СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕТЕРГЕНТА В ПРОБЕ Российский патент 2005 года по МПК G01N33/48 

Описание патента на изобретение RU2247986C1

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в травматологии и стоматологии для оценки токсичности костного цемента и пластмасс по выходу из них мономеров, в биохимии для определения детергентов в биологических жидкостях и тканях, в области санитарии и гигиены для обнаружения детергентов в водных средах, в фармакологии для тестирования гемолитической активности лекарственных препаратов.

Токсичность детергентов, как поверхностно-активных веществ, заключается в их способности разрушать биологические мембраны путем дезорганизации липидного бислоя. Эту способность детергентов используют для их выявления и количественного определения в водных растворах.

Известен общепринятый способ определения детергента в пробе по регистрации скорости гемолиза в изотоническом водном растворе (Калер Г.В., Рачковский Л.И., Окунь И.М. Гемолиз эритроцитов детергентами - математическая модель и анализ концентрационных и кинетических кривых. // Цитология. - 1986. - Т.28. - № 9. - С.954).

Недостатком способа является его низкая чувствительность. Низкая чувствительность способа обусловлена тем, что зарегистрировать скорость гемолиза, индуцированного детергентом, возможно только при достижении определенной пороговой концентрации детергента в пробе.

Задачей изобретения является повышение чувствительности способа определения детергента в пробе при низких концентрациях детергента.

Поставленная задача решается тем, что в известном способе определения детергента в пробе, включающем регистрацию скорости гемолиза в изотоническом водном растворе, содержащем стандартную взвесь эритроцитов, в присутствии пробы и без нее, согласно изобретению предварительно в раствор добавляют глициновый буфер с рН 2-2,5, индуцирующий кислотный гемолиз, и определяют детергент по увеличению скорости кислотного гемолиза в присутствии пробы.

Заявляемый способ основан на впервые обнаруженном эффекте ускорения детергентом кислотного гемолиза. Для индукции кислотного гемолиза в изотонический водный раствор, содержащий стандартную взвесь эритроцитов, добавляют глициновый буфер со значением рН 2-2,5. Буфер используют с целью предотвращения возможного влияния пробы, содержащей детергент, на кислотность среды. Способ обладает большей чувствительностью по сравнению с прототипом, так как увеличение скорости кислотного гемолиза в присутствии детергента удается зарегистрировать при более низких концентрациях детергента в пробе по сравнению с прототипом, где в присутствии детергента регистрируют скорость детергентного гемолиза (см. табл.1).

Возможна количественная оценка содержания детергента в пробе по следующей формуле:

Х=К(V0-Vк), где

К - коэффициент пересчета, мкМ/dЕ 800/мин.

V0 - скорость гемолиза в присутствии пробы, dЕ 800/мин.

Vк - скорость кислотного гемолиза без пробы, dЕ 800/мин.

Способ может быть осуществлен, например, следующим образом.

Получают примерно 1 мл цитратной крови лабораторного кролика. Кровь трижды отмывают физиологическим раствором. Для этого ее центрифугируют в течение 5 минут при скорости 1500 об./мин, сливают плазму и к эритроцитам добавляют 10-15 мл физиологического раствора; после перемешивания взвесь центрифугируют в течение 5 минут при скорости 1500 об/мин, сливают надосадок и процедуру повторяют еще два раза. К взвеси отмытых эритроцитов добавляют физиологический раствор до получения стандартной взвеси эритроцитов: оптическая плотность стандартной взвеси при длине волны 700-800 нм должна равняться 0,560±0,010 после ее разбавления в 8 раз физиологическим раствором. В термостатированную при 37°С кювету спектрофотометра вносят 0,6 мл физиологического раствора, прогревают кювету в течение 3 минут, после чего в нее последовательно вносят 0,1 мл стандартной взвеси эритроцитов и 0,1 мл 0,1 М глицинового буфера со значением рН 2-2,5 (общий объем инкубационной смеси составляет 0,8 мл). Скорость кислотного гемолиза регистрируют каждые 5 секунд инкубации по убыли оптической плотности при длине волны 700-800 нм. Максимальная разность значений оптической плотности, рассчитанная на единицу времени, соответствует контрольной скорости гемолиза (скорость гемолиза без пробы) - Vк (dE 800/мин). В другую термостатированную при 37°С кювету спектрофотометра вносят изотонический водный раствор детергента (пробу) до объема 0,6 мл. Кювету прогревают в течение 3 минут, после чего в нее последовательно вносят 0,1 мл стандартной взвеси эритроцитов и 0,1 мл 0,1 М глицинового буфера со значением рН 2-2,5 (общий объем инкубационной смеси составляет 0,8 мл). Скорость кислотного гемолиза регистрируют каждые 5 секунд инкубации по убыли оптической плотности при длине волны 700-800 нм.

Максимальная разность значений оптической плотности, рассчитанная на единицу времени, соответствует опытной скорости гемолиза (скорости гемолиза в присутствии пробы) - Vo (dE 800/мин).

Способ может быть проиллюстрирован следующими примерами.

Пример 1. Определение метилметакрилата (токсический компонент костного цемента и некоторых пластмасс). Для определения метилметакрилата по предлагаемому способу были использованы различные концентрации 1%-ного раствора метилметакрилата в физиологическом растворе (пробы). Результаты представлены в табл.1.

Таблица 1
Результаты определения метилметакрилата в пробе
Концентрация метилметакрилата (мкМ)Скорость гемолиза по заявляемому способу (dЕ800/мин)Скорость гемолиза по прототипу (dЕ800/мин) VкVo 1,20,0200,03102,40,0200,04003.60,0200,05304.80,0200,0650

Из табл.1 видно, что по заявляемому способу во всех пробах при малых концентрациях метилметакрилата регистрируется повышение скорости кислотного гемолиза в присутствии детергента (Vo выше Vк). По способу - прототипу скорость гемолиза в присутствии пробы не регистрируется. Следовательно, чувствительность предлагаемого способа выше по сравнению с прототипом.

Возможно количественное определение метилметакрилата в пробе. Измельченный образец пластмассы - 0,5 г полиметилметакрилата инкубировали в течение трех часов в 2 мл физиологического раствора при постоянном перемешивании для извлечения несвязавшегося мономера в изотонический водный раствор. Количественное определение монометилметакрилата в пробе осуществляли путем регистрации Vo в присутствии надосадочной жидкости (пробы) и Vк без пробы. Получены следующие значения: Vo=0,031 dЕ 800/мин; Vк=0,020 dE 800/мин (см. табл.1). По экспериментальным данным, представленным в табл.1, коэффициент пересчета К=111 мкМ/dЕ 800/мин. В соответствии с расчетной формулой содержание метилметакрилата (Х) в пробе составляет:

Х=111(0,031-0,020)=1,2 (мкМ)

Пример 2. Определение сапонина в пробе.

Пороговая концентрация гемолитического действия сапонина фирмы “Merk” определена экспериментально и составляет 7 мкг/мл. Для исследования выбрана подпороговая концентрация сапонина - 3 мкг/мл. Результаты определения сапонина в пробе (0,125% изотонический раствор сапонина (“Merk”)) по заявляемому способу и по прототипу представлены в табл.2.

Таблица 2
Результаты определения сапонина в пробе
Концентрация сапонина (мкг/мл)Скорость гемолиза по заявляемому способу (dЕ 800/мин)Скорость гемолиза по прототипу (dЕ 800/мин) VкVo30,0200,0530

Из табл.2 видно, что при концентрации детергента (сапонина) меньше пороговой, в присутствии пробы регистрируется только повышение скорости кислотного гемолиза по заявляемому способу. Скорость детергентного гемолиза по способу - прототипу не регистрируется, то есть детергент не выявляется. Это еще раз подтверждает более высокую чувствительность заявляемого способа.

Заявляемый способ позволяет не только повысить чувствительность определения детергента в пробе, но и уменьшить трудозатраты для проведения анализа. Так в прототипе требуется длительная инкубация (1-6 часов) детергента с эритроцитами и по ходу инкубации отбор контрольной и опытной проб, их центрифугирование и определение оптической плотности. В предлагаемом способе регистрация динамики гемолиза может быть компьютеризирована и продолжается от 10 до 30 минут.

Похожие патенты RU2247986C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ИМПЛАНТАЦИОННОГО СИНДРОМА ПРИ ЭНДОПРОТЕЗИРОВАНИИ 1999
  • Еропкина Е.М.
  • Божкова С.А.
  • Мамаева Е.Г.
  • Машков В.М.
  • Афиногенов Г.Е.
RU2154274C1
Способ оценки качества водопроводной воды 1989
  • Рябов Сергей Иванович
  • Шостка Георгий Дмитриевич
  • Спиридонов Василий Николаевич
  • Бочков Дмитрий Николаевич
SU1691735A1
Способ оценки гемолитического действия полимеров, полимерных материалов и изделий из них ин витро в статических условиях 2023
  • Комин Артем Владимирович
  • Лешукова Наталья Сергеевна
  • Дубицкая Антонина Дмитриевна
  • Рыбченко Оксана Ивановна
RU2818010C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИСЛОТНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ ХЛАДНОКРОВНЫХ ЖИВОТНЫХ 2014
  • Абдуллаева Наида Муртузалиевна
  • Чалабов Шамиль Исмаилович
RU2571081C1
Способ выделения миелопероксидазы 1983
  • Янковский Олег Юлианович
  • Монахенко Ирина Васильевна
SU1113407A1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СКОРОСТИ ОБРАЗОВАНИЯ ПРОДУКТОВ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В МЕМБРАНАХ ЭРИТРОЦИТОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ 2002
  • Василенко Т.Ф.
RU2229133C1
ДИАГНОСТИКУМ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАПРИНА И СПОСОБ ЕГО ПРИГОТОВЛЕНИЯ 1991
  • Парфенова Е.В.
  • Прокопов Н.И.
  • Черкасов В.Р.
RU2008020C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА 2008
  • Хаиров Сайгидтага Гаджиевич
  • Юсупов Омар Юсупович
  • Рамазанова Джавгарат Магомедовна
  • Кабахова Патимат Магомедовна
  • Дугричилова Мадина Омаровна
  • Шумилов Константин Васильевич
  • Скляров Олег Дмитриевич
  • Климанов Аркадий Иванович
RU2415434C2
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕАКТИВНОГО ЛИЗИСА КЛЕТОК 1995
  • Галебская Л.В.
  • Соловцова И.Л.
  • Щербак И.Г.
RU2101702C1
Способ определения литической активности веществ 1980
  • Митрохин Николай Михайлович
  • Юртаев Виктор Викторович
  • Голиков Юрий Викторович
SU1116394A1

Реферат патента 2005 года СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕТЕРГЕНТА В ПРОБЕ

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике. Способ определения детергента в пробе основан на регистрации скорости гемолиза в изотоническом водном растворе, содержащем взвесь эритроцитов, в присутствии пробы и без нее. Для осуществления способа в изотонический водный раствор, содержащий стандартную взвесь эритроцитов, добавляют глициновый буфер с рН 2-2,5, индуцирующий кислотный гемолиз. Детергент определяют по увеличению скорости кислотного гемолиза в присутствии пробы. Способ позволяет повысить чувствительность определения при низких концентрациях детергента в пробе. 2 табл.

Формула изобретения RU 2 247 986 C1

Способ определения детергента в пробе, включающий регистрацию скорости гемолиза в изотоническом водном растворе, содержащем стандартную взвесь эритроцитов, в присутствии пробы и без нее, отличающийся тем, что предварительно в раствор добавляют глициновый буфер с рН 2-2,5, индуцирующий кислотный гемолиз, и определяют детергент по увеличению скорости кислотного гемолиза в присутствии пробы.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2005 года RU2247986C1

КАЛЕР Г.В
и др
Гемолиз эритроцитов детергентами - математическая модель и анализ концентрационных и кинетических кривых
Цитология, 1986, Т.28, №9, с
Приспособление для выверки планиметра 1923
  • Захаров Н.И.
SU954A1
RU 99123859 А, 20.08.2001
RU 2056049 С1, 10.03.1996
КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ КОЛОРИМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖЕЛЕЗА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ 1995
  • Смирнов И.В.
  • Кольцова Г.Н.
RU2109285C1
RU 99116974 А, 10.06.2001
СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПОЧЕК 2000
  • Габбасова Н.В.
  • Жмаев А.Ф.
  • Настаушева Т.Л.
  • Чернов Ю.Н.
  • Стахурлова Л.И.
  • Швырев А.П.
RU2180965C1

RU 2 247 986 C1

Авторы

Галебская Л.В.

Тарасова Ю.В.

Даты

2005-03-10Публикация

2003-07-28Подача