6350466, Targesome, Inc.

К антителу могут быть присоединены многочисленные типы ферментов, например, пероксидаза хрена (HPR), бета-галактозидаза и щелочная фосфатаза (АР).

Примеры поддающихся обнаружению компонентов, используемых для идентификации, включают, но без ограничения, зеленый флуоресцентный белок, щелочную фосфатазу, пероксидазу, гистидиновую метку, биотин, оранжевый флуоресцентный белок и стрептавидин.

Дополнительные примеры поддающихся обнаружению компонентов включают компоненты, обнаруживаемые с помощью позитронно-эмиссионной томографии (PET) и магнитно-резонансной томографии (МРТ), все из которых хорошо известны специалистам в данной области.

В соответствии с некоторыми вариантам осуществления настоящего изобретения поддающийся обнаружению компонент конъюгирован путем трансляционного слияния полинуклеотида, кодирующего раскрытое здесь антитело, с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей обнаруживаемый компонент.

Дополнительно или альтернативно поддающийся обнаружению компонент может быть химически конъюгирован (связан) с раскрытым здесь антителом, с использованием любого метода конъюгации, известного специалисту в данной области.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения раскрытые здесь способы предусматривают подтверждение диагноза, используя для этого современную технику. Такие способы известны в данной области и зависят от типа заболевания, и они включают, в качестве неограничивающего примера, анализы уровня сахара в крови, проводимых натощак, или анализы уровня А1 с в крови для выявления диабета.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения способ диагностики дополнительно предусматривает лечение субъекта с установленным диагнозом эффективным количеством средства для лечения заболевания.

Таким образом, в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения предлагается способ лечения заболевания, связанного с активностью IDE, у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающий:

(a) диагностику субъекта согласно указанному способу; и при этом, когда указанный уровень указанного IDE превышает указанный заданный порог, то осуществляют

(b) лечение указанного субъекта терапией в отношении заболевания, обеспечивая тем самым лечение заболевания у субъекта.

Поскольку авторы настоящего изобретения показали, что IDE является прогностическим маркером метаболического синдрома, то уровень IDE можно использовать для выбора режима лечения (например, типа, дозы), подходящего для субъекта. То есть заболевание с плохим прогнозом лечат с помощью схемы лечения, подходящей для плохого прогноза; в то время как заболевание с хорошим прогнозом лечат с помощью режима лечения, подходящего для хорошего прогноза. Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения уровень IDE может указывать на вероятность того, как субъект ответит на данную терапию.

Таким образом, в соответствии с дополнительным или альтернативным аспектом настоящего изобретения предлагается способ лечения заболевания, связанного с активностью IDE, у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающий:

(a) диагностику субъекта согласно способу по изобретению; и при этом, когда указанный уровень указанного IDE превышает указанный заданный порог, то осуществляют

(b) выбор терапии на основе уровня указанного IDE, обеспечивая тем самым лечение заболевания у субъекта.

В соответствии с дополнительным или альтернативным аспектом настоящего изобретения предлагается способ лечения заболевания, связанного с активностью IDE, у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающий:

(a) осуществление прогнозирования в отношении субъекта согласно способу по изобретению; и

(b) осуществление лечения указанного субъекта терапией в соответствии с прогнозом.

В соответствии с дополнительным или альтернативным аспектом настоящего изобретения предлагается способ лечения заболевания, связанного с активностью IDE, у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающий:

(a) осуществление прогнозирования в отношении субъекта согласно способу по изобретению; и

(b) выбор терапии в соответствии с прогнозом.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения терапия включает использование антитела (ii) или (iii), описанных здесь.

В соответствии с дополнительным или альтернативным аспектом настоящего изобретения предлагается способ мониторинга эффективности терапии заболевания, связанного с активностью IDE, у субъекта, у которого диагностировано это заболевание, причем способ предусматривает определение уровня IDE в биологическом образец от субъекта, проходящего или прошедшего терапию с применением антитела, раскрытого здесь, при этом, когда указанный уровень указанного IDE снижается по отношению заданного порога после терапии, признается, что терапия эффективна.

Таким образом, снижение уровня IDE свидетельствует об эффективности терапии.

С другой стороны, если уровень IDE не изменился, или уровень IDE повысился, то признается, что терапия не эффективна при лечении заболевания, и следует использовать дополнительные и/или альтернативные методы лечения (например, схемы лечения).

Согласно конкретным вариантам осуществления аспектов изобретения в отношении мониторинга, как раскрыто здесь, заданный порог сравнивают с уровнем у субъекта до терапии.

Согласно конкретным вариантам осуществления аспектов изобретения в отношении мониторинга, как раскрыто здесь, заданный порог по меньшей мере в 1,5, по меньшей мере в 2, по меньшей мере в 3, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз или по меньшей мере в 20 раз отличается от уровня IDE в контрольном образце или у субъекта перед терапией, при измерении с использованием того же анализа, такого как ELISA, вестерн-блоттинг или IP.

Согласно одному конкретному варианту осуществления настоящего изобретения заданный порог по меньшей мере в 1,5 раза превышает уровень IDE в контрольном образце или у субъекта до терапии.

Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения заданный порог составляет по меньшей мере 2%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, например, 100%, по меньшей мере 200%, по меньшей мере 300%, по меньшей мере 400%, по меньшей мере 500%, по меньшей мере 600% от уровня IDE в контрольном образце или у субъекта перед терапией.

В соответствии с другими конкретными вариантами осуществления этого аспекта настоящего изобретения заданный порог может быть определен в подгруппе субъектов с известным исходом терапии.

В соответствии с еще одним дополнительным аспектом настоящего изобретения предлагается изделие, содержащее описанное здесь антитело, и в отдельном контейнере реагент, подходящий для ELISA, вестерн-блоттинга или IP, планшет для ELISA и/или положительный контрольный образец, содержащий IDE.

Используемый здесь термин «приблизительно» относится к ±10%.

Термины «содержит», «содержащий», «включает», «включающий», «имеющий» и их производные и связанные определения означают «включая, но не ограничиваясь указанным».

Термин «состоящий из» означает «включающий и ограниченный» указанным.

Термин «состоящий в основном из» означает, что композиция, способ или структура могут включать дополнительные элементы, ингредиенты, стадии и/или части, но только в том случае, если дополнительные элементы, ингредиенты, стадии и/или части не изменяют существенно основных и новых характеристик и свойств заявленного продукта, композиции, метода или структуры.

Используемые здесь формы единственного числа в отношении каких-либо объектов также включают эти объекты во множественном числе, если из контекста явно не следует иное. Например, термин «соединение» или «по меньшей мере одно соединение» может подразумевать множество соединений, включая их смеси.

Различные варианты осуществления настоящего изобретения, описанные здесь, могут быть охарактеризованы с использованием диапазона или интервала показателей. Следует понимать, что описание в формате диапазонов предназначено только для удобства и краткости, и оно не должно рассматриваться как жесткое ограничение объема изобретения. Соответственно, следует считать, что описание в виде диапазона конкретно раскрывает все возможные поддиапазоны, а также отдельные числовые значения в пределах этого диапазона. Например, описание диапазона, такого как от 1 до 6, должно рассматриваться как имеющее конкретно раскрытые поддиапазоны, такие как от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3. до 6 и т.д., а также отдельные числовые значения в этом диапазоне, например, 1, 2, 3, 4, 5 и 6. Это применимо независимо от величины диапазона.

Всякий раз, когда здесь указывается числовой диапазон, подразумевается, что он включает любое числовое значение (дробное или целое), находящееся в указанном диапазоне. Выражение «диапазон/интервал между» первым числом и вторым числом, также как и «диапазон/ интервал от» первого числа и «до» второго числа используются здесь взаимозаменяемо, и оно включают первое и второе указанные числа, а также все дробные и целые числа между ними.

Используемый здесь термин «способ» относится к действиям, средствам, методам и процедурам для выполнения данной задачи, включая, помимо прочего, действия, средства, методы и процедуры, которые либо известны, либо которые могут быть легко разработаны практикующими специалистами в области химии, фармакологии, биологии, биохимии и медицины на основе известных действий, средств, методов и процедур.

Понятно, что некоторые признаки изобретения, которые для ясности описаны в контексте отдельных вариантов его осуществления, также могут быть представлены в комбинации в рамках одного другого варианта осуществления изобретения. И наоборот, различные признаки изобретения, которые для краткости описаны в контексте одного варианта осуществления, также могут быть предоставлены по отдельности или в любой подходящей комбинации, или как подходящие для любого другого описанного варианта осуществления изобретения. Некоторые признаки, описанные в контексте различных вариантов осуществления, не должны рассматриваться как существенные признаки этих вариантов осуществления, за исключением случаев, когда такой вариант осуществления без этих элементов будет неработоспособным.

Различные варианты осуществления и аспекты настоящего изобретения, описанные выше и заявленные в формуле изобретения ниже, экспериментально поддержаны следующими примерами.

Примеры

Следующие примеры вместе с вышеприведенным описанием иллюстрируют изобретение, и не ограничивают его объем.

Как правило, используемая здесь номенклатура и лабораторные процедуры, используемые здесь, включают молекулярные, биохимические, микробиологические методы, а также методы рекомбинантных ДНК. Такие методы подробно описаны в литературе. См., например, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); методологии, изложенные в патентах США №№4666828; 4683202; 4801531; 5192659 и 5272057; в "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); доступные иммунологические анализы подробно описаны в патентной и научной литературе, см., например, патенты США №№3791932; 3839153; 3850752; 3850578; 3853987; 3867517; 3879262; 3901654; 3935074; 3984533; 3996345; 4034074; 4098876; 4879219; 5011771 и 5281521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, М. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, В., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol.1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); все они включены в настоящий документ посредством ссылки, как если бы их содержание было бы полностью изложено здесь. В описании настоящей заявки также приведены и другие общие ссылки. Считается, что описанные в них процедуры хорошо известны в данной области техники и эти ссылки представлены для удобства. Вся информация, содержащаяся в них, включена в настоящий документ посредством ссылки.

Материалы и методы

Мыши. Самцов мышей C57BL/6 (Jackson Laboratory) содержали в Тель-Авивском университете в специальной среде, свободной от патогенов. Все эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями Тель-Авивского университета (TAU), и они были одобрены Комитетом по уходу за животными TAU при исследованиях на животных.

Получение и экспрессия векторов IDE. Последовательности для рекомбинантного IDE человека (rhIDE) дикого типа (WT) и E111Q, оптимизированные для бактериальной экспрессии, были заказаны в Genewiz (Саут-Плейнфилд, Нью-Джерси, США), и они были помещены в вектор pUC57 в место между рестрикцией Nde I и Hind III. Вектор кодирует rhIDE, слитый с Ni-NTA, связывающий метку His (His tag), на его С-конце. Клетки Е. coli Rosetta BL21 трансформировали вектором экспрессии pET28a-rhIDE (WT и E111Q) и выращивали до OD_600нм=0,6-0,8 в 0,5 л среды LB с добавлением 25 мкг/мл канамицина. Затем культуру индуцировали для экспрессии белка с помощью 0,5 мМ IPTG в течение ночи при 30°С.Клетки собирали центрифугированием при 9000 об/мин в течение 15 минут. Осадок суспендировали в 35 мл PBS с 0,1% Triton Х-100, а затем лизировали с помощью 5 повторяющихся циклов 30-секундной обработки ультразвуком и 2-минутной паузы на льду. Растворимую фракцию осветляли центрифугированием при 12000 об/мин в течение 30 минут при 4°С, а затем загружали в колонку GE HisTrap объемом 5 мл. Колонку промывали 5 мМ имидазолом в PBS и элюировали 0,5 М имидазолом в PBS. Очищенный белок IDE подвергали диализу против PBS, разбавляли до 2 мг/мл в PBS и 5% глицерине и хранили при -80°С.

Биопэннинг.Технику фагового дисплея использовали с библиотекой фагового дисплея синтетических антител человека «Ronit 1», как описано ранее в Azriel-Rosenfeld et al. J Mol Biol. (2004) 335(1): 177-192. Библиотеку подвергали четырем циклам аффинной селекции с 10 мкг/мл rhIDE WT, который использовали для покрытия лунок 24-луночных планшетов в течение 2 часов при комнатной температуре, где IDE WT использовали в качестве затравки. В течение двух циклов (цикл 1 и цикл 3) проводили истощение с использованием в качестве затравки мутантного E111Q IDE для выделения антител, которые с высокой аффинностью связываются с каталитическим сайтом фермента WT. 10 мкг/мл мутантного IDE использовали для покрытия лунок 24-луночных планшетов в течение 2 часов при комнатной температуре. Лунки однократно промывали 3 мл PBS и блокировали в течение 1 часа при 37°С стерильным 3% обезжиренным молоком в PBS. Лунки промывали один раз 3 мл PBS и фаги вносили в заблокированную лунку, покрытую мутантным IDE, на 1 час при 25°С. Затем лунки, покрытые rhIDE WT, и блокированные аналогичным образом с использованием 3% обезжиренного молока в PBS, промывали один раз 3 мл PBS, и фаги с мутацией IDE (истощенные фаги) переносили из этой лунки в лунку с rhIDE WT еще на час при 25°С. В конце каждого цикла аффинной селекции связанные фаги элюировали 100 мМ TEA при рН=13, и немедленно нейтрализовали 1 М Tris-HCl, рН=7,4. Элюированные фаги использовали для заражения Е. coli XLl-blue и выращивали до логарифмической фазы роста для клональной амплификации. Титр фагов на входе и выходе селекции позволил определить количество копий каждого фагового клона. Затем 20-100 копий каждого фагового клона инкубировали в инфицированных Е. coli с 10¹⁰ КОЕ/мл хелперного фага М13КО7 в течение ночи при 37°С при 250 об/мин. Вирионы из супернатанта растущих бактерий осаждали в 20% PEG/NaCl и суспендировали в PBS перед использованием в следующем цикле аффинной селекции (пэннинге). После четырех циклов аффинной селекции с помощью метода моноклонального фагового ELISA идентифицировали IDE-специфические фаги, предоставляющие scFv. Для обнаружения связанных фагов в методе фагового ELISA использовали конъюгат моноклонального антитела НИР-анти-m13 (GE Healthcare, CAT 27-9421-01). Связывающие вещества проверяли на специфичность путем тестирования их связывания с несколькими контрольными антигенами, которые были приобретены у SIGMA (теперь Merck) [BSA, Merck CAT A7030-500G; лизоцим (лизоцим куриного яичного белка), Merck CAT L6876; стрептавидин (стрептавидин из Streptomyces avidinii) Merck, CAT S0677]. Проверенные связывающие вещества были переформатированы для получения растворимых антител и протестированы в трех форматах: MBP-scFv (фиг. 1E), IgGl человека, продуцируемые как «инклоны» (фиг. 1F), и обратные химерные IgG (фиг. 1G), продуцируемые в культуре клеток млекопитающих.

Секвенирование. Нуклеотидные последовательности клонированных генов определяли на анализаторе генов ABI 3500x1 (Applied Biosystems, США) в соответствии с инструкциями производителя. Последовательности ДНК клонированных фрагментов ДНК анализировали с использованием программы АрЕ-а plasmid Editor v2.0.47 (Wayne Davis, Университет штата Юта). Анализ последовательностей вариабельных доменов антител и отнесение их к каркасным и CDR-областям проводили с использованием программного обеспечения IgBlast от NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast).

Экспрессия и очистка IDE-специфических «инклональных» IgG. Экспрессию и рефолдинг полноразмерного «инклонального» IgG осуществляли с использованием протокола, ранее описанного в Hakim, R. and Benhar, I. (2009) MAbs 1, 281 287; Buchner, J. et al. (1992) Anal. Biochem. 205, 263 270; и Benhar, I. and Pastan, I. (1994) Protein Eng. Des. Sel. 7, 1509-1515.

Дот-блоттинг.Дот-блоттинг выполняли, как описано ранее в Mazor, Y. et al. (2007) J. Immunol. Methods 321, 41-59. Кратко, образцы белка, содержащие 0,1-1 мкг очищенного белка в общем объеме 50 мкл, в нативной форме или после 5-минутного кипячения при 95°С (условие денатурации), наносили через вакуумный коллектор на нитроцеллюлозную мембрану с использованием фильтрующего коллектора Slot blot PR648. (Hoefer Scientific Instruments, Сан-Франциско, Калифорния, США). Затем мембрану блокировали раствором 5% BSА в TBS в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем инкубировали в течение ночи с 3 мкг/мл МВР (белок, связывающий мальтозу), слитым с scFv (получен, как описано ниже), разведенным в блокирующем растворе, при 4°С. После 3 промывок TBST образцы инкубировали с мышиными анти-МВР антителами (1:5000 в TBST) в течение 1 часа при комнатной температуре, а после промывки инкубировали с HRP-конъюгированными козьими антимышиными антителами (Jackson hnmunoresearch Labs 115-035-003; 1:5000 в TBST) в течение 1 часа при комнатной температуре. После 3 дополнительных промывок с использованием TBST мембрану проявляли с помощью реагента ECL (WBLUR0500, Millipore, Милфорд, Массачусетс, США) согласно инструкциям производителя, визуализировали с помощью прибора Amersham imager 600 (GE Healthcare Biosciences; Питсбург, Пенсильвания) и анализировали с помощью программного обеспечения ImageJ. vl.5i.

Получение IDE-специфических MBP-scFv. Для цитоплазматической экспрессии IDE-специфических слитых белков MBP-scFv в Е. coli получали вектор экспрессии. Последовательности для всех scFv брали из соответствующего фагмидного вектора рСС 16, которые идентифицировали как специфически связывающиеся с IDE в конце процесса селекции методом аффинности для фагового дисплея. Использовали вектор pMALc-NHNN (см. Birnboim-Perach, R. et al. (2019) Production of Stabilized Antibody Fragments in the E.coli Bacterial Cytoplasm and in Transiently Transfected Mammalian Cells, pp.455 480, Humana Press, New York, NY). Каждую последовательность, кодирующую scFv, извлекали из фагмиды рСС16 после расщепления ее ферментами рестрикции Ncol и NotI, и эти последовательности лигировали в вектор pMALc-NHNN между сайтами рестрикции Ncol и NotI. Вектор кодирует IDE-специфический scFv, слитый с Ni-NTA, связывающийся с меткой His-tag и мальтозо-связывающим белком (МВР) на его N-конце.

Для получения MBP-scFv клетки Е. coli Rosetta BL21 трансформировали векторами экспрессии scFv, специфичными для pMALc-NHNN-MBP-IDE, и выращивали до OD при 600 нм=0,8 в 0,5 л среды LB с добавлением 100 мкг/мл ампициллина. Затем культуру индуцировали для экспрессии белка с помощью 0,5 мМ IPTG в течение ночи при 30°С. Клетки собирали центрифугированием при 9000 об/мин в течение 15 минут.Осадок суспендировали в 35 мл PBS с 0,1% Triton Х-100 и лизировали с помощью 5 повторяющихся циклов 30-секундной обработки ультразвуком и 2-минутной паузы на льду. Растворимую фракцию осветляли центрифугированием при 12000 об/мин в течение 30 минут при 4°С, а затем загружали в колонку GE HisTrap объемом 5 мл. Колонки промывали 5 объемами 5 мМ имидазола в PBS, 5 объемами 20 мМ имидазола в PBS и элюировали с колонок 250 мМ имидазолом в PBS. Очищенный слитый белок MBP-scFv подвергали диализу против PBS, разбавляли до 2 мг/мл в PBS и хранили при -80°С.

Получение спленоцитов. Селезенки, взятые у мышей C57BL/6, гомогенизировали на льду в буфере для лизиса RIPA xl с добавлением 0,1 мМ DTT, 0,1 мкмМ ванадата натрия, 0,5 мМ PMSF и смеси ингибиторов протеиназ (PIC) 1:100, а затем инкубировали в течение 20 минут при 25°С.Супернатант собирали центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 минут при 4°С и хранили аликвотами по 100 мкл при -80°С.

Получение обратных химерных антител против мышиного IDE. Чтобы преобразовать антитела в полноразмерные обратные химерные IgG, полинуклеотиды, кодирующие полученные антитела, клонировали в основную цепь плазмиды pcDNA 3.4. Эти плазмиды основаны на векторах pcDNA3.4, контролируемых промотором CMV, которые предоставляются в качестве части набора "Antibody Expressing Positive Control Vector" для транзиентной экспрессии путем трансфекции Expi293™. В набор также входят клетки Expi293F™ (ThermoFisher, #А14635). Подробное описание клонирования вариабельных доменов антител в векторы экспрессии IgG описано ранее: см. Birnboim-Perach, R et al. (2019) Production of Stabilized Antibody Fragments in the E.coli Bacterial Cytoplasm and in Transiently Transfected Mammalian Cells, pp.455^180, Humana Press, New York, NY. Вкратце, вектор экспрессировали в клетках Е. coli Rosetta BL21 и очищали с использованием колонки HisTrap (17-5248-01 GE Healthcare, Уппсала, Швеция). Первоначально антитела получали в виде полностью человеческих IgG (с константными доменами тяжелой цепи гамма-1 человека и легких цепей каппа- или лямбда человека), а затем их экспрессировали с константным доменом тяжелой цепи гамма-1 мыши и легкой каппа-цепи мыши. Клонирование осуществляли путем ПЦР-амплификации тяжелых и легких вариабельных доменов антител с последующим клонированием в плазмиды pcDNA3.4, несущих соответствующие константные домены, методом сборки Гибсона (см. Gibson, D. G. et al. (2009) Nat. Methods 6, 343-345). Трансфекцию клеток Expi293F™ различными векторами pcDNA3.4 проводили с помощью набора для трансфекции ExpiFectamine™ (Gibco, #А14524), согласно инструкциям производителя (Life Technologies, США). Для каждой трансфекции использовали общее количество 30 мкг плазмидной ДНК при молярном соотношении IgL и IgH 3:1, соответственно. Трансфекцию, рост клеток и сбор кондиционированной среды проводили в соответствии с инструкциями производителя (набор Life Technologies Expi293™ для транзиентной экспрессии путем трансфекции). Кондиционированную среду, содержащую антитела, собирали через 6-7 дней после трансфекции центрифугированием (ротор Sorvall GSA) в течение 10 минут при 4°С при 8000 об/мин. Обратные химерные мышиные IgGl mAb очищали на колонках с белком G согласно инструкциям производителя (GE Healthcare, Чикаго, Иллинойс, США). Среды, содержащие антитела, перед их очисткой забуферивали 20 мМ фосфатным буфером, рН 7, и фильтровали. Затем элюировали mAb фракциями по 1 мл и нейтрализовали рН с помощью 0,25 мл 1,5 М трис-HCl, рН 8,8. Обмен буфера на стерильный DPBS (Sigma) проводили на фильтрах для ультрацентрифуг Amicon® 10 кДа (М ill ip ore Sigma, Берлингтон, Массачусетс, США; фигура 1G) или на колонках для обессоливания PD-10 (GE Healthcare, Чикаго, Иллинойс, США).

Антитела собирали центрифугированием и концентрировали до конечной концентрации 1-2 мг/мл с использованием центрифужного фильтра-концентратора. Очищенные антитела хранили при температуре -80°С в небольших аликвотах. Концентрацию белка определяли путем измерения поглощения белка OD при 280 нм на спектрофотометре Thermo Scientific NanoDrop™ 2000 с, и последующего деления значения поглощения на фактор коэффициента экстинкции белка (коэффициент экстинкции рассчитывали по формуле, представленной на сайте www.expasy.org/tools/protparam.html).

Анализ связывания IDE. 96-луночные планшеты для ELISA (Nunc, Роскилле, Дания) покрывали в течение ночи при 4°С 2,5-5 мкг/мл PBS rhIDE дикого типа, мутантного IDE и нерелевантными белками: бычьим сывороточным альбумином (BSA), His-Trap-очищенным белком (His) и/или MBP-LacZ (рекомбинантный белок, полученный авторами изобретения). После 3 промывок с использованием PBST лунки блокировали в течение 1 часа при комнатной температуре с помощью 3% масс./об. обезжиренного молока (232100, Difco, Спаркс, Мэриленд, США) в PBS. Затем лунки инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре с полученными IDE-специфически антителами в различных форматах: в виде фаговых клонов с серийными разведениями, в виде MBP-scFv (данные не представлены) и в виде hlgG или rcIgG в различных концентрациях. Связанные фаги выявляли с помощью мышиного анти-М13-антитела (1 час при комнатной температуре) с последующей инкубацией с конъюгированным с HRP вторичным козьим антимышиным антителом (115-035-003, Jackson hnmunoResearch Laboratories, Мэн, США; 1:5000 в PBS) в течение 1 часа при комнатной температуре. Человеческие IDE-специфические IgG-антитела инкубировали с HRP-конъюгированными вторичными козьими антителами против IgG человека (109-035-088, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Мэн, США; 1:5000 в PBS) или против IgG мыши (115-035-062, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Мэн, США; 1:5000 в PBS) в течение 2 часов при комнатной температуре. После 3 промывок с использованием PBST добавляли 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ; eBioscience, Сан-Диего, Калифорния, США) до появления окраски. Реакцию останавливали добавлением 1 М H₂SO₄ и анализировали при 450 нм с использованием ридера для микропланшетов Spectrafluor plus.

IDE-анализ расщепления инсулина. Различные концентрации ингибиторов IDE инкубировали с 1,5 мкг/мл rhIDE в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем в пробирки добавляли рекомбинантный человеческий инсулин (41-975-100, Biological Industries, Кибуц Бейт а-Эмек, Израиль), разведенный в калибраторе 0 из набора для ультрачувствительного анализа для мышиного инсулина методом ELISA (10-1249-01, Mercodia ultrasensitive Mouse Insulin ELISA, Mercodia), и инкубировали в течение 2 часов при 37°С. Отбирали по 25 мкл из каждой пробирки и оценивали остаточную концентрацию инсулина с использованием указанного набора. Поглощение при 450 нм регистрировали с помощью ридера для микропланшетов Spectrafluor plus (Tecan, Мэннедорф, Швейцария).

Мышиная модель диабета, индуцированная стрептозотоцином (STZ). Мышей C57BL/6 в возрасте 10 недель не кормили в течение ночи, после чего им внутрибрюшинно вводили 150 мг/кг STZ, разведенного в 100 нМ цитратного буфера при рН 4,5. У всех мышей развилась гипергликемия в течение двух дней после инъекции СТЗ. На третий день после инъекции STZ каждой мыши внутрибрюшинно вводили 10 мг/кг полученных обратных химерных mAb (rcH3 или изотипический контроль 2Е12).

Пероральный тест на толерантность к глюкозе (oGTT). Мышей не кормили в течение 2 часов, после чего они получали однократную внутрибрюшинную инъекцию полученных обратных химерных mAb (10 мг/кг) с последующими дополнительными 4 часами голодания (всего 6 часов). По истечении этого периода времени мышам перорально с помощью иглы через зонд вводили глюкозу в дозе 2 г/кг.Уровни глюкозы в крови измеряли до введения глюкозы (время 0) и через 15, 30, 60, 90 и 120 минут после введения глюкозы с использованием глюкометра Contour (Bayer, Элкхарт, Индиана, США).

Тест на толерантность к инсулину (ITT). Мышей не кормили в течение 2 часов, после чего они получали однократную внутрибрюшинную инъекцию полученных обратных химерных mAb (10 мг/кг) с последующим голоданием в течение дополнительных 4 часов (всего 6 часов). По истечении этого периода времени мышам внутрибрюшинно вводили инсулин (0,5 ЕД/кг, растворенный в PBS). Уровни глюкозы в крови измеряли до введения глюкозы (время 0) и через 15, 30, 60 и 90 минут после введения глюкозы. Уровни глюкозы в крови измеряли с помощью глюкометра Contour (Bayer, Элкхарт, Индиана, США).

Отбор сыворотки. После проведения ITT и инъекции обратных химерных mAb у мышей каждые 3 дня брали кровь из лицевой вены с помощью иглы 27G. Пробы крови (не более 120 мкл за один раз) помещали в пробирку Эппендорфа на 1,5 мл при комнатной температуре на 1 час.Сгустки удаляли из пробирок с помощью иглы, и пробирки помещали на лед на 40 минут.Пробирки центрифугировали в течение 10 минут при 4°С при 2300 об/мин; затем прозрачный супернатант переносили в новую пробирку для второго цикла очистки. Супернатант отбирали в новую пробирку и хранили при -20°С.

Обнаружение обратных химерных анти-IDE антител в образцах сыворотки. 96-луночные планшеты для ELISA покрывали в течение ночи 5 мкг/мл IDE в PBS при 4°С. После 3 промывок с использованием PBST лунки блокировали 5% (масс./об.) обезжиренного молока в PBS в течение 1 часа при комнатной температуре. Для обнаружения обратного химерного специфичного к IDE антитела (rcH3-IgG) образцы сыворотки разводили 1:2700 в PBS, тогда как контрольные образцы, полученные после инъецирования мышам антитела rc2E12, служили в качестве положительного контроля. Известные концентрации антитела rcH3-IgG, разбавленного в разведенном 1:2700 образце от контрольных мышей, служили эталоном для измерения концентраций IDE. Образцы инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. После 3 промывок лунки инкубировали с 50 мкл HRP-конъюгированного козьего антимышиного антитела (1:5000 в PBS) в течение 1 часа при комнатной температуре. После 3 промывок с использованием PBST добавляли ТМВ до появления окраски. Реакцию останавливали добавлением 1 М H₂SO₄ и анализировали при 450 нм с использованием ридера для микропланшетов Spectrafluor plus.

Получение сегментов H3Fab₂ обратных химерных анти-IDE антител. 10 миллиграммов IgG расщепляли с использованием 200 микрограммов фермента IDES (Fabricator) (www.genovis.com/products/igg-proteases/fabricator/) при 37°С в течение 20 часов. Фрагмент Fab₂ отделяли от нерасщепленных фрагментов IgG и Fc на аффинной колонке MAbSelect™. Fab₂ хранили при -80°С до использования.

Определение уровней АФК в микроглии. Для измерения внутриклеточных уровней АФК микроглию N9 высевали на 24-луночный планшет с прозрачным дном и черной рамкой (#4TI-0241, ВЮКЕ, Лейден, Нидерланды) в концентрации 0,5 × 10⁵ клеток/мл в среде RPMI, содержащей 10% FCS. Через 24 часа среду заменяли, и клетки инкубировали в течение 24 часов со средой RPMI без сыворотки, с или без 0,1 мкг/мл LPS. Для обнаружения АФК в клетках DJ-1-KD микроглию клеток DJ-1-KD выращивали, как описано ранее (Nash et al. 2017). Для контрольной микроглии и микроглии DJ-1-KD клетки высевали в концентрации 0,8 × 10⁵ клеток/мл в среду RPMI, содержащую 10% FCS. На следующий день среду заменяли на 2 часа средой RPMI без сыворотки, содержащей 1 мкМ ротенона (#R8875; Sigma). Затем среду удаляли, и лунки однократно промывали средой RPMI без сыворотки, после чего клетки инкубировали с Fab-фрагментами анти-IDE антител (100 нМ) в течение 2 часов. Далее в лунки добавляли на ночь инсулин до конечной концентрации 100 нМ. В конце эксперимента среду заменяли на среду RPMI, содержащую 10 мкМ H2DCFDA (#D6883; Sigma), на 30 минут при 37°С в темноте, как описано ранее (Trudler et al. 2014). После окисления H2DCFDA до DCF флуоресценцию клеток измеряли на спектрофлуориметре Synergy НТ (BioTek, Вайнуски, Вермонт, США) с использованием длины волны возбуждения 485 нм и длины волны эмиссии 528 нм. При последующем окрашивании клеток метиленовым голубым (MB), как описано выше, при этом нормализацию уровней АФК по отношению к количеству клеток получали делением уровней АФК на сигнал от MB в каждой лунке.

Субъекты. В общей сложности в исследование были включены 24 здоровых добровольца и 51 пациент с метаболическим синдромом (МС) из ранее описанной когорты (Marcus Y, et al. J Clin Hypertens (Greenwich). 2016; 18(1): 19-24) (см. Таблицу 1, приведенную ниже). Для включения в исследование в качестве пациента с МС, субъекты в возрасте от 18 до 75 лет должны соответствовать критериям, определенным в Третьем отчете группы по лечению взрослых (ATP III) (Circulation. 2002; 106(25): 3143-421). Нарушением уровня глюкозы натощак считали уровень глюкозы ≥100 мг%. Ни один из испытуемых не получал ранее лечения антидиабетическими препаратами. Исследование было одобрено Хельсинкским комитетом Медицинского центра Сураски Тель-Авива. После полного объяснения цели и характера всех процедур от каждого пациента получали письменное согласие.

Биохимический анализ образцов сыворотки человека. Химический состав сыворотки измеряли с помощью обычных коммерческих автоматических анализов (Centaur, Roche, Индианаполис, Индиана, США). Уровни HbAlc измеряли с помощью HPLC (Tosoh Bioscience, Сан-Франциско, Калифорния, США).

Получение поликлональных анти-IDE антител. Иммунизация животных: использовали восьминедельных самок кроликов NZW весом 2,5 кг приобретенных в Harlan (Израиль). От каждого животного получали поликлональные антисыворотки после подкожной иммунизации 100 мкг rhIDE, эмульгированного в соотношении 1:1 в эмульсии 400 мкг экстракта М.tuberculosis Н37 в неполном адъюванте Фрейнда (CFA). Каждую неделю каждому животному давали бустерную дозу rhIDE, эмульгированного таким же образом в неполном адъюванте Фрейнда без экстракта.М.tuberculosis (IFA). Артериальную кровь кроликов собирали перед первой вакцинацией, а затем каждую неделю после каждой ревакцинации, а также при конечном (терминальном) кровопускании. Для достижения плато титра сывороточных антител (>20000) потребовалось всего три повторных иммунизации.

Анализ титра поликлональных анти-IDE антител в сыворотке: кровь, собранную от каждого животного, инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа при 4°С, с дополнительным временем (1 час) для коагуляции. Супернатант сыворотки отделяли от свернувшейся крови центрифугированием при 3000 g в течение 20 минут при 4°С.Титр анти-IDE антител измеряли с помощью прямого анализа методом ELISA следующим образом: 96-луночный планшет для ELISA (Nunc, Роскилле, Дания) покрывали в течение ночи при 4°С из расчета 50 мкл/лунку rhIDE, разведенного в PBS до конечной концентрации 2,5 мкг/мл. На следующий день планшет промывали один раз, используя для этого 300 мкл/лунку 0,05% Tween 20 в PBS (PBST), и блокировали с использованием 300 мкл/лунку 3% обезжиренного молока (масс./об.; Difco™ Skim Milk, BD) в PBS в течение 1 часа при 37°С.Затем планшет трижды промывали 300 мкл/лунку PBST, наносили 3 серийных образца сыворотки, разведенных в PBST, и оставляли для связывания на 1 час при комнатной температуре. После этого планшет трижды промывали 300 мкл/лунку PBST. Связанные поликлональные анти-IDE антитела выявляли путем нанесения HRP-конъюгированного козьего антикроличьего IgG (#111-035-004, Jackson Immunoresearch Laboratories), разведенного в 2000 раз в PBS, и планшет инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с последующей трехкратной промывкой по 300 мкл/лунку PBST. Наконец, добавляли субстрат HRP 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ; eBioscience, Сан-Диего, Калифорния, США) в количестве 50 мкл/лунку для появления окраски. Реакцию останавливали добавлением 1 М H2SO4 в количестве 50 мкл/лунку и анализировали с помощью ридера для микропланшетов Spectrafluor plus (Tecan, Меннедорф, Швейцария). Оптическую плотность измеряли при длинах волн 450 и 570 нм, и результаты анализировали с использованием программного обеспечения Magellan v.2.22 (Tecan). При достижении достаточного уровня титра у животных осуществляли терминальное кровопускание и отделяли сыворотку, оставляя сгусток крови на 1 час при 4°С и отделяя сыворотку от сгустка крови центрифугированием при 14000 g в микроцентрифуге Eppendorf при 4°С. Сыворотку делили на аликвоты по 100 мкл и хранили при -80°С.

Определение концентрации IDE в сыворотке методом ELISA. Для измерения IDE в жидкостях организма был разработан высокочувствительный метод сэндвич-ELISA, подходящий для количественного определения IDE в сыворотке крови человека и мыши. Для этого 96-луночные планшеты для ELISA (Nunc, Роскилле, Дания) покрывали на ночь анти-IDE антителом А9, разведенным в PBS до конечной концентрации 0,5 мкг/мл, при 4°С, в количестве 50 мкл/лунку. На следующий день планшет промывали один раз PBST (300 мкл/лунку) и блокировали 3% обезжиренного молока (масс./об.; Difco™ Skim Milk, BD) в PBS (300 мкл/лунку) в течение 1 часа при 37°С. Затем планшет трижды промывали PBST (300 мкл/лунку); и на каждую лунку наносили 50 мкл/лунку образцы сыворотки, разбавленные в 3 или в 9 раз в PBS, и оставляли для связывания на ночь (ON) при 37°С. Кривую зависимости от концентрации получали путем добавления в контрольную сыворотку (неопределяемая концентрация IDE) 2-х кратные серийные разведения rhIDE, начиная с 500 нг /мл в PBS (фиг. 7А). Планшет оставляли на 2 часа при комнатной температуре (приблизительно 25°С), а затем трижды промывали PBST из расчета 300 мкл/лунку. Связанный IDE обнаруживали нанесением кроличьей поликлональной анти-IDE сыворотки, разбавленной 2000 в PBS, в количестве 300 мкл/лунку, с последующей инкубацией в течение 1 часа при комнатной температуре, и с последующим трехкратным промыванием PBST (300 мкл/лунку). Затем наносили конъюгированный с HRP козий антикроличий IgG (#111-035-004, Jackson Immunoresearch Laboratories), разбавленный в 2000 в PBS, из расчета 50 мкл/лунку, и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с последующим трехкратным промыванием PBS, из расчета 50 мкл/лунку. Наконец, добавляли 50 мкл/лунку ТМВ, субстрат для HRP, до появления окраски. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл/лунку 1 М H2SO4, и анализировали с помощью ридера для микропланшетов Spectrafluor plus (Tecan, Меннедорф, Швейцария). Оптическую плотность измеряли при длинах волн 450 и 570 нм, и результаты анализировали с использованием программного обеспечения Magellan v.2.22 (Tecan).

Статистический анализ. В Примерах 1-3, представленных ниже, для всех статистических анализов использовали программное обеспечение GraphPad (GraphPad Prism v8). Сравнение данных проводили с использованием либо непарного двустороннего t-критерия Стьюдента, когда сравнивали две группы, либо однофакторного дисперсионного анализа (с апостериорным критерием Бонферрони), когда анализировали три или более групп. Каждый эксперимент повторяли не менее трех раз. Значение р<0,05 считали значимым. Для приведенного ниже Примера 4 полученные данные анализировали с помощью программного обеспечения IBM SPSS v.25.0. Нормальность распределения данных проверяли путем сравнения среднего значения с медианой, сравнения среднего значения с усеченным на 5% средним значением, значений асимметрии и эксцесса, а также с использованием теста Шапиро-Уилка в отношении полученных результатов. Результаты показали, что некоторые переменные в группе MS не подчинялись нормальному распределению. Различия между двумя группами (пациенты с MS и контрольная группа) анализировали как с помощью t-критерия для независимых выборок и критерия Манна-Уитни для непрерывных переменных, так и с помощью критерия Хи-квадрат для категорийных переменных. Поскольку результаты для t-критерия и критерия Манна-Уитни были одинаковыми, то приведены результаты, полученные с использованием t-критерия. Описательная статистика представлена в виде среднего значения и стандартного отклонения или частоты в процентах, в соответствии с размерностями переменных. Поскольку различия в возрасте были значительными, то этот фактор контролировали, и различия проверяли с помощью общих линейных моделей (GLM). Значение р<0,05 считалось статистически значимым. Все приведенные значения Р являются двусторонними.

Пример 1

Получение анти-IDE антител и оценка их ингибирующего действия на активность IDE in vitro

Получение анти-IDE антител

Очищали рекомбинантный человеческий IDE (rhIDE), который далее использовали в качестве антигена для скрининга и для иммунизации. С этой целью экспрессировали форму белка дикого типа (WT) и мутантную форму E111Q фермента, в которой точечная мутация в каталитическом сайте заметно снижает каталитическую активность фермента (35). Гены, кодирующие две формы IDE, клонировали в основную цепь плазмиды рЕТ28а+ с меткой His-Tag на С-конце. Вектор, экспрессирующий рекомбинантный IDE человека (rhIDE) с меткой His-Tag на С-конце, показан на фиг. 1 А.

После индукции экспрессии вектора с помощью SDS-PAGE зарегистрировали заметное увеличение экспрессии белка 110 кДа (фиг. 1В), а идентичность белка подтверждали с помощью иммуноблоттинга с использованием IDE-специфических антител (фиг. 1С). На следующей стадии проводили анализ разрушения инсулина очищенными белками, который показал, что белок IDE дикого типа эффективно расщепляет инсулин (разложение приблизительно на 60% после 2 часов инкубации при 37°С), тогда как мутантный IDE расщеплял только 15% инсулина в тех же условиях (фиг. 1D).

Очищенный IDE использовали для выделения специфических клонов scFv, которые распознают эпитопы рекомбинантного IDE человека. Использовали метод фагового дисплея с библиотекой фагового дисплея синтетических антител человека. В частности, для скрининга использовали библиотеку scFv человека, а именно, библиотеку Ronit 1 [описана в Azriel-Rosenfeld et al. J Mol Biol. (2004) 335(1): 177-192]. Библиотеку подвергали четырем циклам аффинной селекции на рекомбинантном IDE человека дикого типа (WT) (rhIDE). В течение двух циклов проводили истощение с использованием IDE E111Q с целью выделения антител, которые с высокой аффинностью связываются с каталитическим сайтом фермента дикого типа. После четырех циклов аффинной селекции с помощью моноклонального фагового анализа методом ELISA идентифицировали три IDE-специфических фага, соответствующих scFv, обозначенных здесь как А9, В1 и Н3. Как показано на фиг. 2A-F, серийные разведения фагов, соответствующих А9, В1 и НЗ (фиг. 2А-С, соответственно), хорошо связываются с IDE и практически не связываются с BSA, МВР или другими очищенными рекомбинантными белками, которые использовались в качестве отрицательного контроля.

Определяли последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот тяжелой и легкой цепей, а также CDR трех антител против IDE человека. Они представляют собой SEQ ID NO: 1-2 и 9-10 (для тяжелой и легкой цепей А9, соответственно), SEQ ID NO: 3-8 (для CDR тяжелой цепи А9), SEQ ID NO: 11-12, aggaataat, RNN, SEQ ID NO: 15-16 (для CDR легкой цепи A9), SEQ ID NO: 17-18 и 25-26 (для тяжелой и легкой цепей В1, соответственно), SEQ ID NO: 19-24 (для CDR тяжелой цепи Bl), SEQ ID NO: 27-28, gatgcatcc, DAS, SEQ ID NO: 31-32 (для CDR легкой цепи Bl), SEQ ID NO: 33-34 и 41-42 (для тяжелой и легкой цепей НЗ, соответственно), SEQ ID NO: 35-40 (для CDR тяжелой цепи НЗ) и SEQ ID NO: 43-44, gacaatgat, DND, SEQ ID NO: 47-48 (для CDR легкой цепи НЗ).

Для первоначальной оценки полноразмерных IgG, антитела получали в виде «инклонов», т.е. IgG, экспрессированных в системе экспрессии Е. coli (29) (фиг. 1F). Выделенные инклональные антитела показали заметное связывание с IDE, и значение ЕС50 составило приблизительно 1 нМ (фиг. 2D-F). Инклональные антитела показали очень слабое связывание с BSA, регистрируемое только при насыщающих концентрациях. В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что три «инклональных» антитела связываются с IDE с высокой аффинностью и специфичностью.

Полученные анти-IDE антитела ингибируют разрушение инсулина in vitro Чтобы проверить способность полученных анти-IDE scFv и IgG ингибировать IDE-опосредованное разрушение инсулина, rhIDE инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с каждым антителом в форме MBP-scFv или с контрольным MBP-scFv, который не связывается с rhIDE. Затем добавляли инсулин и инкубировали 2 часа при 37°С. Активность измеряли как количество остаточного инсулина с использованием набора ультрачувствительного анализа ELISA для мышиного инсулина от Mercodia. Дозозависимое ингибирование активности IDE наблюдали в присутствии scFv Bl и НЗ: В1 ингибировал разрушение инсулина на 64% (Р<0,001) и 35% (Р<0,001) при использовании 100 нМ и 10 нМ scFv, соответственно; Н3 ингибировал разрушение инсулина на 40% (Р<0,001) при использовании 100 нМ, и не наблюдали значимого ингибирования при использовании 10 нМ (фиг. 3А). При использовании А9 и контрольных MBP-scFv явного ингибирования активности IDE не наблюдали. После переформатирования антител в полноразмерные IgG человека проводили повторную оценку их способности ингибировать активность IDE. Антитело Н3 в формате IgG показало значимую эффективность в отношении ингибирования активности IDE, в то время как А9 и антитела отрицательного контроля не показали наличия такой активности (р<0,001, фиг. 3В).

Полученные анти-IDE антитела распознают конформационные эпитопы IDE Для оценки эпитопа связывания на IDE, с которым связываются полученные антитела, проводили дот-блот анализ. В частности, rhIDE в серийных разведениях и лизат селезенки мыши в качестве контроля наносили на нитроцеллюлозную мембрану как в нативном состоянии, так и в денатурирующих условиях. Образцы нативного белка rhIDE обнаруживались всеми клонами антител, при этом клон B1 MBP-scFv давал самый высокий сигнал. Все образцы денатурированного белка давали более слабые сигналы, чем нативные образцы, или не давали никаких видимых точек (фиг. 4А). Эти результаты позволяют предположить, что выбранные клоны scFv распознают конформационные эпитопы rhIDE, которые разрушаются в денатурирующих условиях, а не линейные эпитопы.

Пример 2

Терапевтический эффект полученных анти-IDE антител в модели животных с диабетом

Превращение анти-IDE антитела Н3 в обратный химерный IgG

Химерные антитела стали важной вехой в истории разработки терапевтических антител. Химерные антитела представляют собой рекомбинантные IgG, в которых вариабельные домены взяты из мышиного антитела, а константные домены представляют собой человеческие последовательности. По сравнению с мышиными моноклональными антителами (mAb) химерные антитела гораздо менее иммуногенны, что ограничивает выработку человеческих антимышиных антител при введении пациентам-людям (36). И наоборот, обратные химерные антитела представляют собой антитела с вариабельными доменами человека и константными доменами мыши (37). В дополнение к тому, что они полезны для обнаружения антител у трансгенных мышей, обратные химерные антитела могут быть очень полезны для лечения в исследованиях на мышиных моделях, чтобы избежать индукции иммунного ответа «мышь-против-человека». Чтобы оценить эффективность полученных анти-IDE-антител на мышиных моделях, человеческое антитело IgG Н3 преобразовывали в обратные химерные IgG (rdgG) (изотип мышиного IgG1) и оценивали его способность связываться с IDE, BSA и мутантным IDE E111Q. Антитело rc2E12, не связывающееся с IDE, служило изотипическим контролем. Как показано на фиг. 4В, rcH3-IgG связывается с IDE с высокой аффинностью (ЕС₅₀ 1,62 нМ). Кроме того, rcH3-IgG показало специфичность к активному IDE, и оно не связывается с мутантным IDE или BSA. Кроме того, также тестировали способность антитела rcH3-IgG ингибировать активность IDE. Антитело rcH3-IgG ингибировало IDE дозозависимым образом (фиг. 4С). Взятые вместе, эти результаты предполагают, что обратный химерный IgG Н3 сохраняет свойства, сходные с человеческим вариантом IgG Н3.

Антитело rcH3-IgG улучшает передачу сигналов инсулина в модели диабета у мышей

Ранее предполагалось, что ингибирование IDE может улучшать активность инсулина в модели диабета у мышей (38). В этой связи оценивали способность rcH3-IgG снижать уровень глюкозы (oGTT) и улучшать активность инсулина (iTT) у мышей, получавших STZ. С этой целью rcH3-IgG или антитело изотипического контроля вводили внутрибрюшинно мышам, получавшим STZ, за 1 час до тестирования методами oGTT и iTT. После провокации глюкозой (oGTT) как у контрольных мышей, так и у мышей, получавших rcH3-IgG, наблюдали повышение уровня глюкозы в крови. Однако мыши, получавшие rcH3-IgG, показали более низкие уровни глюкозы с течением времени по сравнению с контрольными мышами (р<0,05). Апостериорный анализ показал, что у мышей, получавших rcH3-IgG, через 90 минут после введения глюкозы наблюдались значительно более низкие уровни глюкозы по сравнению с мышами, получавшими изотипический контроль (р<0,05; фиг. 5А). Кроме того, оценивали способность rcH3-IgG улучшать активность инсулина (ITT). В то время как у мышей, получавших rcH3-IgG, наблюдали значительное снижение уровня глюкозы, начиная с 30 минут после введения инсулина (р<0,001), то у мышей, получавших изотипический контроль, только через 90 минут наблюдали значительное снижение уровня глюкозы (р<0,05). Наконец, определяли период полувыведения антитела rcH3-IgG в сыворотке мышей, которым вводили этот препарат, и было обнаружено, что он составляет приблизительно 11 дней. Взятые вместе, эти результаты позволяют предположить, что на основании результатов, полученных в модели мышей с диабетом, лечение rcH3-IgG улучшает уровень глюкозы и активность инсулина.

Пример 3

Влияние полученных анти-IDE антител на микроглию, имеющую фенотип болезни Паркинсона

Чтобы оценить терапевтический эффект действия полученных антител в отношении болезни Паркинсона, использовали микроглию DJ-1 с нокдауном (KD), которая представляет нейротоксический фенотип микроглии, проявляющийся при болезни Паркинсона (Nash et al. J Neurochem. 2017 143 (5): 584-594 и Trudler et al. J Neurochem. 2014 129(3):434-47). Предыдущие исследования показали, что микроглия DJ-1 с KD продуцирует более высокие уровни активных форм кислорода (АФК) в условиях базовой и воспалительной стимуляции (Trudler et al. 2014). Во избежание возможного связывания полученных анти-IDE антител с микроглией Fc-рецепторами, экспрессированными на мембране микроглии (Teeling et al. 2012), сегменты Fab₂ антитела rcH3-IgG (обозначенные здесь как «Fab Н3») тестировали в этих условиях.

Как показано на фигуре 6А, микроглия DJ-1 с KD обеспечивает повышение уровня АФК на 51% по сравнению с контрольной микроглией, что согласуется с ранее опубликованными данными (Trudler et al. 2014). Кроме того, кратковременная стимуляция клеток ротеноном, известным ингибитором митохондриального комплекса I, что является экспериментальной моделью болезни Паркинсона (Xiong et al., 2012), значительно увеличивала выработку АФК в микроглии DJ-1 с KD (227% по сравнению с контрольными клетками на исходном уровне, р<0,001). В то время как стимуляция при использовании 100 нМ инсулина после воздействия ротенона не снижала продукцию АФК, то инкубация клеток с 100 нМ Fab Н3 значительно снижала продукцию АФК в клетках DJ-1 с KD (р<0,001) до уровней, сравнимых с исходными уровнями для клеток (151% для контрольных клеток на исходном уровне по сравнению с 148% для клеток, обработанных Fab Н3, после обработки их ротеноном). Примечательно, что как показано на фиг. 6В, анализ с использованием метиленового голубого (MB) для измерения эффекта в отношении общего количества клеток показал, что воздействие инсулином или Н3 не оказывает существенного влияния на выживаемость клеток после их обработки ротеноном. Это важный результат для оценки защитного эффекта действия и отсутствия токсичности.

В совокупности эти результаты позволяют предположить, что антитело rcH3 может служить основой для терапевтического подхода при лечении болезни Паркинсона.

Пример 4

Диагностика и прогнозирование метаболического синдрома с использованием полученных анти-IDE антител

Используя полученные анти-IDE антитела, был разработан сэндвич-анализ ELISA для обнаружения и количественного определения IDE (фиг. 7А). Как показано на фиг. 7В, этот анализ ELISA легко обнаруживает rhIDE с высокой чувствительностью, от 5 пг/мкл до 500 пг/мкл. Человеческий и мышиный IDE имеют>95% идентичности последовательности, поэтому было обоснованно предположено и подтверждено, что полученные поликлональные и моноклональные антитела также будут связываться с мышиным IDE. Чтобы определить, распознает ли антитело А9 конформацию активной формы rhIDE, оценивали разницу в связывании с денатурированной формой rhIDE. Как показано на фиг. 7С, термическая денатурация rhIDE привела к очень значительному снижению сигнала ELISA при обнаружении с использованием IgG А9 (до почти незначительного сигнала). Следует отметить, что термическая денатурация rhIDE также приводила к снижению сигнала ELISA приблизительно в 2-3 раза, что показано на фиг. 8, где rhIDE обнаруживали с помощью серийных 2-х кратных разведений антитела против метки His-Tag (которое распознает линейный эпитоп), что свидетельствует о том, что денатурированный rhIDE также менее эффективно связывается с лунками планшета для ELISA. В совокупности эти результаты предполагают, что IgG А9 специфически распознает конформационный эпитоп активной форму rhIDE.

Затем разработанный анализ ELISA использовали для определения уровней IDE в образцах сыворотки от пациентов с метаболическим синдромом (MS) и здоровых субъектов контроля. Субъекты с MS, по сравнению с контрольной группой, имели более высокие индексы массы тела (ИМТ), уровни глюкозы, триглицеридов и инсулина с более низкими уровнями HDLc (см. Таблицу 1, приведенную ниже). Результаты показывают, что уровни IDE были выше у субъектов с MS (в среднем 637,4±469,5 против 470,5±221,8 пг/мкл; р<0,05) (фиг. 9). Поскольку субъекты в группе MS были старше по возрасту субъектов контрольной группы, то IDE в этих двух группах сравнивали после повторной корректировки по возрасту. После этой корректировки IDE также были выше у субъектов с MS по сравнению с контролем (F (1,68)=6,675, р=0,012, частный эта-квадрат=0,089). Кроме того, установили положительную корреляция между уровнями IDE и триглицеридами в сыворотке (r=0,423; р<0,05, фиг. 10А) и инсулином (r=0,294, р<0,05, фиг. 10В) и пограничную корреляцию с С-пептидом в сыворотке (не показано). IDE также отрицательно коррелирует с уровнями HDLc (r=-0,366; р<0,05, фиг. 10С). Эти данные свидетельствуют о том, что более высокие уровни IDE количественно связаны с компонентами MS.

Кроме того, уровни IDE у субъектов с MS четко разделены на две разные подгруппы: субъекты с низким IDE, с распределением значений и средним значением (n=25; 272,1+/-157,9 пг/мкл), для которых не установили различия от нормальной контрольной группы, и субъекты с высоким IDE (n=25; 1002,6+/- 383,7 пг/мкл, различие р<0,001). Субъекты в группе MS с низким IDE были старше по возрасту (возраст 54+/- 10 лет, против 45+/- 13 лет; р<0,05) и они имели более высокий уровень глюкозы, чем субъекты в группе MS с высоким IDE (95+/-20 мг/дл, против 80+/-9 мг/дл, р<0,01) (фиг. 9). Следует отметить, что в обеих группах уровни инсулина оказались одинаковыми, как и уровень триглицеридов и HDLc, а также они все имели одинаковые систолическое и диастолическое артериальное давление и частоту сердечных сокращений.

Хотя настоящее изобретение описано в связи с конкретными вариантами его осуществления, понятно, что специалистам в данной области техники будут очевидны многие другие альтернативы, модификации и вариации осуществления изобретения. Соответственно, предполагается, что все такие альтернативы, модификации и вариации, которые соответствуют сути технических решений, охватываются и входят в объем прилагаемой формулы изобретения.

Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые здесь, полностью включены в описание посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка конкретно и индивидуально была включена в настоящее описание. Кроме того, цитирование или указание любой ссылки в материалах этой заявки не должны рассматриваться как допущение того, что такая ссылка рассматривается в качестве предшествующего уровня техники настоящего изобретения. В той мере, в какой используются заголовки разделов, они не должны толковаться как обязательно ограничивающие. Кроме того, любой(ые) приоритетный(е) документны) этой заявки включен(ы) в настоящий документ во всей своей полноте посредством ссылки.

Перечень литературных источников

(другие ссылки и источники цитировались по тексту описания)

1. Alberti, K. G. М. М. and Zimmet, P. Z. (1998) Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus. Provisional report of a WHO Consultation. Diabet. Med. 15, 539-553.

2. Kahn, C. R. (1986) Insulin Resistance: A Common Feature of Diabetes Mellitus. N. Engl. J. Med.

3. Roglic, G. (2016) WHO Global report on diabetes: A summary. Int. J. Noncommunicable Dis. 1, 3-8.

4. Vinik, A. L, Fishwick, D. Т., and Pittenger, G. (2004) Advances in diabetes for the millennium: toward a cure for diabetes. Medscape Gen. Med. 6.

5. Mortel, K. F., Meyer, J. S., Sims, P. A., and McClintic, K. (1990) Diabetes mellitus as a risk factor for stroke. South. Med. J. 83, 904 911.

6. Falanga, V. (2005) Wound healing and its impairment in the diabetic foot. Lancet 366, 1736-1743.

7. McCrimmon, R. J., Ryan, С.M., and Frier, В. M. (2012) Diabetes and cognitive dysfunction. Lancet 379, 2291 2299.

8. Kleinridders, A., Ferris, H. A., Cai, W., and Kahn, C. R. (2014) Insulin action in brain regulates systemic metabolism and brain function.

9. Cheung, В. M. Y., Ong, K. L., Cherny, S. S., Sham, P.-C, Tso, A. W. K., and Lam, K. S. L. (2009) Diabetes Prevalence and Therapeutic Target Achievement in the United States, 1999 to 2006. Am. J. Med. 122, 443-453.

10. Rines, A. K., Sharabi, K., Tavares, C. D. J., and Puigserver, P. (2016) Targeting hepatic glucose metabolism in the treatment of type 2 diabetes. Nat. Rev. Drug Discov. 15, 786-804.

11. Binder, C, Lauritzen, Т., Faber, O., and Pramming, S. (1984) Insulin pharmacokinetics. Diabetes Care 7, 188-199.

12. Williams, G., Pickup, J. C, and Keen, H. (1987) Massive insulin resistance apparently due to rapid clearance of circulating insulin. Am. J. Med. 82, 1247 1252.

13. Brunton, S. A., Davis, S. N., and Renda, S. M. (2006) Overcoming psychological barriers to insulin use in type 2 diabetes. Clin. Cornerstone 8, S19-S26.

14. Porter, S. (2001) Human Immune Response to Recombinant Human Proteins. J. Pharm. Sci. 90, 1-11.

15. Fernandez-Gamba, A., Leal, M., Morelli, L., and Castano, E. (2009) Insulin-Degrading Enzyme: Structure-Function Relationship and its Possible Roles in Health and Disease. Curr. Pharm. Des. 15, 3644 3655.

16. M16: Pitrilysin: insulin degrading enzyme. IUPHAR/BPS Guid. to Pharmacol.

17. Guo, Q., Manolopoulou, M., Bian, Y., Schilling, А. В., and Tang, W.-J. (2010) Molecular Basis for the Recognition and Cleavages of IGF-II, TGF-a, and Amylin by Human Insulin-Degrading Enzyme. J. Mol. Biol. 395, 430-443.

18. Duckworth, W. C. and Kitabchi, A. E. (1974) Insulin and glucagon degradation by the same enzyme. Diabetes 23, 536-543.

19. Duckworth, W. C, Bennett, R. G., and Hamel, F. G. (1998) Insulin Degradation: Progress and Potential. Endocr. Rev. 19, 608-624.

20. Hulse, R. E., Ralat, L. A., and Wei- Jen, T. (2009) Structure, Function, and Regulation of Insulin- Degrading Enzyme. Vitam. Horm. 80, 635 648.

21. Glebov, K., Schutze, S., and Walter, J. (2011) Functional relevance of a novel SlyX motif in non-conventional secretion of insulin-degrading enzyme. J. Biol. Chem. 286, 22711-22715.

22. Maianti, J. P., McFedries, A., Foda, Z. H., Kleiner, R. E., Du, X. Q., Leissring, M. A., Tang, W.-J., Charron, M. J., Seeliger, M. A., Saghatelian, A., and Liu, D. R. (2014) Anti-diabetic activity of insulin-degrading enzyme inhibitors mediated by multiple hormones. Nature 511, 94-98.

23. Yang, D., Qin, W., Shi, X., Zhu, В., Xie, M., Zhao, H., Teng, В., Wu, Y., Zhao, R., Yin, F., Ren, P., Liu, L., and Li, Z. (2018) Stabilized p-Hairpin Peptide Inhibits Insulin Degrading Enzyme. J. Med. Chem. 61, 8174-8185.

24. Tang, W.-J. (2016) Targeting Insulin-Degrading Enzyme to Treat Type 2 Diabetes Mellitus. Trends Endocrinol. Metab. 27, 24-34.

25. Deprez-Poulain, R., Hennuyer, N., Bosc, D., Liang, W. G., Enee, E., Marechal, X., Charton, J., Totobenazara, J., Berte, G., Jahklal, J., Verdelet, Т., Dumont, J., Dassonneville, S., Woitrain, E., Gauriot, M., Paquet, C, Duplan, I., Hermant, P., Cantrelle, F.-X., Sevin, E., Culot, M., Landry, V., Herledan, A., Piveteau, C, Lippens, G., Leroux, F., Tang, W.-J., van Endert, P., Staels, В., and Deprez, B. (2015) Catalytic site inhibition of insulin-degrading enzyme by a small molecule induces glucose intolerance in mice. Nat. Commun. 6, 8250.

26. Brekke, О. H. and Sandlie, I. (2003) Therapeutic antibodies for human diseases at the dawn of the twenty-first century. Nat. Rev. Drug Discov. 2, 52-62.

27. Maynard, J. and Georgiou, G. (2000) Antibody Engineering. Annu. Rev. Biomed. Eng. 2,339-376.

28. Azriel-Rosenfeld, R., Valensi, M., and Benhar, I. (2004) A Human Synthetic Combinatorial Library of Arrayable Single-chain Antibodies based on Shuffling in Vivo Formed CDRs into General Framework Regions. J. Mol. Biol. 335, 177-192.

29. Hakim, R. and Benhar, I. (2009) "hiclonals": IgGs and IgG-enzyme fusion proteins produced in an E.coli expression-refolding system. MAbs 1, 281-287.

30. Buchner, J., Pastan, I., and Brinkmann, U. (1992) A method for increasing the yield of properly folded recombinant fusion proteins: Single-chain immunotoxins from renaturation of bacterial inclusion bodies. Anal. Biochem. 205, 263-270.

31. Benhar, I. and Pastan, I. (1994) Cloning, expression and characterization of the Fv fragments of the anti-carbohydrate mAbs Bl and B5 as single-chain immunotoxins. "Protein Eng. Des. Sel. 7, 1509-1515.

32. Mazor, Y., Barnea, I., Keydar, I., and Benhar, I. (2007) Antibody internalization studied using a novel IgG binding toxin fusion. J. Immunol. Methods 321, 41 59.

33. Birnboim-Perach, R., Grinberg, Y., Vaks, L., Nahary, L., and Benhar, I. (2019) Production of Stabilized Antibody Fragments in the E.coli Bacterial Cytoplasm and in Transiently Transfected Mammalian Cells, pp.455^180, Humana Press, New York, NY.

34. Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R.-Y., Venter, J. C, Hutchison, C. A., and Smith, H. O. (2009) Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods 6, 343-345.

35. Perlman, R. K., Gehm, B. D., Kuo, W.-L., and Rich Rosner, M. (1993) Functional Analysis of Conserved Residues in the Active Site of Insulin-degrading Enzyme. J. Biol. Chem. 268, 21538-21544.

36. Morrison, S. L. and Schlom, J. (1990) Recombinant chimeric monoclonal antibodies. Important Adv. Oncol. 3 18.

37. Murphy, A. J., Macdonald, L. E., Stevens, S., Karow, M., Dore, А. Т., Pobursky, K., Huang, Т. Т., Poueymirou, W. Т., Esau, L., Meola, M., Mikulka, W., Krueger, P., Fairhurst, J., Valenzuela, D. M., Papadopoulos, N., and Yancopoulos, G. D. Mice with megabase humanization of their immunoglobulin genes generate antibodies as efficiently as normal mice.

38. Maianti, J. P., McFedries, A., Foda, Z. H., Kleiner, R. E., Du, X. Q., Leissring, M. a, Tang, W.-J., Charron, M. J., Seeliger, M. a, Saghatelian, A., and Liu, D. R. (2014) Anti-diabetic activity of insulin-degrading enzyme inhibitors mediated by multiple hormones. Nature 511, 94 98.

39. Leissring, M. a., Malito, E., Hedouin, S., Reinstatler, L., Sahara, Т., Abdul-Hay, S. O., Choudhry, S., Maharvi, G. M., Fauq, A. H., Huzarska, M., May, P. S., Choi, S., Logan, T. P., Turk, В. E., Cantley, L. C, Manolopoulou, M., Tang, W.-J., Stein, R. L., Cuny, G. D., and Selkoe, D. J. (2010) Designed Inhibitors of hisulin-Degrading Enzyme Regulate the Catabolism and Activity of Insulin. PLoS One 5, e10504.

40. Shen, Y., Joachimiak, A., Rosner, M. R., and Tang, W.-J. (2006) Structures of human insulin-degrading enzyme reveal a new substrate recognition mechanism. Nature 443, 870-874.

41. Shen, Y., Joachimiak, A., Rich Rosner, M., and Tang, W.-J. (2006) Structures of human insulin-degrading enzyme reveal a new substrate recognition mechanism. Nature 443, 870-874.

42. Farris, W., Mansourian, S., Chang, Y., Lindsley, L., Eckman, E. A., Frosch, M. P., Eckman, С. В., Tanzi, R. E., Selkoe, D. J., and Guenette, S. (2003) Insulin-degrading enzyme regulates the levels of insulin, amyloid beta-protein, and the beta-amyloid precursor protein intracellular domain in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 4162-4167.

43. Backer, J. M., Kahn, R. C, and White, M. F. (1990) The Dissociation and Degradation of Internalized Insulin Occur in the Endosomes of Rat Hepatoma Cells. J. Biol. Chem. 265, 14828 14835.

44. Fakhrai-Rad, H., Nikoshkov, A., Kamel, A., Fernstrom, M., Zierath, J. R., Norgren, S., Luthman, H., and Galli, J. (2000) Insulin-degrading enzyme identified as a candidate diabetes susceptibility gene in GK rats. Hum. Mol. Genet. 9, 2149 2158.

45. Karamohamed, S., Demissie, S., Volcjak, J., Liu, C. Y., Heard-Costa, N., Liu, J., Shoemaker, С.M., Panhuysen, С.I., Meigs, J. В., Wilson, P., Atwood, L. D., Cupples, L. a, and Herbert, a. (2003) Polymorphisms in the insulin-degrading enzyme gene are associated with type 2 diabetes in men from the NHLBI Framingham Heart Study. Diabetes 52, 1562 1567.

46. Vieira, P. and Rajewsky, K. (1988) The half-lives of serum immunoglobulins in adult mice. Eur. J. Immunol. 18, 313-316.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="en"

nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3"

fileName="RU2022122348_RUS_1.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-10-24">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2022122348</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-08-18</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>93708</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>US</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>62/964,139</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2020-01-22</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">РАМОТ ЭТ ТЕЛЬ-АВИВ ЮНИВЕРСИТИ ЛТД.

</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Ramot at Tel-Aviv University

Ltd.</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">БЕНХАР, Итай</InventorName>

<InventorNameLatin>BENHAR Itai</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">АНТИТЕЛА ПРОТИВ IDE И ИХ

ПРИМЕНЕНИЕ</InventionTitle>

<InventionTitle languageCode="en">ANTI-IDE ANTIBODIES AND USES OF

SAME</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>52</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>375</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..375</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE clone A9

VH</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>VH область антитела против IDE

человека (клон A9)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..375</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggt

ccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagaagttatggcatgcactgggtccgccaggc

tccagggagggggctggagtgggtttcagccattaatagtaatggtgatagcacctactatccagacact

gtgaaggaccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctga

gagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagagctgattattatgatagtactggctattactacca

cggtttggacctctggggccagggcaccctggtcacggtctcttca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>125</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..125</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE clone A9

VH</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>VH область антитела против IDE

человека (клон A9)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..125</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSYGMHWVRQAPGRGLEWVS

AINSNGDSTYYPDTVKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARADYYDSTGYYYHGLDLWGQGT

LVTVSS</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE (clone A9 VH) - CDR1 DNA

sequence</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Последовательность ДНК для CDR1

антитела против IDE человека (VH, клон

А9)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggattcaccttcagaagttatggc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q7">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE (clone A9 VH) -

CDR1</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>CDR1 антитела против IDE человека

(VH, клон А9)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>GFTFRSYG</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q9">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE (clone A9 VH) - CDR2 DNA

sequence</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Последовательность ДНК для CDR2

антитела против IDE человека (VH, клон

А9)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>attaatagtaatggtgatagcacc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q11">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE (clone A9 VH) -

CDR2</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>CDR2 антитела против IDE человека

(VH, клон А9)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q12">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>INSNGDST</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>55</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..55</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q13">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE (clone A9 VH) - CDR3 DNA

sequence</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Последовательность ДНК для CDR3

антитела против IDE человека (VH, клон

А9)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..55</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q14">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcgagaagctgattattatgatagtactggctattactaccacggtttg

gacctc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q15">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE (clone A9 VH) -

CDR3</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>CDR3 антитела против IDE человека

(VH, клон А9)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q16">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ARADYYDSTGYYYHGLDL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="9">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>324</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..324</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q17">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE clone A9 VL - DNA

sequence</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Последовательность ДНК для VL

области антитела против IDE человека (клон

А9)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..324</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q18">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gatatcgtgctgactcagccaccctcagcgtctgggacccccgggcaga

gggtcaccatctcctgctctggaagcagggacaacatcgggaagaattatgtgtcctggtaccagcagct

cccaggaacggctcccaaactcctcatctataggaataatcagcggccctcaggggtccctgaccggttc

tctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctgcggtccgaggatgaggctgatt

attactgctcctcatatgcaggcagctccgtgatattcggcggaggcaccaaggtgaccgtccta</INS

DSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="10">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>108</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..108</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q19">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE clone A9

VL</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>VL область антитела против IDE

человека (клон A9)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..108</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q20">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>DIVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSRDNIGKNYVSWYQQLPGTAPKLLI

YRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSSYAGSSVIFGGGTKVTVL</INSDSeq_s

equence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="11">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q21">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE (clone A9 VL) - CDR1 DNA

sequence</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Последовательность ДНК для CDR1

антитела против IDE человека (VL, клон

А9)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q22">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agggacaacatcgggaagaattat</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="12">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q23">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE (clone A9 VL) -

CDR1</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>CDR1 антитела против IDE человека

(VL, клон А9)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q24">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>RDNIGKNY</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="13">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length/>

<INSDSeq_moltype/>

<INSDSeq_division/>

<INSDSeq_sequence>000</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="14">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length/>

<INSDSeq_moltype/>

<INSDSeq_division/>

<INSDSeq_sequence>000</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="15">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>27</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q29">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE (clone A9 VL) - CDR3 DNA

sequence</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Последовательность ДНК для CDR3

антитела против IDE человека (VL, клон

А9)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q30">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcctcatatgcaggcagctccgtgata</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="16">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>9</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..9</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q31">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE (clone A9 VL) -

CDR3</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>CDR3 антитела против IDE человека

(VL, клон А9)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..9</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q32">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>SSYAGSSVI</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="17">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>369</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..369</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q33">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE clone B1 VH - DNA

sequence</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Последовательность ДНК для VH

области антитела против IDE человека (клон

B1)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..369</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q34">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggt

ccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcggttcctactggatgcactgggtccgccaggc

tccaggcaaggggctggagtgggtctcaggaattagtggaagtggacataccacatactacgcagacgcc

gtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctga

gagccgaggacacggccgtatattactgtgcgagacaaggggacttcgatctctggagtggttatccttt

tgactcctggggccagggcaccctggtcacggtctcctca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="18">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>123</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..123</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q35">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE clone B1

VH</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>VH область антитела против IDE

человека (клон B1)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..123</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q36">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGSYWMHWVRQAPGKGLEWVS

GISGSGHTTYYADAVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGDFDLWSGYPFDSWGQGTLV

TVSS</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="19">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q37">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE (clone B1 VH) - CDR1 DNA

sequence</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Последовательность ДНК для CDR1

антитела против IDE человека (VH, клон

B1)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q38">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggattcaccttcggttcctactgg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="20">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q39">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE (clone B1 VH) -

CDR1</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>CDR1 антитела против IDE человека

(VH, клон B1)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q40">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>GFTFGSYW</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="21">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q41">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE (clone B1 VH) - CDR2 DNA

sequence</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Последовательность ДНК для CDR2

антитела против IDE человека (VH, клон

B1)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q42">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>attagtggaagtggacataccaca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="22">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q43">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE (clone B1 VH) -

CDR2</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>CDR2 антитела против IDE человека

(VH, клон B1)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q44">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ISGSGHTT</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="23">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>48</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..48</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q45">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE (clone B1 VH) - CDR3 DNA

sequence</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Последовательность ДНК для CDR3

антитела против IDE человека (VH, клон

B1)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..48</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q46">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcgagacaaggggacttcgatctctggagtggttatccttttgactcc<

/INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="24">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>16</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..16</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q47">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE (clone B1 VH) -

CDR3</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>CDR3 антитела против IDE человека

(VH, клон B1)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..16</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q48">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ARQGDFDLWSGYPFDS</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="25">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>321</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..321</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q49">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE clone B1 VL (Kappa) - DNA

sequence</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Последовательность ДНК для VL

(каппа) области антитела против IDE человека (клон

B1)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..321</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q50">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gatatcgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccagggg

aaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagtcacttggcctggtaccagcagaaacc

tggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagacaggttcagt

ggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcagtgtatt

actgtcaacagtatgatagttatccgtacacttttggccaggggaccaaactggacatcaaa</INSDSe

q_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="26">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>107</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..107</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q51">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE clone B1 VL

(Kappa)</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>VL (каппа) область антитела против

IDE человека (клон B1)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..107</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q52">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>DIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSHLAWYQQKPGQAPRLLIY

DASNRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYDSYPYTFGQGTKLDIK</INSDSeq_se

quence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="27">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q53">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE (clone B1 VL) - CDR1 DNA

sequence</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Последовательность ДНК для CDR1

антитела против IDE человека (VL, клон

B1)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q54">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cagagtgttagcagtcac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="28">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>6</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..6</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q55">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE (clone B1 VL) -

CDR1</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>CDR1 антитела против IDE человека

(VL, клон B1)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..6</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q56">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>QSVSSH</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="29">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length/>

<INSDSeq_moltype/>

<INSDSeq_division/>

<INSDSeq_sequence>000</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="30">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length/>

<INSDSeq_moltype/>

<INSDSeq_division/>

<INSDSeq_sequence>000</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="31">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>27</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q61">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE (clone B1 VL) - CDR3 DNA

sequence</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Последовательность ДНК для CDR3

антитела против IDE человека (VL, клон

B1)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q62">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>caacagtatgatagttatccgtacact</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="32">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>9</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..9</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q63">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE (clone B1 VL) -

CDR3</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>CDR3 антитела против IDE человека

(VL, клон B1)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..9</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q64">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>QQYDSYPYT</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="33">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>369</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..369</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q65">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE clone H3 VH - DNA

sequence</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Последовательность ДНК для VH

области антитела против IDE человека (клон

H3)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..369</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q66">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggt

ccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtaactactggatgcactgggtccgccaggc

tccagggaaggggctggagtgggtttcaactattagtggtcgtggtagtgccacacactacacagactcc

gtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctga

gagccgaggacacggccgtatattactgtgcgagacaaggggacttcgatctctggagtggttatccttt

tgactcctggggccagggcaccctggtcacggtctcctca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="34">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>123</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..123</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q67">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE clone H3

VH</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>VH область антитела против IDE

человека (клон H3)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..123</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q68">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMHWVRQAPGKGLEWVS

TISGRGSATHYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGDFDLWSGYPFDSWGQGTLV

TVSS</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="35">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q69">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE (clone H3 VH) - CDR1 DNA

sequence</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Последовательность ДНК для CDR1

антитела против IDE человека (VH, клон

H3)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q70">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggattcaccttcagtaactactgg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="36">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q71">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE (clone H3 VH) -

CDR1</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>CDR1 антитела против IDE человека

(VH, клон H3)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q72">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>GFTFSNYW</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="37">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q73">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE (clone H3 VH) - CDR2 DNA

sequence</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Последовательность ДНК для CDR2

антитела против IDE человека (VH, клон

H3)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q74">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>attagtggtcgtggtagtgccaca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="38">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q75">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE (clone H3 VH) -

CDR2</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>CDR2 антитела против IDE человека

(VH, клон H3)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q76">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ISGRGSAT</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="39">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>48</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..48</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q77">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE (clone H3 VH) - CDR3 DNA

sequence</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Последовательность ДНК для CDR3

антитела против IDE человека (VH, клон

H3)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..48</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q78">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcgagacaaggggacttcgatctctggagtggttatccttttgactcc<

/INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="40">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>16</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..16</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q79">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE (clone H3 VH) -

CDR3</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>CDR3 антитела против IDE человека

(VH, клон H3)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..16</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q80">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ARQGDFDLWSGYPFDS</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="41">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>330</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..330</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q81">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE clone H3 VL (Lambda) - DNA

sequence</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Последовательность ДНК для VL

(лямбда) области антитела против IDE человека (клон

H3)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..330</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q82">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gatatcgtgctgactcagccaccctcagcgtctgggacccccgggcaga

gggtcaccatctcttgcactggaagcagctccaacattgggaatagttatgtagcctggtaccagcagct

tccaggaacggctcccaaactcctcatttatgacaatgataagcgaccctcaggggtccctgaccggttc

tctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccggtccgaggatgaggctgatt

attactgccagtcctatgacagcagcctgagtggttggatgttcggcggagggaccaagctcaccgtcct

a</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="42">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>110</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..110</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q83">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE clone H3 VL

(Lambda)</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>VL (лямбда) область антитела против

IDE человека (клон H3)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..110</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q84">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>DIVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGNSYVAWYQQLPGTAPKLLI

YDNDKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDSSLSGWMFGGGTKLTVL</INSDSeq

_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="43">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q85">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE (clone H3 VL) - CDR1 DNA

sequence</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Последовательность ДНК для CDR1

антитела против IDE человека (VL, клон

H3)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q86">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agctccaacattgggaatagttat</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="44">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q87">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE (clone H3 VL) -

CDR1</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>CDR1 антитела против IDE человека

(VL, клон H3)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q88">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>SSNIGNSY</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="45">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length/>

<INSDSeq_moltype/>

<INSDSeq_division/>

<INSDSeq_sequence>000</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="46">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length/>

<INSDSeq_moltype/>

<INSDSeq_division/>

<INSDSeq_sequence>000</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="47">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>33</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..33</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q93">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE (clone H3 VL) - CDR3 DNA

sequence</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Последовательность ДНК для CDR3

антитела против IDE человека (VL, клон

H3)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..33</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q94">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cagtcctatgacagcagcctgagtggttggatg</INSDSeq_sequen

ce>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="48">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>11</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..11</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q95">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Anti human IDE (clone H3 VL) -

CDR3</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>CDR3 антитела против IDE человека

(VL, клон H3)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..11</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q96">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>QSYDSSLSGWM</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="49">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>2976</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..2976</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q97">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Wild type IDE coding

sequence</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Кодирующая последовательность для

IDE дикого типа</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..2976</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q98">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgaataatcctgcaatcaagcgtattggtaaccatattaccaagagcc

cggaggacaaacgtgagtatcgcggcctggaactggccaatggcatcaaggttctgctgatcagcgaccc

gacaaccgacaagagtagtgcagccctggatgtgcatattggcagcctgagtgatccgcctaacattgcc

ggtctgagccacttctgcgaacacatgctgttcctgggcaccaaaaagtacccgaaagaaaacgagtata

gtcagtttctgagcgagcacgcaggtagtagcaatgccttcacaagcggtgagcacaccaattactactt

cgacgtgagccatgaacatctggagggcgcactggatcgctttgcccaattctttctgtgcccgctgttt

gacgaaagctgcaaagaccgtgaggtgaacgccgttgatagcgagcacgagaaaaacgttatgaacgacg

cctggcgcttattccagctggagaaggcaaccggtaacccgaaacacccgtttagtaagttcggcacagg

caacaagtacaccttagaaacccgccctaaccaggagggcattgacgtgcgccaagagttattaaaattt

cacagcgcatactacagcagcaacctgatggcagtgtgtgttctgggccgcgaaagcctggatgatctga

caaatctggttgttaaattattcagtgaggtggagaacaagaacgtgccgctgcctgagtttcctgagca

cccgttccaggaggaacatttaaagcaactgtataaaattgtgccgatcaaagacattcgcaatctgtat

gttacattcccgatcccggacctgcaaaagtactacaagagcaacccgggtcactacttaggccatctga

ttggccacgagggtccgggcagtctgctgagtgaactgaagagcaagggttgggtgaacacactggttgg

tggccagaaggagggcgcacgtggtttcatgttctttattatcaatgtggacctgaccgaagaaggtctg

ctgcacgtggaggacatcatcttacacatgtttcagtacattcagaaattacgcgcagaaggtccgcagg

agtgggtgttccaagagtgcaaggatctgaacgcagtggccttccgctttaaagacaaagagcgtccgcg

cggctataccagtaaaattgcaggtatcttacactactacccgctggaggaggttttaacagccgagtat

ctgctggaagaattccgcccggacttaatcgagatggtgctggacaagttacgcccggagaacgtgcgtg

ttgccattgtgagcaagagcttcgagggcaagaccgaccgtaccgaagagtggtacggtacacagtacaa

gcaggaggccatccctgatgaggttattaagaagtggcaaaatgccgacctgaatggtaagtttaagtta

ccgacaaagaacgaattcatcccgaccaactttgaaatcctgccgctggaaaaggaagccaccccgtatc

ctgcactgattaaggacaccgccatgagcaaattatggttcaagcaggacgacaaattcttcctgccgaa

ggcctgcctgaatttcgagttcttcagcccgttcgcctacgttgatccgctgcactgtaatatggcctac

ttatacctggagttactgaaagacagcttaaatgagtatgcatacgccgcagagctggccggtttaagct

acgacctgcaaaataccatttatggcatgtatttaagcgtgaagggctacaacgataaacaaccgatctt

actgaagaaaattattgaaaaaatggccacctttgaaatcgacgagaagcgttttgaaattattaaagag

gcatatatgcgtagcctgaacaattttcgcgccgaacaaccgcaccagcacgcaatgtactacctgcgct

tactgatgaccgaagttgcctggaccaaagacgagctgaaggaagccctggacgatgtgaccttaccgcg

tttaaaggccttcatcccgcaattactgagtcgtctgcacattgaggccctgttacacggtaacatcacc

aagcaagccgcactgggcattatgcagatggttgaggataccctgatcgagcacgcccacaccaaaccgt

tactgccgagtcaactggtgcgctatcgcgaagtgcaactgcctgatcgtggctggtttgtgtatcagca

gcgtaatgaggtgcacaacaactgtggtatcgaaatctactaccaaaccgacatgcaaagcaccagcgag

aacatgttcctggagctgttttgccagatcatcagcgaaccgtgcttcaacaccctgcgcaccaaggagc

aattaggctacatcgtgttcagtggccctcgtcgcgcaaatggtatccagggcttacgcttcatcatcca

gagtgaaaaaccgccgcactacctggaaagtcgtgttgaagcatttttaatcacgatggaaaagagcatc

gaggacatgaccgaggaggccttccagaagcacatccaagccctggcaatccgtcgcttagataagccga

agaagctgagtgccgagtgcgccaagtactggggtgagatcattagccagcagtacaatttcgaccgcga

caacaccgaggttgcatacctgaaaaccctgaccaaagaagacatcatcaaattttacaaggagatgtta

gcagtggatgcaccgcgtcgccataaagttagcgttcatgtgctggcacgcgagatggatagttgtccgg

tggttggtgaattcccgtgccagaatgacatcaacctgagccaagcacctgccttaccgcaaccggaggt

gatccagaacatgacagaattcaagcgcggcctgccgttattcccgttagtgaagccgcacatcaacttc

atggccgcaaaattaaagcttgcggccgcactcgagcaccaccaccaccaccactga</INSDSeq_seq

uence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="50">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>991</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..991</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q99">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Wild type IDE polypeptide

sequence</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Полипептидная последовательность

IDE дикого типа</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..991</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q100">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MNNPAIKRIGNHITKSPEDKREYRGLELANGIKVLLISDPTTDKSSAAL

DVHIGSLSDPPNIAGLSHFCEHMLFLGTKKYPKENEYSQFLSEHAGSSNAFTSGEHTNYYFDVSHEHLEG

ALDRFAQFFLCPLFDESCKDREVNAVDSEHEKNVMNDAWRLFQLEKATGNPKHPFSKFGTGNKYTLETRP

NQEGIDVRQELLKFHSAYYSSNLMAVCVLGRESLDDLTNLVVKLFSEVENKNVPLPEFPEHPFQEEHLKQ

LYKIVPIKDIRNLYVTFPIPDLQKYYKSNPGHYLGHLIGHEGPGSLLSELKSKGWVNTLVGGQKEGARGF

MFFIINVDLTEEGLLHVEDIILHMFQYIQKLRAEGPQEWVFQECKDLNAVAFRFKDKERPRGYTSKIAGI

LHYYPLEEVLTAEYLLEEFRPDLIEMVLDKLRPENVRVAIVSKSFEGKTDRTEEWYGTQYKQEAIPDEVI

KKWQNADLNGKFKLPTKNEFIPTNFEILPLEKEATPYPALIKDTAMSKLWFKQDDKFFLPKACLNFEFFS

PFAYVDPLHCNMAYLYLELLKDSLNEYAYAAELAGLSYDLQNTIYGMYLSVKGYNDKQPILLKKIIEKMA

TFEIDEKRFEIIKEAYMRSLNNFRAEQPHQHAMYYLRLLMTEVAWTKDELKEALDDVTLPRLKAFIPQLL

SRLHIEALLHGNITKQAALGIMQMVEDTLIEHAHTKPLLPSQLVRYREVQLPDRGWFVYQQRNEVHNNCG

IEIYYQTDMQSTSENMFLELFCQIISEPCFNTLRTKEQLGYIVFSGPRRANGIQGLRFIIQSEKPPHYLE

SRVEAFLITMEKSIEDMTEEAFQKHIQALAIRRLDKPKKLSAECAKYWGEIISQQYNFDRDNTEVAYLKT

LTKEDIIKFYKEMLAVDAPRRHKVSVHVLAREMDSCPVVGEFPCQNDINLSQAPALPQPEVIQNMTEFKR

GLPLFPLVKPHINFMAAKLKLAAALEHHHHHH</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="51">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>2976</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..2976</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q101">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>IDE - E111Q mutated, coding

sequence</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Кодирующая последовательность для

мутированного IDE - E111Q</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..2976</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q102">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgaataatcctgcaatcaagcgtattggtaaccatattaccaagagcc

cggaggacaaacgtgagtatcgcggcctggaactggccaatggcatcaaggttctgctgatcagcgaccc

gacaaccgacaagagtagtgcagccctggatgtgcatattggcagcctgagtgatccgcctaacattgcc

ggtctgagccacttctgccaacacatgctgttcctgggcaccaaaaagtacccgaaagaaaacgagtata

gtcagtttctgagcgagcacgcaggtagtagcaatgccttcacaagcggtgagcacaccaattactactt

cgacgtgagccatgaacatctggagggcgcactggatcgctttgcccaattctttctgtgcccgctgttt

gacgaaagctgcaaagaccgtgaggtgaacgccgttgatagcgagcacgagaaaaacgttatgaacgacg

cctggcgcttattccagctggagaaggcaaccggtaacccgaaacacccgtttagtaagttcggcacagg

caacaagtacaccttagaaacccgccctaaccaggagggcattgacgtgcgccaagagttattaaaattt

cacagcgcatactacagcagcaacctgatggcagtgtgtgttctgggccgcgaaagcctggatgatctga

caaatctggttgttaaattattcagtgaggtggagaacaagaacgtgccgctgcctgagtttcctgagca

cccgttccaggaggaacatttaaagcaactgtataaaattgtgccgatcaaagacattcgcaatctgtat

gttacattcccgatcccggacctgcaaaagtactacaagagcaacccgggtcactacttaggccatctga

ttggccacgagggtccgggcagtctgctgagtgaactgaagagcaagggttgggtgaacacactggttgg

tggccagaaggagggcgcacgtggtttcatgttctttattatcaatgtggacctgaccgaagaaggtctg

ctgcacgtggaggacatcatcttacacatgtttcagtacattcagaaattacgcgcagaaggtccgcagg

agtgggtgttccaagagtgcaaggatctgaacgcagtggccttccgctttaaagacaaagagcgtccgcg

cggctataccagtaaaattgcaggtatcttacactactacccgctggaggaggttttaacagccgagtat

ctgctggaagaattccgcccggacttaatcgagatggtgctggacaagttacgcccggagaacgtgcgtg

ttgccattgtgagcaagagcttcgagggcaagaccgaccgtaccgaagagtggtacggtacacagtacaa

gcaggaggccatccctgatgaggttattaagaagtggcaaaatgccgacctgaatggtaagtttaagtta

ccgacaaagaacgaattcatcccgaccaactttgaaatcctgccgctggaaaaggaagccaccccgtatc

ctgcactgattaaggacaccgccatgagcaaattatggttcaagcaggacgacaaattcttcctgccgaa

ggcctgcctgaatttcgagttcttcagcccgttcgcctacgttgatccgctgcactgtaatatggcctac

ttatacctggagttactgaaagacagcttaaatgagtatgcatacgccgcagagctggccggtttaagct

acgacctgcaaaataccatttatggcatgtatttaagcgtgaagggctacaacgataaacaaccgatctt

actgaagaaaattattgaaaaaatggccacctttgaaatcgacgagaagcgttttgaaattattaaagag

gcatatatgcgtagcctgaacaattttcgcgccgaacaaccgcaccagcacgcaatgtactacctgcgct

tactgatgaccgaagttgcctggaccaaagacgagctgaaggaagccctggacgatgtgaccttaccgcg

tttaaaggccttcatcccgcaattactgagtcgtctgcacattgaggccctgttacacggtaacatcacc

aagcaagccgcactgggcattatgcagatggttgaggataccctgatcgagcacgcccacaccaaaccgt

tactgccgagtcaactggtgcgctatcgcgaagtgcaactgcctgatcgtggctggtttgtgtatcagca

gcgtaatgaggtgcacaacaactgtggtatcgaaatctactaccaaaccgacatgcaaagcaccagcgag

aacatgttcctggagctgttttgccagatcatcagcgaaccgtgcttcaacaccctgcgcaccaaggagc

aattaggctacatcgtgttcagtggccctcgtcgcgcaaatggtatccagggcttacgcttcatcatcca

gagtgaaaaaccgccgcactacctggaaagtcgtgttgaagcatttttaatcacgatggaaaagagcatc

gaggacatgaccgaggaggccttccagaagcacatccaagccctggcaatccgtcgcttagataagccga

agaagctgagtgccgagtgcgccaagtactggggtgagatcattagccagcagtacaatttcgaccgcga

caacaccgaggttgcatacctgaaaaccctgaccaaagaagacatcatcaaattttacaaggagatgtta

gcagtggatgcaccgcgtcgccataaagttagcgttcatgtgctggcacgcgagatggatagttgtccgg

tggttggtgaattcccgtgccagaatgacatcaacctgagccaagcacctgccttaccgcaaccggaggt

gatccagaacatgacagaattcaagcgcggcctgccgttattcccgttagtgaagccgcacatcaacttc

atggccgcaaaattaaagcttgcggccgcactcgagcaccaccaccaccaccactga</INSDSeq_seq

uence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="52">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>991</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..991</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q103">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>IDE - E111Q mutated, polypeptide

sequence</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Полипептидная последовательность

для мутированного IDE - E111Q</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..991</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q104">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MNNPAIKRIGNHITKSPEDKREYRGLELANGIKVLLISDPTTDKSSAAL

DVHIGSLSDPPNIAGLSHFCQHMLFLGTKKYPKENEYSQFLSEHAGSSNAFTSGEHTNYYFDVSHEHLEG

ALDRFAQFFLCPLFDESCKDREVNAVDSEHEKNVMNDAWRLFQLEKATGNPKHPFSKFGTGNKYTLETRP

NQEGIDVRQELLKFHSAYYSSNLMAVCVLGRESLDDLTNLVVKLFSEVENKNVPLPEFPEHPFQEEHLKQ

LYKIVPIKDIRNLYVTFPIPDLQKYYKSNPGHYLGHLIGHEGPGSLLSELKSKGWVNTLVGGQKEGARGF

MFFIINVDLTEEGLLHVEDIILHMFQYIQKLRAEGPQEWVFQECKDLNAVAFRFKDKERPRGYTSKIAGI

LHYYPLEEVLTAEYLLEEFRPDLIEMVLDKLRPENVRVAIVSKSFEGKTDRTEEWYGTQYKQEAIPDEVI

KKWQNADLNGKFKLPTKNEFIPTNFEILPLEKEATPYPALIKDTAMSKLWFKQDDKFFLPKACLNFEFFS

PFAYVDPLHCNMAYLYLELLKDSLNEYAYAAELAGLSYDLQNTIYGMYLSVKGYNDKQPILLKKIIEKMA

TFEIDEKRFEIIKEAYMRSLNNFRAEQPHQHAMYYLRLLMTEVAWTKDELKEALDDVTLPRLKAFIPQLL

SRLHIEALLHGNITKQAALGIMQMVEDTLIEHAHTKPLLPSQLVRYREVQLPDRGWFVYQQRNEVHNNCG

IEIYYQTDMQSTSENMFLELFCQIISEPCFNTLRTKEQLGYIVFSGPRRANGIQGLRFIIQSEKPPHYLE

SRVEAFLITMEKSIEDMTEEAFQKHIQALAIRRLDKPKKLSAECAKYWGEIISQQYNFDRDNTEVAYLKT

LTKEDIIKFYKEMLAVDAPRRHKVSVHVLAREMDSCPVVGEFPCQNDINLSQAPALPQPEVIQNMTEFKR

GLPLFPLVKPHINFMAAKLKLAAALEHHHHHH</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к выделенному антителу, которое специфически связывается с разрушающим инсулин ферментом (IDE), к композиции и изделию, его содержащим, а также к способу его получения. Также раскрыты выделенный полинуклеотид, кодирующей указанное антитело, а также клетка, его содержащая. Изобретение эффективно для лечения заболевания, связанного с активностью IDE, диагностики заболевания, связанного с активностью IDE, а также для мониторинга эффективности терапии заболевания, связанного с активностью IDE. 10 н. и 15 з.п. ф-лы, 10 ил., 1 табл., 4 пр.

1. Выделенное антитело, которое специфически связывается с разрушающим инсулин ферментом (IDE), причем указанное антитело содержит аминокислотные последовательности определяющей комплементарность области (CDR), представленные в:

(i) SEQ ID NO: 4 (CDR1), SEQ ID NO: 6 (CDR2) и SEQ ID NO: 8 (CDR3), последовательно расположенные от N до С на тяжелой цепи указанного антитела; и SEQ ID NO: 12 (CDR1), RNN (CDR2) и SEQ ID NO: 16 (CDR3), расположенные последовательно от N до С на легкой цепи указанного антитела;

(ii) SEQ ID NO: 20 (CDR1), SEQ ID NO: 22 (CDR2) и SEQ ID NO: 24 (CDR3), последовательно расположенные от N до С на тяжелой цепи указанного антитела; и SEQ ID NO: 28 (CDR1), DAS (CDR2) и SEQ ID NO: 32 (CDR3), последовательно расположенные от N до С на легкой цепи указанного антитела; или

(iii) SEQ ID NO: 36 (CDR1), SEQ ID NO: 38 (CDR2) и SEQ ID NO: 40 (CDR3), последовательно расположенные от N до С на тяжелой цепи указанного антитела; и SEQ ID NO: 44 (CDR1), DND (CDR2) и SEQ ID NO: 48 (CDR3), последовательно расположенные от N до С на легкой цепи указанного антитела.

2. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания, связанного с активностью IDE, содержащая в качестве активного ингредиента антитело (ii) или (iii) по п. 1 и фармацевтически приемлемый носитель.

3. Антитело по п. 1, которое представляет собой интактное антитело IgG.

4. Способ лечения заболевания, связанного с активностью IDE, у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающий введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела (ii) или (iii) по п. 1, обеспечивая тем самым предотвращение или лечение заболевания, связанного с активностью IDE.

5. Способ по п. 4, дополнительно предусматривающий введение указанному субъекту терапевтического средства для лечения указанного заболевания.

6. Способ по любому из пп. 4, 5, где указанный субъект имеет уровень IDE в биологическом образце, который превышает заданный порог по сравнению с контрольным биологическим образцом от здорового субъекта.

7. Изделие для лечения заболевания, связанного с активностью IDE, включающее упаковочный материал и маркировку, касающуюся лечения заболевания, связанного с активностью IDE, причем указанный упаковочный материал содержит антитело (ii) или (iii) по п. 1; и терапевтическое средство для лечения указанного заболевания.

8. Способ диагностики заболевания, связанного с активностью IDE, у субъекта, предусматривающий определение уровня IDE в биологическом образце от субъекта при применении антитела по п. 1, где, когда указанный уровень указанного IDE превышает заданный порог по сравнению с контрольным биологическим образцом от здорового субъекта, у субъекта диагностируется указанное заболевание.

9. Способ мониторинга эффективности терапии заболевания, связанного с активностью IDE, у субъекта, у которого диагностировано заболевание, предусматривающий определение уровня IDE в биологическом образце от субъекта, подвергающегося терапии с применением антитела по п. 1 или после этой терапии, отличающийся тем, что, когда указанный уровень указанного IDE снижается по отношению к заданному порогу во время или после терапии, терапия признается эффективной.

10. Способ лечения заболевания, связанного с активностью IDE, у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающий:

(a) диагностику субъекта способом по п. 8; и при этом, когда указанный уровень указанного IDE превышает указанный заданный порог по сравнению с контрольным биологическим образцом от здорового субъекта, осуществляют

(b) лечение указанного субъекта терапией заболевания,

обеспечивая тем самым лечение заболевания у субъекта.

11. Способ по любому из пп. 9, 10, в котором указанная терапия включает указанное антитело (ii) или (iii) по п. 1.

12. Способ по п. 4, где указанное заболевание, связанное с указанной активностью IDE, выбрано из группы, состоящей из аутоиммунного заболевания центральной нервной системы, нейродегенеративного заболевания, метаболического синдрома, диабета, ожирения, гипергликемии, поражения сетчатки, почечной недостаточности, повреждения нерва, повреждения микрососудов, инфекции вируса ветряной оспы (VZV) и раны.

13. Способ по любому из пп. 8-10, где указанное заболевание, связанное с указанной активностью IDE, выбрано из группы, состоящей из метаболического синдрома, диабета и ожирения.

14. Способ по п. 4, где указанное заболевание представляет собой диабет.

15. Способ по п. 4, где указанное заболевание представляет собой метаболический синдром.

16. Способ по п. 12, где указанное нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь Паркинсона.

17. Способ по п. 12, где указанное нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера.

18. Способ по п. 12, где указанное аутоиммунное заболевание центральной нервной системы выбрано из группы, состоящей из рассеянного склероза, синдрома Гийена - Барре, миастенического синдрома Ламберта - Итона, миастении гравис, поперечного миелита, прогрессирующей многоочаговой лейкоэнцефалопатии, хронической головной боли и церебрального паралича.

19. Способ по п. 12, где указанное аутоиммунное заболевание центральной нервной системы представляет собой рассеянный склероз.

20. Способ по п. 12, где указанная рана выбрана из группы, состоящей из хронической раны, острой раны, диабетической раны, ишемической раны, язвы, ожога и хирургической раны.

21. Выделенный полинуклеотид, кодирующий антитело по п. 1.

22. Выделенный полинуклеотид по п. 21, в котором последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие указанные аминокислотные последовательности CDR, представляют собой:

(i) SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, aggaataat и SEQ ID NO: 15;

(ii) SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, gatgcatcc и SEQ ID NO: 31; или

(iii) SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, gacaatgat и SEQ ID NO: 47.

23. Клетка-хозяин, продуцирующая антитело против IDE, содержащая выделенный полинуклеотид по любому из пп. 21, 22.

24. Способ получения антитела против IDE, предусматривающий экспрессию в клетке-хозяине полинуклеотида по любому из пп. 21, 22.

25. Способ по п. 24, предусматривающий выделение антитела.