СПОСОБ ЭКСПРЕСС-КОНТРОЛЯ АНТИБИОТИКОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ У БОЛЬНЫХ ХЛАМИДИОЗОМ, МИКОПЛАЗМОЗОМ И УРЕАПЛАЗМОЗОМ Российский патент 2005 года по МПК G01N33/533 

Изобретение относится к медицине, в частности к микробиологии, и касается экспресс-контроля антибиотикочувствительности хламидий, микоплазм и уреаплазм в клиническом материале от больных прямым методом флуоресцирующих антител (МФА).

Заболевания, вызываемые хламидиями и мико-уреаплазмами, в последние годы стали занимать ведущее положение в структуре инфекционной заболеваемости. В большинстве случаев (70-80%) они имеют бессимптомное или малосимптомное течение, что представляет угрозу распространения инфекции как горизонтально, так и вертикально, затрудняет ее клиническую диагностику и, как следствие, назначение адекватного лечения. А это, в свою очередь, приводит к хронизации процесса и носительству возбудителя. Кроме того, некоторые штаммы данных микроорганизмов могут обладать естественной устойчивостью к некоторым противомикробным препаратам, которые часто применяют для лечения всевозможных воспалительных заболеваний. Правильный выбор антимикробных лекарственных средств позволяет проводить эффективную терапию инфекции и предупреждать развитие осложнений. Поэтому вопросы оценки успеха лечения и определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам остаются актуальными.

В настоящее время существует несколько методов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Наиболее распространен дискодиффузионный метод (ДДМ), основными этапами которого являются предварительное подращивание исследуемого материала в пробирках с питательным бульоном, приготовление инокулята из бульонной культуры, посев его на плотную питательную среду, наложение на ее поверхность после застывания дисков с антибиотиками, инкубация в термостате 18-20 часов при 37°С, учет и оценка результатов (Гивенталь Н.И. и др.// Метод. рекомендации по определению чувствительности стрептококков к антибиотикам. - М., 1985. – 11 с.). К недостаткам ДДМ следует отнести длительность и трудоемкость выполнения, получение бульонных культур микроорганизмов, выделенных от больных. Кроме того, определение антибиотикограммы с помощью ДДМ не дает информации о способности антимикробных препаратов накапливаться в пораженных органах в концентрациях, оказывающих бактерицидное действие. Последний вопрос удалось решить Ерещенко В.В. и др. (Матер. VIII Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов - М.: РОСИНЭКС. - 2002. - Т.36. - С.260-261), которые, используя принцип метода серийных разведений в варианте пограничных концентраций, разработали микротестсистемы для качественного определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам первого выбора (МТС ЧППВ). Преимуществом данного теста является возможность автоматизации процедуры учета и интерпретации результатов. Однако основные недостатки, присущие ДДМ, характерны и для МТС ЧППВ.

Наиболее близким аналогом предлагаемому способу является полимеразная цепная реакция (ПЦР), используемая для оценки микробиологической излеченности (Мод П.А., Персон К.// ИППП. - 2003. - №1. - С.11-15). ПЦР обладает высокой чувствительностью и специфичностью, но ее рекомендуется использовать через 3 недели после окончания лечения, т.к. она не позволяет отличить живые микроорганизмы от мертвых, которые некоторое время еще присутствуют в организме больного. ПЦР является дорогостоящим и трудоемким методом, требует для постановки наличия специального оборудования и помещений, а также подготовленного высококвалифицированного персонала.

Целью настоящего изобретения является упрощение и ускорение способа оценки антибиотикочувствительности хламидий, микоплазм и уреаплазм в организме путем изучения непосредственно клинического материала от больных или биологических жидкостей с помощью МФА.

Поставленная цель достигается тем, что первоначально у обследуемых больных из забранного клинического материала готовят мазки и проводят исследование на наличие в них возбудителей хламидиоза, микоплазмоза и уреаплазмоза методом флуоресцирующих антител и при этом определяют общее количество клеток, пораженных этими возбудителями, затем на 2-7 день от начала лечения проводят повторный забор и исследование клинического материала от больных методом флуоресцирующих антител и при выявлении в мазке <5% эпителиальных клеток, содержащих ярко-зеленые гранулы соответствующего антигена, оценивают результат как высокую антибиотикочувствительность у данного микроорганизма и продолжают назначенный курс лечения тем же антибиотиком, а при наличии в мазке ≥5% вышеуказанных специфически светящихся гранул антигена - как низкую антибиотикочувствительность и осуществляют замену антибиотика.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Постановка ПЦР для контроля микробиологической излеченности у больного хламидийным уретритом.

Больной К. получил 10-дневный курс лечения ципрофлоксацином по поводу хламидийного уретрита, через 3 недели после окончания которого у него стерильным урологическим зондом провели забор материала из уретры. Выделение ДНК и реакцию амплификации в термоциклере “Циклотемп-4” проводили согласно инструкции по применению амплификационных тест-систем фирмы-изготовителя (НПФ “Литех”, Москва). Пробу помещали в транспортную пробирку со 100 мкл ТЕ буфера или 0,15 М NaCl, добавляли 300 мкл лизирующего раствора и 10 мкл сорбента, тщательно перемешивали на вортексе 20 сек, помещали в термостат при 55°С на 10 мин. После повторного перемешивания на вортексе пробу центрифугировали 15 сек при 8000 g. Убирали надосадочную жидкость с помощью водоструйного насоса. К осадку добавляли 100 мкл промывающего раствора II, перемешивали и центрифугировали. Осадок промывали раствором III и снова центрифугировали. Затем надосадочную жидкость сливали, пробы подсушивали при 45°С в течение 5 мин и добавляли 50 мкл ТЕ буфера. Тщательно ресуспендировали на вортексе при 45°С в течение 5 мин. Из данной пробы после центрифугирования отбирали 5 мкл для ПЦР.

Для проведения амплификации использовали приготовленную реакционную смесь в объеме 25 мкл из реагентов набора для ПЦР. После приготовления реакционной смеси пробирку помещали в температурный циклер “Циклотемп-4” и устанавливали прибор на 30 циклов. Амплификацию проводили в следующем температурном режиме: денатурация при 94°С - 50 сек, отжиг - 59°С - 30 сек, полимеризация при 72°С - 40 сек.

При постановке использовали контроли: положительный - препарат ДНК C.trachomatis и отрицательный - ТЕ буфер. Электрофорез в 1% агарозном геле проводили по общепринятой методике. В исследуемых продуктах ПЦР визуализировалась полоса, имевшая одинаковую электрофоретическую подвижность с контрольной ДНК C.trachomatis. Материал из уретры от больного К. считали положительным на наличие возбудителя заболевания.

Пример 2. Экспресс - контроль антибиотикочувствительности хламидий у больного хламидийным простатитом предлагаемым способом.

Больному З. с подтвержденным хламидийным простатитом в качестве базового средства назначили рулид. На 5-й день от начала лечения у пациента провели забор сока простаты, который исследовали МФА с использованием тест-системы “ХлаМоноСкрин” (ЗАО “НИАРМЕДИК”, Москва) согласно прилагаемой инструкции. Из материала от больного приготовили мазок на чистом, обезжиренном предметном стекле, тщательно высушили на воздухе и фиксировали, нанося 0,15 мл ацетона до полного его испарения при комнатной температуре. На приготовленный мазок наносили 50 мкл раствора моноклональных антихламидийных антител и помещали во влажную камеру при температуре 37°С на 20 мин. Затем промывали 2 раза по 5 мин в ФСБ + Твин 20 и ополаскивали дистиллированной водой. Препарат подсушивали, наносили каплю монтирующей жидкости, накрывали покровным стеклом и просматривали под специальным иммерсионным маслом в люминесцентном микроскопе с набором фильтров ФС 1-2, БС 8-2, СЗС 7-2, ЖС - 18 и при увеличении 900х.

В исследуемом материале было обнаружено 20% эпителиальных клеток, содержащих ярко-зеленые гранулы антигенов хламидий, поэтому больному З. с 6-го дня назначили новый антибиотик - вильпрафен, на 5-й день приема которого снова исследовали сок простаты, как описано выше. Искомые антигены хламидий в мазке не выявили.

Заключительный этап контроля на наличие или отсутствие возбудителя в клиническом материале осуществляли на 17-е сутки после окончания приема антибактериального средства. Отсутствие в нем хламидий подтверждало эффективность терапии, благоприятное течение и прогноз заболевания.

Пример 3. Экспресс-контроль антибиотикочувствительности уреаплазм у больной хроническим кольпитом предлагаемым способом.

Больная А., страдающая хроническим кольпитом с установленной этиологией (U.urealyticum), получила в качестве антибактериальной терапии доксициклин. На 4-й день от начала лечения у нее взяли соскоб из цервикального канала шейки матки, который исследовали с помощью МФА, используя тест-систему “УреагениФлюоСкрин” (ЗАО “НИАРМЕДИК”, Москва), согласно прилагаемой инструкции. Приготовленный из материала от больной мазок обрабатывали и изучали, как указано в примере 2, только наносили 50 мкл раствора поликлональных антител против U.urealyticum.

В исследуемом материале было обнаружено 14% эпителиальных клеток, содержащих искомые антигены уреаплазм. Больной А. с пятого дня назначили новый антибиотик - азитромицин. На 6-й день с начала его приема повторно исследовали соскоб из цервикального канала аналогичным способом. Уреаплазмы в мазке не выявлены. Заключительное контрольное обследование на присутствие в клиническом материале U.urealyticum осуществляли на 20-е сутки после окончания лечения. Результат анализа был отрицательным.

Пример 4. Экспресс-контроль антибиотикочувствительности микоплазм у больной цервицитом предлагаемым способом.

Больной В. установили, что возбудителем цервицита является M.hominis, и назначили курс терапии ровамицином. Через 6 дней после его начала исследовали соскоб из цервикального канала пациентки с помощью тест-системы “МикогомоФ-люоскрин” (ЗАО “НИАРМЕДИК”, Москва) согласно прилагаемой инструкции.

Процедура исследования пробы подробно описана в примере 2, за исключением того, что ее обрабатывали 50 мкл раствора поликлональных антител против M.hominis.

В клиническом материале были обнаружены ярко-зеленые гранулы антигенов микоплазм, находящиеся внутри 7% эпителиальных клеток. Со следующего дня антибиотик заменили на клацид, а после двух дней его приема вновь исследовали цервикальный соскоб от больной В., в котором антигены микоплазм не определялись. Заключительный контроль излеченности выполнили на 19-й день после прекращения приема лекарственных средств. Искомые антигены M.hominis в исследуемом материале отсутствовали.

Пример 5. Экспресс-контроль антибиотикочувствительности хламидий у больного хроническим негонококковым уретритом предлагаемым способом.

Больной М. в качестве антимикробного препарата по поводу лечения хронического рецидивирующего негонококкового уретрита хламидийной этиологии получал вильпрафен. На 5-й день с начала терапии исследовали соскоб из мочеиспускательного канала пациента на наличие антигенов C.trachomatis с помощью тест-системы “ХлаМоноСкрин” (ЗАО “НИАРМЕДИК”, Москва) согласно прилагаемой инструкции. Техника приготовления, обработки и изучения мазков описана в примере 2.

В материале от больного антигены хламидий не выявлены ни внутриэпителиально, ни вне клеток. Антибиотик оказался эффективным. Заключительное контрольное изучение соскоба из мочеиспускательного канала больного М. на 21-й день после завершения курса лечения вильпрафеном показало отсутствие в нем искомых антигенов C.trachomatis.

Таким образом, стало возможным осуществлять экспресс-контроль эффективности действия антибактериальных средств в процессе лечения непосредственно в материале от больных и, в случае необходимости, быстро заменить препарат.

Предлагаемый способ экспресс-контроля антибиотикочувствительности у больных хламидиозом, микоплазмозом и уреаплазмозом прост, доступен, не трудоемок, не требует предварительного выделения культуры возбудителя, позволяет определять эффективность действия лекарственных средств в первые дни после их назначения прямо в клиническом материале от пациентов и оперативно корректировать назначение антимикробных препаратов.

Рекомендуется для экспресс-контроля микробиологической излеченности при хламидиозах, уреаплазмозах и микоплазмозах.

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии. Способ характеризуется тем, что первоначально у обследуемых больных из забранного клинического материала готовят мазки и проводят исследование на наличие в них хламидий, микоплазм и уреаплазм методом флуоресцирующих антител. Определяют общее количество клеток, пораженных этими возбудителями. Затем на 2-7 день от начала лечения выполняют повторный забор и изучение клинического материала от пациентов тем же методом и при выявлении в мазке <5% эпителиальных клеток, содержащих ярко-зеленые гранулы соответствующего антигена, оценивают результат как высокую антибиотикочувствительность данного микроорганизма и продолжают назначенный курс лечения этим же антибиотиком. При наличии в мазке ≥5% вышеуказанных специфически светящихся гранул антигена как низкую антибиотикочувствительность и осуществляют замену лекарственного препарата. Способ позволяет определять эффективность действия антибиотиков в первые дни после их назначения и оперативно корректировать их назначение, является простым и не требует предварительного выделения культуры возбудителя.

Способ экспресс-контроля антибиотикочувствительности у больных хламидиозом, микоплазмозом и уреаплазмозом, включающий идентификацию микроорганизма и оценку его антибиотикочувствительности, отличающийся тем, что первоначально у обследуемых больных из забранного клинического материала готовят мазки и проводят исследование на наличие в них хламидий, микоплазм и уреаплазм методом флуоресцирующих антител, определяя общее количество клеток, пораженных этими возбудителями, затем на 2-7 день от начала лечения выполняют повторный забор и изучение клинического материала от пациентов тем же методом и при выявлении в мазке <5% эпителиальных клеток, содержащих ярко-зеленые гранулы соответствующего антигена, оценивают результат как высокую антибиотикочувствительность данного микроорганизма и продолжают назначенный курс лечения этим же антибиотиком, а при наличии в мазке ≥5% вышеуказанных специфически светящихся гранул антигена - как низкую антибиотикочувствительность и осуществляют замену лекарственного препарата.