Штамм @ @ -82 продуцент @ -амилазы и питательная среда для культивирования штамма @ @ -82 (варианты) Советский патент 1984 года по МПК C12N1/20 C12N9/28 C12N15/00 

Изобретение относится к спиртовой, крахмало-паточной и микробиологической промышленности, в частности к получению, штаммов микроорга низмов , обладающих высокой амилолитической активностью, и питательным средам для их культивирования. Известны штаммы BaciJTus subtili продуценты амилолитическик ферменто обладающие высокой амилолитической активностью Л , Недостатком этих штаммов являетс длительность процесса культивирования, что затрудняет их получение в производственных условиях и использ ванне .для осахаривания. Наиболее близким к.предлагаемому является штамм Bacillus mesentericu ПБ sp. ВНИИПрБ, продуцирующийoi-ами лазу . Он имеет следующие морфологические признаки: палочки размером 4-5 мк 0,8-1,0 мк, иногда образующие цепочки из 2-4 палочек. Однообразно окрашенные, без капсул, неподвижные, окраска по Граму поло жительная, окрашиваются разбавленны раствором метиленовой сини или нейт ральротом. Протоплазма окрашивается однородно. Бактерия спорообразующая на мясопептонном агаре дает колонии белые или тускло-белые округлой формы диаметром 2-2,5 мм. Продолжительность культивирования штамма 72 ч 2 . Недостатком этого штамма являетс то, что он не обладает достаточной амилолитической активностью. Максимальная активность штамма составляет 30-40 ед/мл культуральной жидкости. Наиболее близкой по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является питательная среда для культивирования mesentericus ПБ sp. ВНИИПрБ- продуцента о -амилазы, содержащая в : качестве источников углерода и азота кукурузную муку, диаммонийфосфат и кукурузный экстракт, а также мел и воду при следующих соотношениях компонентов, вес.%: Кукурузная мука 6,0 Диаммонийфосфат 0,9 Кукурузный экстракт 1,0 Мел0,2 ВодаОстальное Однако у данной питательной сред недостаточно высокая активность выр 972 щенного на ней полученного штамма Вас. subtiJis-82 - 50 ед/мл к.ж. Цель изобретения - получение нового штамма бактерии, обладающего высокой амилолитической активностью, который можно использовать для разжижения и осахаривания крахмалсодержащего сырья в спиртовой промьшгленности, увеличение амилолитической активности продуцента. Штамм Bacillus subtiSis 82 получают методом адаптации с последующей селекцией к питательной среде известных штаммов вида Bacillus subtitis в частности. Bacillus subtilis, хранящегося в музее чистых культур ВНИИПрБ под.№ 357 и обладающего оС амилазной активностью в 20 ед/мл к.ж. Исходный штамм Bacillus subtilis 357 рассеивают на плотной питательной среде, содержащей крахмал. Отбирают колонии, образующие зоны гидролиза крахмала,.а при глубинном выращивании - обладающие в сравнении с исходным штаммом повьш1енной активностью об-амилазы. В результате длительной адаптации к среде, содержащей источники азота и углерода (крахмал, дрожжевой автолизат), отбирают варианты, обладающие о6-амилазной активностью в 50 ед/мл к.ж. Получают штамм subtitis 82 - продуцент ot-амилазы, имеющий следующую характеристику. Морфологические признаки: клетки прямые, палочковидные, средние размеры 0,6-0,84 ммкх 2,4-3,5 ммк, подвижные, грамположительные, находятся отдельно или в виде небольших цепочек в 2-4 клетки. Культуральные признаки: на агаризованной среде, состоящей из 50% мясопептонного бульона и 50% ячменного сусла, 24 -часовая культура образует колонии диаметром 3-4 мм, 48-часовая - диаметром 5-7 мм. При выращивании на жидкой среде указанного состава при 40 С на 24 ч образуется пленка с глубокими крупными складками, белая, с едва заметным зернистым налетом, бульон прозрачный. Физиологические признаки:аэроб, культура Ладролизует крахмал, декстрины, ассимилирует аммонийные соли органических кислот, хорошо растет на пентоне, казеине. Температурный оптимум роста 35-40°С. Оптимум рН роста 5,0-8,0. Культура хранится в пробирках на мясопептонном агаре. Для определения активности стерильную питательную среду засевают штаммом Bacillus subtiJis-82, посл чего инкубируют культуру при на качалке при 220 об/мин.. После 72 ч роста в культурапьной жидкости определяют активность об-амилазы. С целью увеличения амилолитической активности продуцента питательная среда для культивирования штамма Bacillus subtitis-82-продуцент oL-амилазы, содержащая в качестве :источников углерода и азота кукурузную муку, диаммонийфрсфат и кукурузный экстракт, а также мел и воду, дополнительно содержит мочевину при следующем соотношении компонентов, мас.%: Кукурузная мука 6-0-12,0 Диаммонийфосфат (NH4),,HP040,9-1,0 .Мел0,2-0,5 Кукурузный экстракт 4,0-4,5 Мочевина0,15-0,20 ВодаДо 100 По второму варианту питательная .среда для культивирования Bacillus ilSu.bti2is-82 - продуцента об-амилазы, ,содержащая в качестве источников углерода и азота кукурузную муку и Диаммонийфосфат, дополнительно содержит мочевину и барду при следующем соотношении компонентов, мас.%: Кукурузная мука 6,0-12,0 Диаммонийфосфат (№Ц)2НР040,9-1,0 Мел0,15-0,20 . Мочевина0,15-0,20 БардаДо 100 Исйользование барды позволяет снизить пенение с;реды в процессе выращивания продуцента, что способ- ствует сохранению стерильности куль туры. Кроме того, замена кукурузног экстракта бардой способствует сниже нию себестоимости продукта. Пример 1. Повевной материа штамма Bacillus subtifis-82 № ЦМПМ В-2595, используемый для засева ферментационной среды, представляет собой бактериальную пленку, выращен ную в течение 48 ч при на жидкой среде, состоящей из равных объемов мясопептонного бульона и .ячменного сусла концентрацией 7Б. Культуру выращивают глубинным способом с засевом среды кусочком бактериальной пленки в течение 48 ч при 35 С на качалке с числом оборотов 220 об/мин на ферментационной среде следующего состава, мас,%: Кукурузная мука 6,О Диа Фюнийфосфат 0,9 Мел0,20 Мочевина0,15 БардаОстальное Контролем служит ферментационная среда для выращивания Bacillus mesentericus ПБ sp. ВНИИПрБ следующего состава, мас.%: Кукурузная мука 6,0 Диаммонийфосфат 0,9 Мел0,20 Кукурузньй экстракт 1,0 ВодаОстальное Полученные при этом активности О -амилазы представлены в табл. 1. Пример 2. Посевной материал BacilJus subtiiis-82 выращивают аналогично примеру 1. Выращивание Bacillus subtiIis-82 про.водят глубинным способом на качалке с числом оборотов 220 об/мин при 35G в течение 48 ч на фермен- . тационной среде следующего состава, мас.%: Кукурузная мука .6,0 Диаммонийфосфат Oj 9 Мел 0,2 Кукурузный экстракт 4,0 МочевинаOj15 ВодаОстальное Полученные активности представлены в табл. 2. Контролем служит питательная среда по примеру 1. I . Пример 3. Посевной материал выращивают аналогично примеру 1. Выращивание штамма Bacillus- subtilis82 проводят глубинным методом на качалке с числом оборотов 220 об/мин при 35 С в течение 72 ч на ферментационной среде следующего состава, мас.%: Кукурузная мука 12,0 Диаммонийфосфат 0,9 Мел0,5 Кукурузный экстракт 4,0 МочевинаО,15 ВодаОстальное Полученные активности представлены в табл. 3. Контролем служит питательная среда, приведенная в примере 1.

1. ШТАММ Baciilus subtilis-82 (коллекция музея промьппленных микроорганизмов, коллекционный номер ЦМПМ В-2595) - продуцент ot-амилазы, .используемый для осахаривания крах-малсожержащего сырья в производстве спирта. 2. Питательная среда для культивирования штамма Bacillus subtilis6-12 Кукурузная мука 0,9-1,0 Диаммонийфосфат 0,2-0,5 Мел 0,15-0,20 Мочевина 4,0-4,5 Кукурузный экстракт 8 (О До 100 Вода 3. Питательная среда для культивирования Bacilfus subtilis-82 продуцента сб-амилазы, содержащая в качестве источников углерода и изота кукурузную муку и диаммонййфосфат, а также мел, отличающаяся тем, что, с целью увеличения амилолитической активности продуцента, среда дополнйтел,ьнр . . содержит мочевину и барду при следующем соотношении компонентов, мас.%: 6-12 Кукурузная мука 0,9-1,0 Диаммонийфосфат 0,15-0,20 Мел 0,15-0,20 Мочевина До 100 Барда