ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КИШЕЧНОГО ИЕРСИНИОЗА И ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 2005 года по МПК C12N1/20 C12Q1/10 C12Q1/10 C12R1/01 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для диагностики иерсиниоза и псевдотуберкулеза путем выделения Yersinia enterocolitica и Yersinia pseudotuberculosis из клинического материала и объектов внешней среды.

Известно использование для выделения из клинического и неклинического материала возбудителей кишечного иерсиниоза (патогенных бактерий вида Yersinia enterocolitica) среды Yersinia Selective Medium - CIN-агара [1]. Недостатками указанной среды являются подавление на этой среде роста близкородственных бактерий, вызывающих псевдотуберкулез - Yersinia pseudotuberculosis, а также сложность приготовления и недоступность для многих практических лабораторий некоторых ингредиентов среды [2].

Целью настоящего изобретения является упрощение состава питательной среды и улучшение ее селективных свойств в отношении Yersinia pseudotuberculosis

Поставленная цель достигается, что для приготовления питательной среды (И-агара) используют пептон, дрожжевой экстракт, маннит, пируват натрия, хлорид натрия, сульфат магния, дезоксихолат натрия, нейтральный красный, кристаллический фиолетовый, агар-агар, иргасан (триклозан) и дистиллированную воду при следующем содержании компонентов, г/л:

Пептон 19,0-21,0

Дрожжевой экстракт 1,9-2,1

Маннит 19,0-21,0

Натрия пируват 1,9-2,1

Натрия хлорид 0,95-1,05

Магния сульфат 0,009-0,011

Натрия дезоксихолат 0,48-0,53

Нейтральный красный 0,028-0,032

Кристаллический фиолетовый 0,009-0,0011

Агар-агар 11,9-13,1

Иргасан 0,0039-0,0041

Дистиллированная вода остальное

Все компоненты среды, за исключением иргасана, растворяют в дистиллированной воде и доводят значение рН до 7,4±0,2. Среду стерилизуют в автоклаве при температуре 120-122°С в течение 14-16 минут. Иргасан растворяют в асептических условиях при помешивании в 1,5-2,5 мл стерильной дистиллированной воды при температуре 45-50°С. После стерилизации в остывшую до 45-50°С основу вносят раствор иргасана и тщательно перемешивают. Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри и подсушивают.

Посев материала на поверхность среды производят общепринятыми методами. Учет производят после 24-48 часов инкубации при температуре 32°С. Культуры патогенных иерсиний вырастают в виде типичных выпуклых мелких прозрачных колоний розового цвета с четко очерченным малиновым “глазком” в центре (“бычий глаз”). Колонии имеют гладкую блестящую поверхность, ровные края и маслянистую консистенцию.

Для сравнения с CIN-агаром в серии экспериментов у И-агара определяли чувствительность, время появления роста бактерий, селективные свойства, а также морфолого-физиологические признаки выделенных на этой среде иерсиний.

Для определения чувствительности сред производили смыв ночных культур иерсиний со скошенного питательного агара и стандартизировали полученную суспензию до 10 единиц по ОСО 42-28-59-85 и готовили ее десятикратные разведения. По 0,1 мл взвеси каждого штамма в различных разведениях вносили в чашки Петри с испытуемыми средами. Чувствительность среды определяли по наибольшему разведению, обеспечивающему формирование колоний или визуально видимый рост на всех засеянных чашках. По отношению к Y.enterocolitica чувствительность И-агара и CIN агара составила 10^-8, по отношению к Y.pseudotuberculosis чувствительность И-агара составила 10^-7, а рост Y.pseudotuberculosis на CIN агаре был подавлен во всех разведениях.

Время появления (скорость) роста в часах определяли по минимальному периоду инкубации посевов, необходимому для формирования типичных колоний на среде в чашках. Результаты представлены в табл.1.

Таблица 1Время появления роста типичных колоний, чТест-штиммыПитательные средыБлижайший аналогПредложенная средаY.enterocolitica серовара O323,122,7Y.enterocolitica серовара O923,422,9Y.pseudotuberculosisРост отсутствует24,5

Селективные свойства сред оценивали путем посева 0,1 мл микробной взвеси ночных агаровых культур, содержащей 300 колониеобразующих единиц иерсиний в чистой культуре и в смесях с культурами бактерий-ассоциантов при соотношении 1:1, на чашки с испытуемыми и контрольной средами. В качестве ассоциантов использовали культуры Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Serratia liquefaciens, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, K.pneumoniae, K.oxytoca, P.stuartii и P.rettgeri, а в качестве контрольной среды - триптон-соевый агар в общепринятой прописи. Показатель ингибиции (ПИ) рассчитывали по формуле:

Результаты приведены в табл.2. В отличие от CIN-агара на предложенной среде помимо типичных колоний Y.enterocolitica вырастают типичные колонии Y.pseudotuberculosis без каких-либо признаков подавления роста. Вместе с тем ингибирующее действие И-агара по отношению к серрациям и псевдомонадам слабее, чем у CIN-агара. Однако этот недостаток полностью компенсируется четкими различиями в морфологии колоний указанных микроорганизмов и иерсиний. Дифференцирующие свойства И-агара позволили уверенно отличить колонии иерсиний от колоний ассоциантов в 90% случаев посева смешанных культур.

Таблица 2

Показатели ингибиции сред через 48 ч инкубирования при 32°СТест-штаммыПитательные средыБлижайший аналогПредложенная средаY.enterocolitica серовара O30,981,00Y.enterocolitica серовара O90,940,97Y.pseudotuberculosis00,94S.marcescens0,060,85S.liquefaciens0,290,89P.aeruginosa00,95S.typhimurium00P.mirabilis00P.vulgaris00E.cloacae00E.faecalis00E.coli00K.pneumoniae00K.oxytoca00P.stuartii00P.rettgeri00S.aureus00

В табл.3 представлены размеры колоний иерсиний, выращенных на испытуемых средах при 32°С. При расчете не было обнаружено статистически достоверных различий между диаметром колоний иерсиний на предложенной среде и CIN-агаре (при уровне вероятности 95%).

Таблица 3

Средний диаметр колоний иерсиний (мм)Тест-штаммыВремя инкубацииПитательные средыБлижайший аналогПредложенная средаY.enterocolitica серовара O324 ч0,82±0,050,82±0,0548 ч1,17±0,071,2±0,08Y.enterocolitica серовара O924 ч0,8±0,070,77±0,0648 ч1,1±0,111,18±0,1Y.pseudotuberculosis24 чРост отсутствует0,58±0,0548 чРост отсутствует0,99±0,06

Морфологические, тинкториальные, физиолого-биохимические и антигенные свойства иерсиний, выросших на И-агаре, соответствовали таковым после культивирования на среде сравнения - CIN-агаре.

Пример 1.

В материал с миндалин здоровых свиней, помещенный в забуференную пептонную воду (рН 7,6), вносили следующие культуры: Y.enterocolitica серовара О3 (100 КОЕ/мл); S.typhimurium, S.marcescens, P.vulgaris, P.aeruginosa, E.cloacae, E.faecalis, E.coli и S.aureus (no 1000 КОЕ/мл). Посевы инкубировали при 4-6°С в течение 7 сут. Высевы на предлагаемую среду и CIN-агар производили сразу после внесения культур, а также на 3-е, 5-е и 7-е сутки. Засеянные селективные среды для иерсиний инкубировали при 32°С в течение 48 часов с последующей реидентификацией выделенных культур по физиолого-биохимическим и антигенным свойствам. В 10 высевах из 12 (83,3%) иерсиний выделены как на CIN-агаре, так и на предложенной среде.

Таким образом, при более простом составе по сравнению с ближайшим аналогом И-агар имеет улучшенные селективные характеристики в отношении Y. pseudotuberculosis без существенного изменения других свойств среды.

Источники информации

1. Schiemann D.A. Synthesis of a selective agar medium for Yersinia enterocolitica. Can. J. Microbiol, 1979, Vol.25, P.1298-1304 (прототип).

2. Schiemann D.A. Yersinia enterocolitica: observations on some grown characteristics and response to selective agents. Can. J. Microbiol, 1980, Vol.26, P.1232-1240.

3. Л.В.Саяпина. Диагностическая ценность новой питательной среды для выделения и культивирования возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 2000, №6, с.15-18.

4. P.R. Murray, E. Jo Baron, M.A. Pfaller et al. Manual of clinical microbiology, Washington, D.C, 1999, p.483-496.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для диагностики иерсиниоза и псевдотуберкулеза путем выделения Yersinia enterocolitica и Yersinia pseudotuberculosis из клинического и другого материала. Питательная среда (И-агар) содержит, г/л: пептон - 19,0-21,0, дрожжевой экстракт - 1,9-2,1, маннит - 19,0-21,0, натрия пируват - 1,9-2,1, натрия хлорид - 0,95-1,05, магния сульфат - 0,009-0,011, натрия дезоксихолат - 0,48-0,53, нейтральный красный - 0,028-0,032, кристаллический фиолетовый - 0,009-0,0011, агар-агар - 11,9-13,1, иргасан - 0,0039-0,0041, дистиллированная вода - остальное. При более простом составе по сравнению с ближайшим аналогом И-агар имеет улучшенные селективные характеристики в отношении Y. pseudotuberculosis без существенного изменения других свойств среды. 3 табл.

Питательная среда для выделения Yersinia enterocolitica и Yersinia pseudotuberculosis, содержащая пептон, дрожжевой экстракт, маннит, натрия пируват, натрия хлорид, магния сульфат, натрия дезоксихолат, нейтральный красный, кристаллический фиолетовый, агар-агар, иргасан и дистиллированную воду при следующем содержании компонентов, г/л:

Пептон 19,0-21,0

Дрожжевой экстракт 1,9-2,1

Маннит 19,0-21,0

Натрия пируват 1,9-2,1

Натрия хлорид 0,96-1,05

Магния сульфат 0,009-0,011

Натрия дезоксихолат 0,48-0,53

Нейтральный красный 0,028-0,032

Кристаллический фиолетовый 0,009-0,0011

Агар-агар 11,9-13,1

Иргасан 0,0039-0,0041

Дистиллированная вода Остальное