СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ С АГГЛЮТИНИНАМИ К ВИРУЛЕНТНЫМ ИЕРСИНИЯМ (СВИ) Российский патент 2003 года по МПК A61K39/395 

Изобретение относится к медицине и ветеринарии и может быть использовано для диагностики или профилактики иерсиниоза и псевдотуберкулеза путем дифференциации вирулентных культур энтеро-патогенных иерсиний от невирулентных и других бактерий.

Известно использование для дифференциации патогенных и непатогенных иерсиний определение их биохимического профиля (биовара) и/или О-серовара [1,2] . Вместе с тем известно, что возбудителями иерсиниоза является только часть представителей вида Yersinia enterocolilica, а именно патогенные варианты, содержащие в своих клетках плазмиду вирулентности pYV [2]. Гены данной плазмиды контролируют проявление многих патогенных свойств возбудителей иерсиниоза и псевдотуберкулеза, некоторые культуральные особенности и синтез ряда белков наружной мембраны при температуре тела хозяина (37^oС). Выявление нуклеотидных последовательностей pYV или контролируемых ее генами белков используется для диагностики заболеваний, вызываемых энтеропатогенными иерсиниями.

Недостатком существующих способов дифференциации возбудителей иерсиниоза и псевдотуберкулеза от непатогенных иерсиний и других энтеробактерий является их трудоемкость и сложность получения тест-систем для них.

Наиболее близким к заявленному техническому решению по существу является способ получения диагностической сыворотки с антителами к вирулентным иерсиниям (Диагностическая сыворотка с антителами к вирулентным иерсиниям. Лабораторное дело, 1990, N10, с.66-68; авторы Смирнов И.В., Горохов В.И.) [3]. При этом сыворотку также получают путем гипериммунизации кроликов клетками вирулентных иерсиний с последующей адсорбцией перекрестно-реагирующих антител микробной суспензией. Недостатками указанного способа является сложность проведения иммунизации кроликов и недостаточная точность в работе, связанная с использованием нестандартных штаммов-адсорбентов сыворотки. Используемое субконъюнктивальное введение антигена придает способу трудоемкость, но замена его на обычное внутривенное введение фактически не влияет на сроки получения гипериммунной сыворотки и высоту титра ее специфических антител (табл.1).

Целью настоящего изобретения является упрощение способа получения гипериммунной диагностической сыворотки, которое достигается за счет изменения схемы иммунизации, а также повышение специфичности и чувствительности получаемой сыворотки, которое достигается за счет использования в качестве адсорбентов сыворотки референтных штаммов возбудителя иерсиниоза.

Поставленная цель достигается тем, что для иммунизации кроликов антиген вводят внутривенно по схеме: 0,09-0,11 мл троекратно с интервалом 2-3 дня и через 7-8 дней - еще 2 введения такого же количества антигена с интервалом 2-3 дня, а в качестве адсорбентов используют микробные массы референтных штаммов 189 ГИСК и 207 ГИСК.

Известно, что повышение специфичности адсорбированной диагностической сыворотки возможно при более полном совпадении антигенной структуры штамма-продуцента и штамма, используемого для адсорбции перекрестно-реагирующих антител, причем наибольшей специфичности следует ожидать от применения генетически связанных (изогенных) вариантов с известными характеристиками.

Был получен и всесторонне изучен изогенный вариант штамма-продуцента сыворотки - Yersinia enterocolitica серовара О3 биовара 4, утративший плазмиду вирулентности (pYV^-). Показана его идентичность родительскому штамму 955 S по биологическим свойствам за исключением тех, которые контролируются плазмидой pYV (аутоагглютинабельность, кальцийзависимость, температурозависимая морфология колоний, вирулентные свойства, плазмид-ассоциированные антигены). В качестве штамма-адсорбента при получении иммунной сыворотки к белкам наружной мембраны иерсиний он был депонирован в национальной коллекции (N189 ГИСК). Аналогичным методом был охарактеризован бесплазмидный вариант референтного штамма Yersinia enterocolitica серовара О9 биовара 2 (КМ-33(201) в коллекции ВНИПЧИ "Микроб"), утративший плазмиду вирулентности (pYV^-). В качестве штамма-адсорбента при получении иммунной сыворотки к белкам наружной мембраны иерсиний, а также в качестве тест-штамма для выявления и оценки свойств иерсиний, связанных с содержанием плазмиды вирулентности pYV, он также был депонирован в национальной коллекции (N207 ГИСК).

Оба штамма (NN 189 ГИСК и 207 ГИСК) на авторских правах хранятся в лиофилизированном виде в Государственном научно-исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича (справки о депонировании 01-07/115 от 16.03.89 и 01-07/482 от 19.11.90 соответственно).

Для оценки эффективности применения штаммов ГИСК 189 и ГИСК 207 в качестве адсорбентов при получении сыворотки СВИ лиофильные культуры, полученные из музея, готовили и проверяли в соответствии с указаниями паспорта штамма. Чистые культуры штаммов выращивали при 35-37^oС в течение 24-48 ч, трижды отмывали в физиологическом растворе натрия хлорида. Вначале адсорбцию проводили микробной массой штамма ГИСК 189. Для этого на 1 мл гипериммунной сыворотки добавляли 80-100 мг сырой отмытой массы адсорбента в 2-5 мл физиологического раствора хлорида натрия, тщательно перемешивали, оставляли суспензию в термостате при 35-37^oС на 1-2 ч, после чего добавляли 40-50 мг сырой массы культуры ГИСК 207, вновь суспензировали, выдерживали при 35-37^oС 1-2 ч, перемешивали и оставляли на 18-20 ч при 4-8^oС.

После проведения адсорбции микробные клетки удаляли центрифугированием и фильтрованием через мембранные фильтры. Рабочие разведения сыворотки (1: 20-1: 50) готовили с использованием фенолизированного физиологического раствора хлорида натрия (конечная концентрация фенола 0,25%).

Результаты испытания СВИ, полученной предлагаемым способом, представлены в табл.2.

Таким образом, проведенные исследования показали, что при меньшей трудоемкости полученная сыворотка позволяет более точно дифференцировать вирулентные штаммы возбудителя иерсиниоза и псевдотуберкулеза от невирулентных иерсиний и других энтеробактерии.

Источники информации
1. Инструкция по эпидемиологии, организации и проведению противоэпидемических мероприятий и лабораторной диагностике псевдотуберкулеза и иерсиниоза // В. Н.Багрянцев, А.Б.Дайтер, Ф.Г.Дятлов и др. - М.: МЗ СССР, N15-6/42, утв.30.10.90, - 48 с.

2. Смирнов И.В., Ценева Г.Я. Фенотип возбудителя иерсиниоза и его значение для диагностики / Журн. микробиол. - 1992, - N1, - с.60-65.

3. Смирнов И.В., Горохов В.И. Диагностическая сыворотка с антителами к вирулентным иерсиниям / Лабораторное дело, 1990, N10, с.66-68 (прототип).

Изобретение относится к медицине и ветеринарии и может быть использовано для диагностики или профилактики иерсиниоза и псевдотуберкулеза. Сыворотку получают путем иммунизации кроликов, при этом антиген вводят внутривенно по схеме: 0,09-0,11 мл трехкратно с интервалом 2-3 дня и через 7-8 дней - еще 2 введения с интервалом 2-3 дня, а в качестве адсорбентов используют микробные массы референтных штаммов 189 ГИСК и 207 ГИСК. Полученная сыворотка позволяет при уменьшении трудоемкости способа более точно дифференцировать вирулентные штаммы возбудителя иерсиниоза и псевдотуберкулеза от невирулентных иерсиний и других энтеробактерий. 2 табл.

Способ получения диагностической сыворотки с агглютининами к вирулентным иерсиниям (СВИ) путем гипериммунизации кроликов плазмидосодержащим (pYV+) штаммом Yersinia enterocolitica серовара ОЗ и последующей адсорбции бесплазмидными (pYV-) вариантами иерсинии, отличающийся тем, что для иммунизации кроликов антиген вводят внутривенно по схеме: 0,09-0,11 мл трехкратно с интервалом 2-3 дня и через 7-8 дней - еще 2 введения с интервалом 2-3 дня, а в качестве адсорбентов используют микробные массы референтных штаммов ГИСК 189 и ГИСК 207.