СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТОЯНИЯ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ И АНТИОКСИДАНТНЫХ СИСТЕМ В УЧАСТКАХ ПОРАЖЕНИЯ КОЖИ У БОЛЬНЫХ ВИТИЛИГО Российский патент 2004 года по МПК G01N33/48 G01N33/52 A61B10/00 

Изобретение относится к области медицины, а именно к дерматологии, и может быть использовано при диагностике и выборе тактики лечения больных витилиго, а также в биохимии для исследования патогенетических механизмов развития данного заболевания.

Витилиго является заболеванием с недостаточно изученной этиологией и патогенезом, поэтому применение адекватного лечения этого заболевания затруднительно. В последние 5 лет активно стал обсуждаться вопрос об активации свободнорадикального окисления в коже, а также снижении активности антиоксидантных систем как основных звеньев патогенеза витилиго. В связи с этим важным является выбор адекватного, доступного и информативного способа оценки свободнорадикальных реакций и антиоксидантных систем в коже при этом заболевании с целью выбора патогенетически обоснованного способа его диагностики и лечения.

Известен способ оценки свободнорадикального окисления в коже с помощью спектроскопии электронного парамагнитного резонанса (Fuchs J., Herrling Th., Groth N. Detection of free radicals in skin: a review of the literature and new developments. / In: Oxidants and antioxidants in cutaneous biology. Eds: Thiele J., Elsner P. Current Problems in Dermatology, 2001, vol.29, p.1-17), заключающийся в идентификации и определении концентрации продуктов свободнорадикального окисления по резонансному поглощению микроволнового излучения в образцах неизмененной кожи, имеющих парамагнитные центры. В связи с коротким временем жизни свободных радикалов их регистрация возможна либо в глубоко замороженных образцах, либо с помощью специфических спиновых ловушек, которые перехватывают радикалы и переводят их в более устойчивую форму, позволяющую зарегистрировать эндогенные свободнорадикальные состояния. Результат исследования оценивают по амплитуде спектра электронного парамагнитного резонанса. Этот способ применяют в последние 5-7 лет для изучения патогенеза заболеваний кожи.

Недостатком этого способа является возможность регистрации только промежуточных продуктов свободнорадикального окисления, которые обычно находятся в низких концентрациях, что требует высокой чувствительности метода, т.е. применения специального, дорогостоящего оборудования, позволяющего многократно накапливать сигналы и проводить их математическую обработку. Сложность, трудоемкость, необходимость специально подготовленного высококвалифицированного персонала и высокая стоимость ограничивают функциональные возможности метода.

Известен способ оценки свободнорадикального окисления в коже по измерению уровня одного из продуктов этого процесса - малонового диальдегида и его производных (Сергеев П.В., Ухина Т.В., Шимановский Н.Л. Влияние разных лекарственных форм прогестерона на перекисное окисление липидов и редокс-систему глутатиона в тканях кожи крыс при экспериментальном дерматите / Бюл. эксперим. биологии и медицины, 2000, том 129, №1, стр.186-188). Способ заключается в проведении реакции между малоновым диальдегидом и его производными, содержащимися в ткани, и тиобарбитуровой кислотой. В результате этой реакции образуется окрашенное соединение - триметиновый комплекс, в котором на одну молекулу малонового диальдегида приходится две молекулы тиобарбитуровой кислоты (Ohkawa H., Ohishi N., Yagi К. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction / Analyt Biochem, 1979, v.95, р.351-358). Интенсивность окрашивания триметинового комплекса затем регистрируется на спектрофотометре, что позволяет проводить количественное определение уровня малонового диальдегида в образце ткани.

Несмотря на доступность, этот способ малоинформативен, поскольку с его помощью в коже измеряют только начальный, исходный уровень продуктов окисления. Однако чувствительность кожи к повреждающим агентам может быть оценена только по реакции ткани на индукцию свободнорадикального окисления. Именно скорость накопления продуктов индуцированного свободнорадикального окисления, но не их начальный уровень, прямо коррелирует с состоянием ткани (Arkhipenko Yu.V., Sazontova T.G., Rice-Evans С. Hypertrophy and regression of rat heart: free radical ralated metabolic systems. / Pathophysiology, 1997, v.4, №4, р.241-248).

Кроме того, способ определения малонового диальдегида в коже не применяли у людей, страдающих витилиго, а использовали только при экспериментальной работе на животных и при исследовании патогенеза псориаза и контактного дерматита.

В качестве ближайшего аналога принят способ определения состояния свободнорадикального окисления в периферической крови у больных витилиго (Dell'Anna M.L., Maresca V., Briganti S. et al. Mitochondrial impairment in peripheral blood mononuclear cells during the active phase of vitiligo / J. Invest Dermatol, 2001, v.117(4), p.908-913). Способ основан на изучении повреждений, вызванных активными формами кислорода, в эритроцитах и моноцитах периферической крови у больных витилиго. Состояние свободнорадикального окисления определяют по способности активных форм кислорода повреждать мембраны и нарушать мембранный потенциал митохондрий, изменения которого и регистрируют с помощью специальных электродов.

Однако помимо сложности и трудоемкости регистрации этот способ является опосредованным, поскольку измеряется не уровень свободнорадикальных продуктов, а повреждение мембраны, которое помимо действия активных форм кислорода зависит от целого ряда факторов, например содержания в мембране ненасыщенных, жирных кислот, уровня металлов с переменной валентностью и других факторов. Кроме того, оцененный таким способом уровень свободнорадикальных продуктов в форменных элементах крови может не соответствовать состоянию свободнорадикального процесса в коже и, таким образом, не является надежным диагностическим параметром.

Задачей изобретения является создание эффективного, простого и точного способа определения состояния свободнорадикального окисления и антиоксидантных систем в участках поражения кожи у больных витилиго.

Сущность изобретения состоит в том, что способ определения состояния свободнорадикального окисления и антиоксидантных систем в участках поражения кожи у больных витилиго характеризуется тем, что производят забор образцов пораженной и неизмененной кожи, замораживают в жидком азоте, измельчают, гомогенизируют в два этапа с последующим отделением аликвот супернатанта, определяют в них спектрофотометрически активность ферментов антиоксидантной системы - каталазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы - и устанавливают характер ее изменения в сторону повышения, снижения или его отсутствие в пораженной коже по сравнению с неизмененной, в соответствии с которым выбирают систему индукции свободнорадикального окисления, затем аликвоты гомогената разводят средой гомогенизирования, помещают в микроячейки, преинкубируют, после чего добавляют выбранную ранее систему индукции и проводят реакцию индуцирования свободнорадикального окисления при 37° С в течение 20-40 минут, отделяют аликвоты, добавляют их в количестве 50 мкл к 150 мкл реагента, содержащего 0,9-1,2% 2-тиобарбитуровую кислоту, 0,54% додецилсульфат натрия и 10,8-15,3% уксусную кислоту, полученные образцы преинкубируют, затем нагревают до 95° С и инкубируют в течение 40 минут, после появления окрашивания осевший коагулированный белок отделяют, а в полученных супернатантах определяют степень окрашивания на спектрофотометре, регистрируя спектр поглощения тиобарбитурат-активных продуктов в диапазоне 480-590 нм, находят его максимум, по которому определяют концентрацию продуктов индуцированного свободнорадикального окисления при различных временных интервалах инкубации образцов, строят график зависимости их накопления от времени инкубации, по которому определяют скорость их накопления, и при ее превышении более чем на 30% в пораженной коже по сравнению с неизмененной и одновременно сниженной или неизмененной активности ферментов определяют состояние активации свободнорадикального окисления и снижение активности антиоксидантных систем и устанавливают соответственно свободнорадикальный характер повреждения кожи.

Использование изобретения позволяет получить следующий технический результат.

Способ позволяет впервые объективно и точно определить истинное соотношение свободнорадикальных процессов и антирадикальной защиты в поврежденной коже в очагах витилиго, оценить по этим показателям степень выраженности патологического процесса и чувствительность кожи в очагах витилиго к действию экзогенных повреждающих факторов, связанных с активными формами кислорода, и подобрать адекватную данному состоянию кожи терапию.

Весь процесс диагностики, включая забор ткани, занимает несколько часов. Способ прост в исполнении, не требует сложного оборудования или дорогостоящих расходных материалов, при этом высокоинформативен.

Способ может быть эффективно использован не только в биохимической, но и в любой клинической лаборатории, позволяя решить вопрос об адекватной оценке про- и антиоксидантных систем в образцах кожи при витилиго, что позволяет наиболее объективно выбрать способ лечения и методику его проведения в каждом конкретном случае. Особенное внимание к данному способу может быть проявлено в случаях сложной патологии, когда витилиго отягощено аллергическими проявлениями, онкологическими изменениями и т.д., т.е. в тех случаях, когда не существует объективных критериев решения вопроса о назначении определенных лекарственных средств, способных изменить баланс между оксидантами и антиоксидантами в клетке.

Технический результат достигается за счет того, что авторами впервые предложено проводить сравнительное исследование ткани, взятой непосредственно из патологического очага кожи больного витилиго и из не измененной на вид кожи того же больного. Впервые предложен точный и информативный, адекватный состоянию ткани способ оценки свободнорадикальных реакций и антиоксидантных систем в коже у больных витилиго, который основан на определении чувствительности измененной ткани кожи к индуцированному свободнорадикальному окислению при существующем в этом участке кожи уровне антирадикальной защиты.

По изменению соотношения между параметрами прооксидантных и антиоксидантных систем в очаге измененной кожи при витилиго по сравнению с неизмененной кожей у того же больного впервые предложено оценивать смещение равновесия в сторону окислительных процессов в очаге витилиго. Впервые показана эффективность определения соотношения между измененной чувствительностью ткани к индукции свободнорадикального окисления in vitro (изменение скорости накопления продуктов индуцированного свободнорадикального окисления) и активностью антиоксидантной защиты для патогенетически обоснованного диагноза свободнорадикального повреждения меланоцитов при витилиго и выбора лечения для того или иного пациента.

Способ осуществляется следующим образом.

Производят забор биоптатов кожи больного витилиго из пораженного (депигментированного) и видимо неизмененного участков кожи. Для этого под местной анестезией с помощью дерматологического пробойника препарируют образец кожи. Образцы пораженной и неизмененной кожи быстро замораживают в жидком азоте вплоть до определения биохимических параметров. Время от начала процедуры забора биоптатов до замораживания не должно превышать 15 секунд. Взятые пробы взвешивают и измельчают в ступке с использованием инертных тефлоновых или кварцевых гранул в течение 50 секунд при температуре 4° С, затем продолжают измельчение в гомогенизаторе тефлон-стекло в среде гомогенизирования, содержащей 20 мМ Tris-HCl (pH 7,4) и 100 мM NaCl, в соотношении ткань-среда, равном 1:5. Затем еще раз повторяют предыдущий этап гомогенизации. Общее время гомогенизирования не превышает 3,5 мин и гомогенизацию проводят при температуре 4° С. Полученные образцы центрифугируют в микропробирках при 1500 оборотах в минуту в течение 10 минут и отбирают аликвоты супернатанта для проведения свободнорадикального окисления и определения активности ферментов антиоксидантной защиты.

Определяют активность ферментов антиоксидантной системы - каталазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы - известными для этих ферментов спектрофотометрическими методами: активность каталазы по методу Luck Н. (Luck И. Catalase. / In: Methods of enzymatic analyses. Editor: Bergmeyer H.U., New-York, Verlag-Chemie Academic Press, 1963, p.885-888); активность супероксиддисмутазы по методу Beauchamp С. (Beauchamp С., Fridovich I. Superoxid dismutase: improved assay and an assay applicable to acrilamide gels. / Analit Biochem, 1971, v.44, p.276-287); активность глутатионпероксидазы по методу Paglia D. (Paglia D., Valentin W. Studies of a quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutation peroxidase. / J. Lab Clin Methods, 1967, v.70, p.158-169); активность глутатионредуктазы по методу Beutler E. (Beutler E. Red cell metabolism. A manual of biochemical methods. / In: Orlando, Fl. Gune and Stratton inc., 1984, 188 p.), с применением микрокювет 0,1-0,2 мл и с длиной пути луча 1 см, при жесткой фиксации микрокювет в кюветодержателе.

Устанавливают характер изменения активности ферментов в сторону повышения, снижения или его отсутствие в пораженной коже по сравнению с неизмененной, по которому судят о наличии активации антиоксидантной системы, ее снижении или отсутствии изменений.

Затем для последующего проведения реакции индуцированного свободнорадикального окисления выбирают систему индукции свободнорадикального окисления in vitro в зависимости от степени изменения активности ферментов антиоксидантной защиты в очаге витилиго по сравнению с участком видимо неизмененной кожи. При повышении активности ферментов антиоксидантной защиты в очаге витилиго, по сравнению с аналогичными показателями в образце участка видимо не измененной кожи этого же больного, выбирают систему окисления, содержащую 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и 1,2-10 мкМ FeSО₄·_{10H2O. При отсутствии изменений или при снижении активности ферментов антиоксидантной защиты в очаге витилиго по сравнению с образцом участка видимо неизмененной кожи применяют систему, содержащую 0,1-0,75 мМ аскорбиновой кислоты.}

Аликвоты гомогената разводят в 5 раз средой гомогенизирования (содержащей 20 мМ Tris-HCl (рН 7,4) и 100 мM NaCl) и помещают в микроячейки. Затем преинкубируют полученный образец в микроячейках в течение 5 минут при 37° С и постоянным перемешивании. Концентрация белка в полученной смеси в микроячейках не должна превышать 1,5 мг/мл. Растворы аскорбиновой кислоты и FeSO₄ для индуцирования свободнорадикального окисления готовят за 15 мин до начала преинкубации и добавляют в микроячейки выбранную ранее систему индукции свободнорадикального окисления в соответствующих концентрациях.

Проводят реакцию индуцирования свободнорадикального окисления при 37° С и при постоянном перемешивании в течение 20-40 мин в зависимости от выбранной системы окисления. Затем отделяют аликвоты для определения продуктов свободнорадикального окисления. Параллельно ставят контроль на автоокисление в тех же условиях, но без добавления индукторов окисления - аскорбиновой кислоты и FeSO₄.

В отобранных аликвотах определяют концентрацию продуктов свободнорадикального окисления, которую оценивают по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой. Для этого к 150 мкл реагента, содержащего 0,9-1,2% 2-тиобарбитуровую кислоту, 0,54% додецилсульфат натрия и 10,8-15,3% уксусную кислоту (рН 3,5), добавляют 50 мкл отобранных аликвот.

Полученные образцы преинкубируют при 4° С в течение 60 мин для повышения стабильности получаемых результатов (стабильность окраски, характеризующей концентрацию продуктов свободнорадикального окисления). Затем эти образцы нагревают до 95° С и инкубируют 40 мин, применяя обратные холодильники для каждой пробы во избежание выпаривания смеси. После появления окрашивания осевший, коагулированный белок отделяют от образца путем центрифугирования в микроцентрифужных пробирках при 1400g в течение 10 мин. В полученных прозрачных супернатантах определяют степень окрашивания на спектрофотометре, регистрируя спектр поглощения тиобарбитурат-активных продуктов в диапазоне 480-590 нм и находят максимум этого спектра поглощения, по которому определяют концентрацию продуктов индуцированного свободнорадикального окисления при различных временных интервалах инкубации образцов в выбранной системе окисления и выражают их в нмоль/мг белка/мл.

После этого строят график зависимости накопления продуктов свободнорадикального окисления от времени инкубации. Скорость накопления продуктов индуцированного свободнорадикального окисления определяют по полученному графику, используя компьютерную программу из пакета Microsoft Excel.

При превышении скорости накопления продуктов свободнорадикального окисления в пораженной коже (очаге витилиго) по сравнению с неизмененной более чем на 30% и одновременно сниженной или неизмененной активностью одного и более ферментов антиоксидантной системы определяют состояние активации свободнорадикального окисления, снижение активности антиоксидантных систем и устанавливают соответственно свободнорадикальный характер повреждения кожи. Это позволяет выбрать патогенетически обоснованную терапию, включающую антиоксидантные препараты. Дозы и схему назначения антиоксидантных препаратов подбирают индивидуально в зависимости от степени изменения скорости свободнорадикального окисления и степени изменения активности антиоксидантных ферментов.

Способ испытан на базе Российской медицинской академии последипломного образования и ГУ НИИ Общей патофизиологии и патоморфологии РАМН на 17 больных витилиго, из них 10 мужчин и 7 женщин в возрасте от 16 до 53 лет, давность заболевания от 1 до 12 лет. У всех больных был выявлен свободнорадикальный характер поражения кожи в очагах витилиго, что позволяет предположить его ведущую роль в развитии витилиго.

Пример 1. Больной К., 27 лет, страдает распространенным витилиго в течение последних 3 лет. Под местной анестезией у больного из лопаточной области взяли биоптаты пораженного и видимо неизмененного участков кожи. Образцы пораженной и неизмененной кожи немедленно заморозили в жидком азоте.

Взятые образцы измельчили и гомогенизировали. Затем определяли активность ферментов антиоксидантной системы в гомогенате каждого образца спектрофотометрическими методами. При этом в поврежденной коже выявили снижение активности каталазы на 27% по сравнению с аналогичными показателями в неизмененной коже, снижение активности супероксиддисмутазы - на 23%, снижение активности глутатионпероксидазы - на 14%, однако активность глутатионредуктазы не изменялась. Учитывая полученные данные, выбрали систему для индукции свободнорадикального окисления, содержащую 0,1 мМ аскорбиновой кислоты.

Аликвоты гомогената взятых биоптатов развели в 5 раз средой гомогенизирования, содержащей 20 мМ Tris-HCl (рН 7,4) и 100 мM NaCl, проинкубировали при 37° С в течение 5 минут и при постоянном перемешивании. После чего в полученную смесь добавили выбранный ранее и приготовленный непосредственно перед проведением реакции раствор аскорбиновой кислоты.

Реакция индуцирования свободнорадикального окисления проводилась при 37° С в течение 40 минут. Затем отбирались аликвоты, которые в количестве 50 мкл добавили к 150 мкл реагента, содержащего 0,9-1,2% 2-тиобарбитуровую кислоту, 0,54% додецилсульфат натрия и 10,8-15,3% уксусную кислоту (рН 3,5). Полученные образцы проинкубировали при 4° С в течение 60 мин для повышения стабильности получаемых результатов (стабильность окраски, характеризующей концентрацию продуктов свободнорадикального окисления). Затем эти образцы нагрели до 95° С и инкубировали 40 мин, применяя обратные холодильники для каждой пробы во избежание выпаривания смеси. После появления окрашивания осевший, коагулированный белок отделили от образцов путем центрифугирования в микроцентрифужных пробирках при 1400g в течение 10 мин. В полученных прозрачных супернатантах на спектрофотометре определяли степень окрашивания путем регистрирования спектра поглощения тиобарбитурат-активных продуктов в диапазоне 480-590 нм и находили максимум этого спектра поглощения. Затем строили графики зависимости накопления продуктов свободнорадикального окисления от времени инкубации. Скорость накопления продуктов индуцированного свободнорадикального окисления рассчитывается по полученным графикам (см. фиг.1 и 2).

В результате проведенных реакций и расчетов определили, что у данного больного в участке поврежденной кожи исходный уровень продуктов свободнорадикального окисления не был изменен по сравнению с аналогичными показателями в участке неизмененной кожи, при этом скорость накопления продуктов индуцированного свободнорадикального окисления была повышена на 45%. Эти данные свидетельствуют о свободнорадикальном характере повреждения кожи в очаге витилиго, для коррекции которого рекомендовано назначение препаратов, обладающих антиоксидантным эффектом.

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии. Сущность способа: производят забор образцов пораженной и неизмененной кожи, измельчают, гомогенизируют, отделяют аликвоты супернатанта, определяют в них спектрофотометрически активность ферментов антиоксидантной системы, выбирают систему индукции свободнорадикального окисления и проводят соответствующую реакцию индуцирования. В полученных супернатантах регистрируют спектр поглощения тиобарбитурат-активных продуктов в диапазоне 480-590 нм, находят его максимум, по которому определяют концентрацию продуктов индуцированного свободнорадикального окисления. Затем строят график зависимости их накопления от времени инкубации, по которому определяют скорость их накопления, и при ее превышении более чем на 30% в пораженной коже по сравнению с неизмененной и одновременно сниженной или неизмененной активности ферментов определяют состояние активации свободнорадикального окисления и снижение активности антиоксидантных систем и устанавливают соответственно свободнорадикальный характер повреждения кожи. Способ позволяет определить истинное соотношение свободнорадикальных процессов и антирадикальной защиты в поврежденной коже в очагах витилиго, оценить степень выраженности патологического процесса и подобрать адекватную данному состоянию кожи терапию. 2 ил.

Способ определения состояния свободнорадикального окисления и антиоксидантных систем в участках поражения кожи у больных витилиго, характеризующийся тем, что производят забор образцов пораженной и неизмененной кожи больного, замораживают в жидком азоте, затем при 4°С измельчают, гомогенизируют дважды в среде, содержащей 20 мМ Tris-HCl и 100 мМ NaCl, затем центрифугируют, отделяют аликвоты супернатанта, определяют в них спектрофотометрически активность ферментов антиоксидантной системы - каталазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы и устанавливают характер ее изменения в пораженной коже по сравнению с неизмененной, в соответствии с которым выбирают систему индукции свободнорадикального окисления, при повышении активности ферментов, содержащую 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и 1,2-10 мкМ FeSO₄·10H₂O, при отсутствии изменений или при снижении активности ферментов - содержащую 0,1-0,75 мМ аскорбиновой кислоты, затем аликвоты гомогената разводят средой гомогенизирования, помещают в микроячейки, преинкубируют при 37°С, после чего добавляют выбранную систему индукции и проводят реакцию индуцирования свободнорадикального окисления при 37°С в течение 20-40 мин, отделяя аликвоты при различных временных интервалах инкубации, добавляют их в количестве 50 мкл к 150 мкл реагента, содержащего 0,9-1,2% 2-тиобарбитуровой кислоты, 0,54% додецилсульфата натрия и 10,8-15,3% уксусной кислоты, полученные образцы преинкубируют при 4°С, затем нагревают до 95°С и инкубируют в течение 40 мин, после появления окрашивания осевший коагулированный белок отделяют цетрифугированием, в полученных супернатантах определяют степень окрашивания на спектрофотометре, регистрируя спектр поглощения тиобарбитурат-активных продуктов в диапазоне 480-590 нм, находят его максимум, по которому определяют концентрацию продуктов индуцированного свободнорадикального окисления, строят график зависимости их накопления от времени инкубации, по которому определяют скорость их накопления, и при ее превышении более чем на 30% в пораженной коже по сравнению с неизмененной и одновременно сниженной или неизмененной активности ферментов определяют состояние активации свободнорадикального окисления и снижение активности антиоксидантных систем и устанавливают соответственно свободнорадикальный характер повреждения кожи.