ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI EB387 ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЖИВОТНЫХ СЕМЕЙСТВА ПСОВЫХ ОТ ТОКСИКОЗОВ, ВЫЗВАННЫХ ЦИТОТОНИЧЕСКИМИ ТОКСИНАМИ ТИПА AB, И ПРОБИОТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ НА ЕГО ОСНОВЕ Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 A61K39/108 C12R1/19 

Изобретение относится к ветеринарной медицине и биотехнологии и может быть использовано для защиты домашних и диких представителей семейства псовых (Canidae) от токсикозов, обусловленных цитотоническими токсинами типа A₁B₅.

Цитотонические токсины типа A₁B₅ широко распространены среди различных таксономических групп микроорганизмов: энтеробактерий, вибрионов, псевдо- и аэромонад, хеликобактерий. В последние годы отмечается расширение круга продуцирующих эти токсины бактерий, что связано с дрейфом кодирующих их генов в бактериальных популяциях.

Токсины этой группы поражают пищеварительную и выделительную системы организма, органы размножения, кожные покровы. Активируют внутриклеточных паразитов, отягощают течение вирусных и паразитарных заболеваний. Эти токсины способны поражать и людей, являясь одной из основных причин диареи путешественников.

Особенности формирования антитоксического иммунитета делают малоэффективными лечебные и профилактические препараты, основанные на парентеральном применении.

Наиболее близкими по сущности и достигаемому положительному эффекту к заявляемому штамму являются штаммы Escherichia coli M17 (патент РФ №1633817) и Е. coli BKM СК-322Д (патент РФ №1819428), обладающие антибактериальной активностью и предназначенные для профилактики кишечных заболеваний сельскохозяйственных животных, но не имеющих адгезии к клеткам слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта и штамм Е. coli РНМБ (патент РФ №2259213), обладающий адгезивными свойствами, но не способный вызывать эффективное образование местного иммунного ответа из-за отсутствия в рекомбинантной плазмиде pLTB фрагмента гена субъединицы А токсина, придающего генному продукту суперантигенные свойства.

Задачей изобретения является получение нового пробиотического штамма, обладающего выраженной адгезией к слизистой оболочке кишечника плотоядных животных семейства псовых и способного защищать их от токсикозов, обусловленных токсинами типа A₁B₅ за счет образования местного иммунитета, обусловленного иммуноглобулинами класса А и экранирования специфических клеточных рецепторов для этих токсинов - ганглиозидов GM1.

Задача достигается тем, что в геном штамма Е. coli, изолированного от клинически здорового представителя семейства псовых, были встроены гены, детерминирующие синтез микроцина С51 и вакцинного варианта elt-токсоида с делецией в гене эффекторной А-субъединицы токсина, обеспечивающей утрату токсической функции. В то же время присутствие А-субъединицы резко усиливает иммунный ответ за счет суперантигенных свойств последней. Наличие в геноме штамма рецепторной В-субъединицы обеспечивает экранирование клеточных рецепторов от действия цитотонических токсинов типа A₁B₅. Микроцин С51 подавляет развитие патогенных и условно патогенных энтеробактерий, не оказывая при этом угнетающего действия на нормофлору. Помимо этого штамм Escherichia coli ЕВ387 оказывает стимулирующее действие на облигатную микрофлору желудочно-кишечного тракта, в частности способствуя восстановлению ее видового и количественного состава при дисбиотических состояниях.

Штамм Е. coli №97/3 был выделен из фекалий клинически здоровой собаки. Первичная идентификация осуществлена на основании морфологических и культуральных свойств. Окончательно видовая принадлежность определена на основании АР-теста. Штамм не содержал плазмидной ДНК и не нес детерминант лекарственной устойчивости, но обладал ярко выраженными адгезивными свойствами по отношению к эритроцитам морской свинки.

Рекомбинантная плазмида р ΔABLT была получена на основе природной плазмиды рН74114, несущей в своем составе полноразмерный elt-оперон.

Для этого из штамма Е. coli H74114 была выделена и очищена плазмидная ДНК. Выделение и очистку проводили следующим образом. Бактериальные клетки из 10 мл ночной бульонной культуры осаждали центрифугированием и ресуспендировали в 0,5 мл буфера STET следующего состава: сахароза 8%, тритон Х-100 - 0,5%, ЭДТА 25 мМ, Трис-HCL 25 мМ, рН 8,0. После этого к ним добавляли 0,25 мл 0,3М NaOH, помещали на водяную баню при температуре 70°С и инкубировали в течение 15 минут. Затем к образцу добавляли смесь равных объемов фенола с хлороформом и после энергичного перемешивания центрифугировали при 14000 об/мин в течение 10 минут. Отбирали водную фазу, к которой последовательно добавляли 0,07 мл 3М раствора ацетата натрия и 0,7 мл изопропанола, перемешивали и центрифугировали. Осадок ДНК дважды промывали 70% этанолом, подсушивали под вакуумом и растворяли в 0,05 мл деионизованной воды.

Полученный таким образом препарат ДНК плазмиды рН74114 подвергали гидролизу посредством рестриктазы PstI. Реакцию проводили в буфере, содержавшем 10 мМ Трис-НСl (рН 8,5 при 37ºС), 10 мМ MgCl, 100 мМ КСl при температуре 37°С в течение 1 часа. Реакцию останавливали прогреванием (15 мин при 65°С). Таким же образом обрабатывали ДНК векторной плазмиды, рестрикты смешивали в соотношении 1:4 (вектор:вставка), обрабатывали ДНК-лигазой бактериофага Т4 при 4°С в течении ночи.

Полученной лигазной смесью трансформировали клетки лабораторного штамма Е. coli DH5. Трансформацию осуществляли следующим образом: ночную культуру реципиентного штамма разводили в 100 раз средой LB и выращивали до середины логарифмической стадии роста. Летки в объеме 40 мл осаждали центрифугированием и промывали 0,15 М NaCl, суспендировали в 2 мл 50 мМ раствора CaCl₂. После 20 минут инкубации к ним добавляли 20 мкл лигазной смеси и инкубировали еще 40 минут в ледяной бане. После температурного шока(42°С, 3 минуты) клетки разводили 0,5 мл среды LB, инкубировали при 37°С в течение 90 минут, высевали на чашки с агаризованной средой LB и помещали в термостат при температуре 37°С. Выросшие колонии отбирали и анализировали на наличие elt-оперона. По результатам анализа клонов был отобран один, несший в своем составе полноразмерный elt-оперон. Из клеток этого клона вышеприведенным способом была изолирована плазмидная ДНК. Выделенную ДНК последовательно обрабатывали рестрикционными эндонуклеазами XbaI, BclI и нуклеазой S₁, экстрагировали нейтральным фенолом и переосаждали 2 объемами этанола. Полученный таким образом препарат обрабатывали ДНК-лигазой бактериофага Т4 и посредством трансформации вводили в штамм Е. coil №97/3. В результате, таким образом, был сконструирован и отобран клон, обозначенный как Е. coli 97/3/28, несший в своем составе рекомбинантную плазмиду р ΔABLT.

Из клеток штамма Е. coli M17 приведенным выше способом была выделена плазмида р74, детерминирующая синтез микроцина С51. Полученной ДНК был протрансформирован штамм Е. coli 97/3/28, несший в своем составе рекомбинантную плазмиду p ΔABLT. Эффективность трансформации составляла 10² трансформантов на 1 мкг ДНК. Электрофоретический анализ плазмидных профилей трансформантов показал наличие двух плазмид p ΔABLT и р74. Таким образом, был сконструирован и отобран клон, обозначенный как Е. coli EB387, несший в своем составе рекомбинантную плазмиду p ΔABLT и плазмиду р74.

Для определения иммунологической активности белка, синтезируемого под контролем плазмиды p ΔABLT был применен метод двойной радиальной диффузии по методу Ухтерлони. Для этого клетки штамма Е. coli EB387 культивировали в 250 мл среды МПБ в течение 24 часов, осаждали центрифугированием, ресуспендировали в 0,01 М трис-НСl буфере рН 8,6, содержавшем 0,15 NaCl. Полученную клеточную суспензию подвергали обработке на ультразвуковом дезинтеграторе ME 150.

Для постановки реакции использовали 1% агар, приготовленный на вышеуказанном буфере, и поликлональную сыворотку к полноразмерной молекуле LT.

Полученный лизат образовывал полосы преципитации с поликлональной сывороткой к полноразмерной молекуле LT в разведении 1:128. Иммуноблот, поставленный с данным лизатом, показал наличие двух полос с молекулярной массой 24 и 12,7 кД соответственно, что соответствует молекулярным массам А и В субъединиц LT.

С целью изучения апатогенности пробиотического штамма Е. coli ЕВ387 бульонную культуру штамма в дозе 1-5×10⁹ вводили перорально и внутрибрюшинно лабораторным мышам массой 16-20 г. Ни в одном из случаев гибели животных не наблюдалось. При вскрытии животных патологические изменения в органах не наблюдались.

При пероральном введении препарата в дозе 1-5×10⁹ на голову щенкам собаки, вуалевого песца и серебристо-черной лисы, а также молодняку кроликов токсичность не обнаруживалась. Срок персистенции штамма пробиотика в организме представителей семейства псовых при пероральном введении не менее 280 дней (срок наблюдения).

Полученный штамм бактерий Е. coli EB387 депонирован в коллекции штаммов возбудителей заболеваний пушных зверей музея бактериальных и вирусных культур Научно-исследовательского института пушного звероводства и кролиководства им. В.А.Афанасьева РАСХН (НИИПЗК).

Характеристика штамма Е. coli EB387.

Рекомбинантный резидентный антитоксический штамм Е. coli EB387 обладает пролонгированным действием, продуцируемый им микроцин С51 подавляет развитие токсигенных энтеробактерий, а делетированный вариант термолабильного токсина экранирует специфические рецепторы на поверхности энтероцитов от действия голатоксина и активирует специфический иммунитет. Резидентные свойства штамма обеспечивают его включение в состав микробиоты, что позволяет примерять его реже и в меньших дозах.

Генетические маркеры: Содержит гены микроциногении (С51), делетированный вакцинный вариант elt-оперона эшерихий, устойчив к канамицину (100 мкг/мл) и тетрациклину (50 мкг/мл).

Морфологические, культуральные, ферментативные свойства: грамотрицательные неспорообразующие, подвижные палочки с закругленными концами размером (1,2-1,5)×(2,0-5,0) мкм. Хорошо растут на МПА, агаризованной среде Хоттингера, минимальных средах с глюкозой и глицерином. Суточные культуры на жидких средах образуют равномерное помутнение. На плотных средах формируют серо-желтые колонии S-формы, на среде Эндо красные с металлическим блеском колонии (1-2 суток при 37°С).

Факультативный анаэроб. Температурный оптимум 37°С.

Расщепляет с образованием кислоты и газа глюкозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, рамнозу, арабинозу, манит, инозит. Не утилизирует сорбит, цитрат и малонат натрия. Уреазная активность отсутствует. Сероводород не образует. Синтезирует галактозидазу. Образует индол. Не синтезирует фенилаланиндезаминазу. Желатиназная активность отсутствует, молоко сбраживает. Активность лизиндекарбоксилазы и орнитиндекарбоксилазы обнаруживается, аргининдегидролаза отсутствует.

Вирулентность для животных (ЛД₅₀): не патогенен для белых мышей, крыс, кроликов, собак, песцов и лисиц при пероральном применении.

Биологическая активность в чувствительной системе: на средах Адамса и М9 ингибирует индикаторный штамм Е. coli В с зоной подавления роста от 10 до 50 мм, положительно реагирует с поликлональной сывороткой против LT в реакции двойной диффузной преципитации по Ухтерлони. Геммагглютинацией эритроцитов морской свинки выявляется адгезивный антиген штамма Е. coli EB387.

Срок хранения и периодичность пассажей на чувствительной системе: пересев на МПА каждые два месяца, проверка специфической активности каждые шесть месяцев. В лиофилизированном виде штамм хранится не менее 1 года при температуре 4°С.

Контроль за состоянием штамма осуществляется двояко: раз в три месяца проверяют культуральные, морфологические и биохимические свойства и перед применением подтверждают специфическую активность, тестируя наличие микроциногении на среде Адамса с использованием индикаторной культуры Е. coli В и выявляя биосинтез токсоида в иммунохимическом тесте с моноклональными антителами.

На основе полученного штамма Е. coli EB387 был создан пробиотический препарат, представляющий собой лиофильно высушенную культуру микроорганизмов, предназначенный для профилактики токсикозов у животных семейства псовых, вызванных цитотоническими токсинами типа A₁B₅.

Проверку протективной активности пробиотического препарата на основе штамма Е. coli EB387 проводили на представителях семейства псовых - песцах породы вуалевый на базе племенных заводов «Пушкинский» и «Салтыковский» Московской области. Установлено, что препарат обладает длительным сроком персистенции в кишечнике представителей семейства псовых, прием препарата способствовал нормализации кишечной микрофлоры и предотвращал развитие токсикозов у экспериментальных животных семейства псовых.

Пример 1. Сроки персистенции и элиминации препарата.

В опытах на песцах породы вуалевый на базе племенных заводов «Пушкинский» и «Салтыковский» было установлено, что после недельного курса приема пробиотика в дозе 1,5 млн. КОЕ на голову экспериментального животного пробиотический штамм Е. coli EB387 высевался в составе просветной микрофлоры в течение 260 дней (срок наблюдения).

В опытах, поставленных на самках песца породы вуалевый, было установлено, что после их обработки пробиотическим препаратом на основе штамма Е. coil EB387 в период подготовки к гону последний обнаруживался в составе кишечной микрофлоры рожденных ими щенков.

Пример 2. Влияние препарата на кишечную микрофлору.

В опытах проведенных на 30 головах молодняка песца породы вуалевый на базе племенного завода «Салтыковский» было установлено, что после недельного курса приема пробиотика в дозе 1,5 млн. КОЕ на голову экспериментального животного у последних происходила нормализация качественного и количественного состава кишечной микрофлоры: исчезали условно патогенные неферментирующие эшерихии, количество норальной кишечной палочки возрастало на 1-2 порядка и достигало нормальных значений 10⁷; также на 2-3 порядка возрастало количество лактобацилл и энтерококков до уровня 10⁸-10⁹. Количество бифидобактерий не изменялось и соответствовало норме - 10⁹-10¹¹. Таким образом, под действием препарата происходит нормализация и стабилизация качественного и количественного состава нормофлоры желудочно-кишечного тракта представителей семейства псовых.

Пример 3. Протективная активность препарата.

В опытах на лабораторных животных обработка белых мышей пробиотическим препаратом на основе штамма Е. coli EB387 предотвращала появление диарейного синдрома и гибель последних при их заражении патогенным штаммом Escherichia coli. Обработка препаратом на основе штамма Е. coli EB387 самок и молодняка вуалевых песцов предотвратила их дорегистрационную гибель и повысила выход щенков на 0,6 головы на самку по сравнению с необработанным контролем.

Изобретение относится к ветеринарной медицине и биотехнологии. Штамм получают путем встраивания в геном Escherichia coli, изолированной от клинически здорового представителя семейства псовых, генов, детерминирующих синтез микроцина С51, В-субъединицы токсина, а также вакцинного варианта elt-оперона и А-субъединицы, усиливающий иммунный ответ. Штамм обладает выраженной адгезией к слизистой оболочке кишечника животных семейства псовых. Лиофилизированная высушенная культура Escherichia coli ЕВ387 представляет собой пробиотический препарат для защиты животных семейства псовых от токсикозов, вызванных цитотоническими токсинами типа A₁B₅. Изобретение обеспечивает нормализацию и стабилизацию качественного и количественного состава микрофлоры желудочно-кишечного тракта представителей семейства псовых. 2 н.п. ф-лы, 1 табл.

1. Штамм бактерий Escherichia coli ЕВ 387, депонированный в коллекции штаммов-возбудителей пушных зверей и кроликов музея бактериальных культур ГНУ НИИПЗК им. В.А.Афанасьева РАСХН № ЕВ 387, предназначенный для защиты животных семейства псовых от токсикозов, вызванных цитотоническими токсинами типа A₁B_5.

2. Пробиотический препарат для защиты животных семейства псовых от токсикозов, вызванных цитотоническими токсинами типа A₁B₅, характеризующийся тем, что представляет собой лиофильно высушенную культуру Escherichia coli по п.1.