СПОСОБ ИНДИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2005 года по МПК C12Q1/04 C12Q1/70 C12Q1/04 C12R1/92 

Изобретение относится к способу проведения анализа на наличие микроорганизмов в воздушной или жидкой среде и может быть использовано для мониторинга в периодическом режиме окружающей среды, преимущественно в закрытых помещениях, в местах скопления людей.

Основные требования к методам индикации микроорганизмов сводятся к получению результатов анализа в максимально короткие сроки, обеспечению высокой специфичности метода в сочетании с высокой чувствительностью, а также достаточной производительностью, простотой, доступностью и воспроизводимостью.

Известен способ и сенсорное устройство для обнаружения микроорганизмов в клинических и неклинических образцах (US 5976827, 1999). Сенсорное устройство обеспечивает культивирование колоний микроорганизмов из жидкой пробы и включает средство для обнаружения и количественного определения микроорганизмов. Сенсорное устройство имеет матричный слой для иммобилизации микроорганизмов и чувствительный слой и включает в себя место для приема жидкой пробы, механизм для иммобилизации жидкой пробы на внутренней поверхности пластины, питательные вещества для поддержания роста микроорганизмов в пробе и датчик для обнаружения и/или подсчета колоний микроорганизмов в клиническом или неклиническом образце.

Известен также способ обнаружения микроорганизмов с использованием бактериофага (US 5958675, 1999), являющийся ближайшим аналогом предлагаемого изобретения. Способ обнаружения в анализируемой пробе микроорганизмов предусматривает следующие стадии:

- приведение анализируемой пробы в контакт с бактериофагом, который способен размножаться в бактериях;

- нанесение пробы на водонепроницаемую поверхность носителя для выращивания микроорганизмов, который содержит контрастно окрашивающий краситель и осаждающий краситель (комбинация осаждающего красителя и контрастно окрашивающего красителя улучшает визуализацию пятен, осадок образуется в пятнах в результате ферментативного расщепления осаждающего красителя ферментом бактериального газона);

- образование бактериального газона, в котором бактериофаг может размножаться;

- обнаружение пятен на бактериальном газоне, что указывает на присутствие специфичных микроорганизмов.

К недостаткам ближайшего аналога относятся необходимость длительного культивирования микроорганизмов, невысокая точность учета результатов, несмотря на применение дефицитных красителей, низкая производительность и, что особенно важно, отсутствие возможности для автоматизации процесса, т.е. непригодность для мониторинга окружающей среды, так как предназначен для однократного применения.

Задачей, решаемой предлагаемым изобретением, является создание способа индикации микроорганизмов для целей мониторинга окружающей среды без выделения искомого микроорганизма в чистой культуре, отличающегося к тому же высокой специфичностью и чувствительностью, т.е. определением в пробе малого числа клеток микроорганизма.

В основу способа положены многократное усиление (“амплификация”) сигнала о наличии микроорганизмов, в частности бактерий, что позволяет повысить чувствительность способа, и специфичность, сводящая к минимуму получение ложных результатов: усиление сигнала достигается в процессе размножения бактериофагов (фагов) после заражения даже единичных клеток (при этом титр фага, т.е. число его корпускул возрастает примерно на два порядка), а специфичность - в результате особенностей взаимодействия фагов с бактериями. При этом ускорение регистрации сигнала о присутствии искомого вида бактерий и подтверждение его специфичности осуществляется на двух этапах. На первом этапе используются оптические методы, позволяющие фиксировать увеличение титра фагов после размножения их в бактериях, например, с помощью светорассеяния, не прибегая к длительной и трудоемкой процедуре титрации фага. На втором этапе об увеличении титра фага и его специфичности судят по реакции биосенсора или по появлению (либо возрастанию) радиоактивности на поверхности сорбента.

Для решения поставленной задачи воздух пропускают через жидкую среду, необходимую для поддержания жизнеспособности микроорганизмов, и добавляют к ней фаг, способный размножаться в бактериях (опытная проба); контролем служит среда, к которой фаг не добавляют. Через час или полтора - время, требующееся для размножения фага в бактериях, если они присутствуют в среде, измеряют степень светорассеяния в опытной и контрольной пробах. Появление или усиление светорассеяния в опытной пробе свидетельствует о нарастании титра фага, т.е. о наличии в среде бактерий. В таком случае для окончательного подтверждения факта прироста фага и его специфичности используют биосенсор.

Для измерения светорассеяния (эффект Тиндаля) применяют, например, фотоэлектрический регистратор и установку с гелиево-неоновым лазером или прибор с йодной лампой в качестве источника света, модернизированного с помощью оптического волокна, и светофильтра для регистрации излучения под углом 90° к падающему лучу. Использование указанных средств позволяет выявлять фаги в интервале 10⁷-10⁸ в 1 мл.

В качестве биосенсора используют, например, пьезокварцевый резонатор, обладающий частотой колебаний 8-12 МГц, с серебряными электродами, на которые предварительно нанесены иммуноглобулины (антитела), специфичные для бактериофага (легко регенерируемые иммуносорбенты для фагов). Источником антител служит сыворотка крови кроликов, иммунизированных частично очищенными фагами или коммерческие антифаговые сыворотки. В этом случае биосенсоры регистрируют наличие фагов, начиная с 10³ частиц (корпускул) в 1 мл (если принять, что “урожай” фагов составляет около 10² корпускул на 1 мл, то таким образом можно определять наличие в среде примерно 10 бактерий).

Альтернативный подход к определению фага и подтверждению его специфичности заключается в использовании изотопов ¹⁴С или ³Н для маркировки фагов in vivo. При этом показателем присутствия микроорганизмов в пробе служит появление в ней радиоактивных корпускул фагов. Для осуществления подобного подхода одновременно с фагом в опытную и контрольную пробы добавляют легко утилизируемые бактериями субстраты, содержащие один из указанных радиоизотопов, например казаминовые кислоты или равномерно меченую глюкозу. Через час или полтора уже описанным способом измеряют степень светорассеяния в обеих пробах и, в случае превышения его в опытной пробе, применяют легко регенерируемый иммуносорбент для извлечения фага из среды и определения его радиоактивности (применение иммуносорбента для извлечения фага необходимо, поскольку общая радиоактивность среды в процессе опыта не изменяется). Как только что сказано, подтверждением присутствия бактерий в среде служит радиоактивность иммуносорбента, специфичность которого обусловливают антитела к фагу.

К существенным особенностям предлагаемого изобретения относится также возможность многократного использования одного и того же иммуносорбента, при этом упомянутый иммуносорбент может применяться как в виде сенсора или в виде средства для извлечения радиоактивного фага, что является еще одним преимуществом предлагаемого изобретения перед ближайшим аналогом.

Таким образом, предлагаемые варианты способа индикации бактерий могут служить основой для создания стационарного прибора для мониторинга в периодическом режиме окружающей среды в закрытых помещениях, в местах скопления людей.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано при проведении анализов на наличие микроорганизмов в воздушной или жидкой среде, мониторинг в периодическом режиме окружающей среды, преимущественно в закрытых помещениях, в местах скопления людей. Способ предусматривает отбор пробы из окружающей среды, внесение в пробу бактериофага, способного размножаться в искомом микроорганизме, выдерживают посев определенный период времени, затем определяют титр бактериофага в пробе. При нарастании титра бактериофага, измеряемого по степени светорассеивания в пробе, констатируют присутствие микроорганизма. Кроме того, при увеличении светорассеивания пробу контактируют либо с иммуносорбентом и определяют радиоактивность иммуносорбента, либо с пьезоэлектрическим резонатором, электроды которого покрыты антифаговым Ig, и определяют наличие пьезоэффекта. 2 з.п. ф-лы.

1. Способ индикации микроорганизмов, включающий отбор пробы, внесение в нее бактериофага, способного размножаться в искомых микроорганизмах, инкубацию полученной смеси и определение наличия искомых микроорганизмов в пробе, отличающийся тем, что наличие искомых микроорганизмов определяют по нарастанию титра бактериофага путем измерения степени светорассеивания в пробе.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед инкубацией в пробу вносят радиоизотопы, после инкубации измеряют степень светорассеивания, при увеличении степени светорассеивания пробу контактируют с иммуносорбентом, специфичным для бактериофага, и при наличии радиоактивности иммуносорбента определяют нарастание титра бактериофага.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что при увеличении степени светорассеивания пробу контактируют с пьезоэлектрическим резонатором, электроды которого покрыты антифаговыми иммуноглобулинами, и при наличии пьезоэффекта определяют нарастание титра бактериофага.