СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВ ИЗ ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ, ОБЛАДАЮЩИХ АУТОИММУННОЙ АКТИВНОСТЬЮ IN VITRO И IN VIVO Российский патент 2004 года по МПК A61K35/12 G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, в частности к клинической иммунологии, и представляет собой способ получения веществ (аутоантигенов тканей), обладающих иммунной (аутоиммунной) активностью по отношению к тканям и органам организмов млекопитающих in vitro и in vivo. Эти вещества могут быть использованы для количественного определения циркулирующих в крови тканевых аутоантител in vitro. Это реализуется путем постановки реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) в микротест-системе с одним из этих веществ и по результатам этой реакции возможна оценка состояния исследуемой ткани, а значит и органа. Последовательная постановка РИГА с набором получаемых веществ позволяет определить аутоиммунное состояние организма в данный момент времени (исследования) и осуществлять мониторинг аутоиммунитета в норме и при патологии.

А также данные вещества способны вызывать повреждение и лизис гомологичной им ткани, сопровождающееся шокогенными, гиперэргическими реакциями организма, вплоть до летального исхода при введении in vivo.

Известны способы получения иммунологически активных веществ из тканей и органов млекопитающих [1], [2], [3].

Наиболее близким является способ [3], где для получения и приготовления иммуноактивного вещества (антигенов тканей глаза человека) использовали ткани человека I (0) группы Rh (-), погибшего от случайной травмы. Органы освобождали от жира, промывали 7-10 раз охлажденным NaCl 0,89% рН 7,2 и измельчали с добавлением стерильного кварцевого песка и NaCl 0,89% в ступке в соотношении 1:5. Измельченная однородная ткань помещалась в бокс при температуре (-20±1)°С на 18 часов, затем переносилось на 6 часов при температуре (+37±1)°С и снова перемещалось в холодильник. Такая процедура повторялась 4-5 раз, обеспечивая переход растворимых антигенов (АГ) в раствор. Затем суспензию центрифугировали при 22300 q в течение 30 минут. Полученные супернатанты, содержащие растворимые АГ соответствующего органа, отсасывали, доводили до содержания белка 20-25 мг/мл и лиофильно высушивали на аппарате КС-6. При таком способе тканевые АГ сохраняли активность 1-2,5 года.

Этот способ обеспечивает достаточно высокую очистку и получение АГ и веществ им подобных, но при постановке РНГА в титре до 1:16 происходят перекрестные реакции с антителами других органов, т.е. имеется иммунная активность (гомологичный антиген - гомологичное антитело и гомологичный антиген - гетерологичное аутоантитело). В этой ситуации нельзя говорить о высокой специфичности вещества и определить его как прямой аутоантиген.

Данный способ не обеспечивает необходимую чистоту и специфичность реакции и, как следствие, точной диагностики состояния ткани, по-видимому, из-за примесей дополнительных ингредиентов (недостаточная чистота вещества, содержание прямых антигенов, аутоантигенов и веществ им подобных), а также из-за сложной структуры данных веществ.

Нами впервые разработан способ получения веществ из тканей и органов млекопитающих, обладающих аутоиммунной активностью in vitro и in vivo. Так же данные вещества сохраняют исходную органную специфичность ткани и оказываются лишенными индивидуальных свойств изоантигенной формы исходного материала донора (организма). Совокупность этих свойств способна обеспечивать большую точность тканевой идентификации в реакциях in vitro и проявлять свою активность in vivo. Вещества имеют большую чистоту самого вещества.

Предложенный нами способ отличается тем, что исходное вещество в замороженном состоянии (четвертый цикл криогенной обработки) дополнительно подвергается облучению γ-квантами энергией 0.37 кДж, интегральной дозой 1.8·10⁴ Гр., на высоковольтном линейном ускорителе У-10 в течение 20-25 минут. Параметры и время облучения подобраны таким образом, что обрабатываемое вещество способно к накоплению энергии. При более продолжительном воздействии на вещество происходит повреждение его биологической структуры.

Способ осуществляется следующим образом: Для приготовления вещества из тканей печени, почек, сердца, желудка, мозга, поджелудочной железы, тимуса, щитовидной железы, кожи были взяты типированные участки ткани животных и здорового человека I (0) группы Rh (-), погибшего от случайной травмы. Типированные ткани тонкого кишечника и легкого получали от животных и мертворожденного ребенка. Навеску органов после освобождения от жира растирали с кварцевым песком и 0,9% раствором NaCl из расчета 1:5, и проводили экстракцию вещества по Грассе с пятикратным замораживанием (-17°С°) и оттаиванием (+37°С°). Причем в четвертый цикл замораживания вещество подвергали обработке гамма-квантами энергией 0,37 кДж интегральной дозой 1,8·10⁴ Гр. При этом неравномерность облучения не превышала 5%, что достигалось расфокусировкой пучка электронов. Доза облучения контролировалась воздухоэквивалентной установкой (прутковой камерой VA-K-252), работающей совместно с прибором VA-J-18. Торможение электронов высокой энергии (до 5 МэВ) происходило на вольфрамовой мишени и ее центр принимался за начало отсчета распределения поля гамма-излучения. Дозы облучения рассчитывались по закономерности, в которой существовала прямая зависимость времени облучения и обратная от квадрата расстояния объект-мишень. Реперная точка излучения находилась на расстоянии 100 см от выходного окна ускорителя. Воздействия в течение 20-25 минут.

Супернатант после центрифугирования (22300 q) стандартизировали по белку (20-22 мг/мл), лиофилизировали и получали целевое вещество.

Пример.

Произведен забор ткани печени морской свинки. Ткань типирована, освобождена от соединительных волокон, жира, гомогенизирована. Взята навеска и растерта с кварцевым песком и 0,9% раствором NaCl из расчета 1:5. Произведена экстракция вещества по Грассе с пятикратным циклом замораживания (-17°С) и оттаиванием (+37°С°). После третьего оттаивания препарат разделили на две равные части, которые заморозили. Одну часть в четвертый цикл замораживания подвергли обработке гамма-квантами энергией 0,37 кДж интегральной дозой 1,8·10⁴ Гр. в течение 23 мин на установке У-10, а другую часть обработке не подвергали. Провели еще один цикл замораживания и оттаивания. Полученные после оттаивания обе части гомогената центрифугированы (22300 q), отделена жидкая часть надосадков, стандартизированы по белку (22 мг/мл в обоих порциях), обе порции полученного супернатанта (облученная и не облученная) разлиты в стеклянные ампулы (5 мл), маркированы и подвергнуты лиофильной сушке. Получено сухое вещество в обоих ампулах (одно подвергшееся гамма-облучению, другое не подвергшееся гамма-облучению), после чего ампулы герметично запаяны в стерильных условиях.

Произведена сравнительная оценка структур полученных веществ.

1. Тканевого вещества обработанного гамма-квантами (γ+).

2. Тканевого вещества без обработки гамма-квантами (γ-) Изучение осуществлено методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ - гель-экслюзивная хроматография), позволяющей разделять исследуемые вещества по величине молекулярной массы и методом ультрафиолетового сканирования (УФ), позволяющими оценивать чистоту разделяемых препаратов по определению длины волны максимальной адсорбции, учитывая спектры каждого пика при длине волн от 200 до 350 нм, с интервалом 5 нм.

ВЭЖХ проводили в изократическом режиме, применяя готовую гельфильтрационную колонку NSK300SW, размером 7,5×300 мм. Для элюции использовали буфер, приготовленный на деионизированной воде, содержащей 0,14 М NaCl и 0,02% NaN₃ при скорости потока 1 мл/мин. В качестве детектора служил проточный двухканальный спектрофотометр с переменной длиной волны, настроенной на 254 и 280 нм.

При проведении хроматографии установлено, что образец печень (γ-) имеет четыре пика с временем удержания 4,5; 8,5; 11,2 и 12,3 мин, что говорит о негомогенности препарата и его многокомпонентности (не менее 4-х) (фиг. 1а). УФ-сканирование этих четырех пиков также показало неоднородность препарата с несколькими пиками максимума поглощения. Наиболее гоммогенным был четвертый пик и отличался от трех пиков поглощения (фиг. 1.1-1.4).

Образец вещества ткани печени (γ+) при исследовании ВЭЖХ выходил только одним пиком с временем удержания 12,3 мин. (фиг. 2а) и при УФ-сканировании был обнаружен один его максимум поглощения, что указывает на гомогеность препарата (фиг.2.1-2.3). По спектральной характеристике и времени удержания он соответствовал четвертому пику образца вещества печени (γ-). Иными словами обработка γ-квантами "отрезала" три первые пика препарата γ- и сделала препарат γ+ однородным и гомогенным.

Полученные вещества из тканей органов γ+ и аналогичные γ- были использованы для получения противоорганных эритроцитарных антигенных диагностикумов (ПЭД), позволяющих выявлять гомологичные аутоантитела в сыворотке в микротест-системе РНГА по классическим методикам. В данном случае получали гипериммунную кроличью противопеченочную сыворотку (аналогичным образом получали и все другие органоспецифические гипериммунные кроличьи сыворотки). Это осуществляли подкожным введением 1 мл вещества, полученного из ткани печени, разведенного в 2 мл дистиллированной воды, совместно с 5 мл подогретого (45±1)°С° полного адъюванта Фрейнда. Через каждые 7 дней кролику трижды внутримышечно вводили по 1 мл вещества, полученного из ткани печени с последующим обескровливанием на 10 сут после последней инъекции. На каждые 100 мл сыворотки добавляли 0,5 мл 10% водного раствора хинозола (консервант) и разливали по ампулам.

Контроль чувствительности и специфическую активность противоорганных эритроцитарных диагностикумов ПЭД (γ+) в сравнении с ПЭД (γ-) изучали в РИГА микрометодом C.Takatsy (1952) согласно "Инструкции по применению серологических методов диагностики при эпизоотологическом обследовании природных очагов чумы" (Саратов, 1974).

Специфичность положительного результата РНГА (контроль отрицательный - отсутствие пассивной гемагглютинации) проверяли в реакции торможения непрямой гемагглютинации (РТНГА) при добавлении к сыворотке тканевого соответствующего вещества, обладающего свойствами антигена, что сопровождается образованием комплексов подобных антитело + антиген и агглютинации эритроцитов не происходит.

Установлено, что при использовании ПЭД (γ+) к веществу ткани печени с соответствующей гипериммунной противопеченочной кроличьей сывороткой абсолютные титры в РНГА составляли (1:512-1:1024), а при ПЭД (γ-) соответственно (1:64-1:128), то есть чувствительность метода повысилась в 3-4 раза при использовании ПЭД (γ+).

Кроме того, использование ПЭД (γ+) позволило повысить специфичность РНГА за счет исключения в субстанции перекрестно-реагирующих тканевых веществ, обладающих активностью антигенов. Например, антиген ткани печени (по прототипу) в небольшом титре (1:8) в ряде случаев дают положительную реакцию с кроличьей гипериммунной сывороткой к тканям почек. Иными словами, происходит идентификация строго “противопеченочных” аутоантител, так как вещество после обработки γ-квантами стало строго "печеночным".

Таким образом, обработка тканевых субстратов γ-квантами сопровождается изменением их изоантигенной структуры, “архитектоники” и способствует большей специфичности структуры полученного вещества, что при их использовании в качестве сенситинов для РНГА сопровождается повышением чувствительности реакции в 3-4 раза и ее специфичности.

Полученное вещество, может рассматриваться как специфический маркер ткани, который способен регистрировать гомологичные аутоантитела изучаемых тканей в сыворотке крови (in vitro).

При введении этого вещества в организм реципиента (мы исследовали реакцию организма и ткани печени морской свинки на введение полученного нами вещества) возникает ряд расстройств гиперэргического типа, в виде последовательных шокогенных реакций, запускающих общий танатогенез организма, вследствие лизиса гепатоцитов и отторжения поврежденной печеночной ткани. Контроль путем электронной микроскопии подтверждает лизис гепатоцитов и сохранность индеферентных по своим изоантигенным структурам тканей, что еще раз подтвержадет высокую специфичность данного вещества и его активность (in vivo).

Технический результат - получение вещества, обладающего иммунной (аутоиммунной) активностью in vitro и in vivo, повышение его активности и тканевой специфичности, проявляющейся в повышении достоверности результатов диагностики, большей специфичности реакции, стабильности и повторяемости результатов.

Литература

1. Каргина И.Б., Сысоева О.Б., Арион В.Я., Лопухин Ю.М. Способ получения иммунологически активных веществ из нейросекреторных структур эпиталамуса мозга млекопитающих. 1999 г.

2. Шанина Л.Н. Аутоиммунные реакции при чумном и холерном вакцинальном и инфекционных процессах и методы их коррекции. Дис. д.м.н., Саратов, 1985 г.

3. Гулида О.Л. Получение эритроцитарного диагностикума к тканям антигена глаза (хрусталик, стекловидное тело) 1996 г.

Изобретение относится к области медицины, в частности к клинической иммунологии. Способ заключается в том, что материал типируют, гомогенизируют с кварцевым песком и 0,9% раствором натрия хлорида в соотношении 1:5, экстрагируют по Грассе с пятикратным циклом замораживают при -17°С и оттаивают - при +37°С, центрифугируют гомогенат и выделяют супернатант, стандартизируют белок в нем спектрометрическим методом 20-22 мг/мл, лиофильно высушивают, при этом дополнительно в четвертый цикл замораживания проводят гамма-квантовую обработку вещества γ-квантами энергией 0.37 кДж, интегральной дозой 1.8·10⁴ Гр., в течение 20-25 минут. Технический результат: вещества сохраняют исходную органную специфичность ткани и оказываются лишенными индивидуальных свойств изоантигенной формы исходного материала донора. Совокупность этих свойств обеспечивает большую точность тканевой идентификации в реакциях in vitro, и проявляет свою активность in vivo. Вещества имеют большую чистоту самого вещества. 9 ил.

Способ получения веществ из тканей и органов млекопитающих, обладающих аутоиммунной активностью in vitro и in vivo, характеризующийся тем, что материал типируют, гомогенизируют с кварцевым песком и 0,9%-ным раствором натрия хлорида в соотношении 1:5, экстрагируют по Грассе с пятикратным циклом, замораживают при -17°С и оттаивают при +37°С, центрифугируют гомогенат и выделяют супернатант, стандартизируют белок в нем спектрометрическим методом 20-22 мг/мл, лиофильно высушивают, при этом дополнительно в четвертый цикл замораживания проводят гамма квантовую обработку вещества γ квантами энергией 0,37 кДж, интегральной дозой 1,8·10⁴ Гр, в течение 20-25 мин.