СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕСТРИКТАЗЫ E.CORII ИЗ ШТАММА БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI B 834/PSK 323 Советский патент 1994 года по МПК C12N9/22 C12N9/22 C12R1/19 

Изобретение относится к молекулярной биологии и генно-инженерной биотехнологии, а именно к получению рестрикционной эндонуклеазы Е.coRП.

Цель изобретения - повышение степени очистки фермента от неспецифических нуклеаз и повышение выхода продукта.

Способ осуществляют следующим образом.

Биомассу Escherichia coli B834/pSK 323 суспендируют в 10 мМ К-фосфатном буфере, рН 7,0, содержащем 7 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ трилон Б, а также N-ацетилмурамидгликаногидролазу и алкилфенилполи- этиленгликоль при весовых соотношениях 0,9-1,1:190-210.

Добавление детергента алкилфенилполиэтиленгликоля приводит к более полной экстракции эндонуклеаз рестрикции, наиболее существенным его присутствие оказывается на стадии разрушения клеток. Одновременно N-ацетилмурамидгликаногидролаза оказывает лизирующее действие на бактериальные клетки, растворяя их клеточные стенки. Этот фермент катализирует гидролиз специфических гликозидных связей между остатками аминосахаров, N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, чередующихся в данных полисахаридных цепях, обнаруживаемых в клеточных стенках микроорганизмов. Гидролиз субстрата происходит в результате кооперативного действия остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот N-ацетилмурамидгликаногидролазы. После перемешивания клетки разрушают ультразвуком. Из бесклеточного экстракта рестриктазу осаждают полиэтиленимином, добавляя его до концентрации 0,3%, ресуспендируют в 10 мМ К-фосфатном буфере, рН 7,0, содержащем 7 мМ - 2-меркантоэтанол и 1 мМ трилон Б и 0,4 М хлористый калий. Белки осаждают сульфатом аммония. Очистку на ДЭАЭ-целлюлозе осуществляют со скоростью 25-35 мл/ч, общий объем элюента составляет 9-11 свободных объемов колонки. Последующую очистку на фосфоцеллюлозе Р-11 проводят при скорости 25-35 мл/ч. Фракции, содержащие активный фермент, диализуют против рабочего буфера в течение 5-7 ч.

П р и м е р 1. 50 г биомассы Escherichia coli B834/pSK323 суспендируют в 10 мМ К-фосфатном буфере, рН 7,0, содержащем 7 мМ 2-меркаптоэтанол и 1 мМ трилон Б.

К суспензии одновременно добавляют N-ацетилмурамидгликаногидролазу и алкилфенилполиэтиленгликоль при весовых соотношениях 1,0:200. Смесь оставляют перемешиваться на магнитной мешалке. Затем клетки разрушают с помощью ультразвука. Из бесклеточного экстракта фермент осаждают полиэтиленимином (добавляя его до концентрации 0,3%) и ресуспендируют в 10 мМ К-фосфатном буфере, рН 7,0, содержащем 7 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ трилон Б и 0,4 М KCl. Белки осаждают сульфатом аммония. Разделение метилазы E.coRII и рестриктазы E.coRII осуществляют посредством колоночной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе ДЕ-52 (скорость нанесения и элюции фермента 30 мл/ч, общий объем градиента составляет 10 свободных объемов колонки. Последующую очистку рестриктазы E.coRII проводят на фосфоцеллюлозе Р-11 (скорость нанесения и элюции фермента 30 мл/ч, общий объем градиента - 5 свободных объемов колонки).

Фракции, содержащие активный фермент, деализуют против К-фосфатного буфера в течение 6 ч. Затем проводят концентрирование фермента. Активность 45000 ед/мг белка Выход 9000 ед/г биомассы.

П р и м е р 2. Выделение и очистку фермента проводят по примеру 1, изменяют следующие условия: весовое соотношение N-ацетилмурамидглика- ногидролазы и алкил- фенилполиэтиленгли- коля 0,9:190 скорость нанесения и элюции фермента во время хроматогра- фии на ДЭАЭ-целлюло- зе ДЭ-52 25 мл/ч объем элюента 9 свободных
объемов колон-
ки скорость нанесения и элюции фермента во время хроматографии на фосфоцеллюлозе 25 мл/ч диализ перед концен- трированием фермен- та в течение 5 ч Активность 40000 ед/мг
белка Выход 8000 ед/г био-
массы
П р и м е р 3. Выделение и очистку фермента проводят по примеру 1, изменяют следующие условия:
весовые соотношения
N-ацетилмурамидглика-
ногидролазы и алкилфе- нилполиэтиленгликоля 1,1:210,
скорость нанесения
и элюции во время хроматографии на ДЭАЭ- целлюлозе ДЭ-52 35 мл/ч, объем элюента 11 свободных
объемов
колонки, скорость нанесе- ния и элюции фермен- та во время хромато- графии на фосфоцеллю- лозе 35 мл/ч, диализ перед концен- трированием фермента в течение 7 ч. Активность 41000 ед/мг
белка, Выход 8400 ед/ч
биомассы.

Примеры, иллюстрирующие объем притязаний (ниже и выше заявляемых пределов).

П р и м е р 4. Выделение и очистку фермента проводят по примеру 1, изменяют следующие условия:
весовые соотношения
N-ацетилмурамидглика-
ногидролазы и алкил-
фенилполиэтиленгли- коля 0,8:180,
скорость нанесения и
элюции во время хро-
матографии на ДЭАЭ-цел- люлозе ДЭ-52 20 мл/ч, объем элюента 8 свободных
объемов
колонки,
скорость нанесения
и элюции фермента во время хроматогра- фии на фосфоцеллю- лозе 20 мл/ч,
диализ перед концен- трированием фер- мента в течение 4 ч. Активность 30000 ед/мг
белка. Выход 6500 ед/г
биомассы.

П р и м е р 5. Выделение и очистку фермента проводят по примеру 1, изменяют следующие условия:
весовые соотношения
N-ацетилмурамидглика-
ногидролазы и алкил- фенилполиэтиленгли- коля 1,2:220,
скорость нанесения и
элюции во время хрома-
тографии на ДЭАЭ-цел- люлозе ДЭ-52 40 мл/ч, объем элюента 12 свободных
объемов
колонки,
скорость нанесения
и элюции фермента
во время хроматогра-
фии на фосфоцеллю- лозе 40 мл/ч,
диализ перед концен- трированием фермента в течение 8 ч. Активность 32000 ед/мг Выход 6800 ед/г
биомассы.

П р и м е р 6. 10 г биомассы E.coli B843/pSK323 суспендируют в 10 мМ К-фосфатном буфере, рН 7,0, содержащем 7 мМ 2-меркаптоэтанол и 1 мМ - трилон Б.

К суспензии одновременно добавляют N-ацетилмурамидгликаногидролазу и алкилфенилполиэтиленгликоль при весовых соотношениях 1,0:200. Смесь оставляют перемешиваться на магнитной мешалке. Затем клетки разрушают с помощью ультразвука. Из бесклеточного экстракта фермент осаждают полиэтиленимином (добавляя его до концентрации 0,3%) и ресуспендируют в 10 мМ К-фосфатном буфере, рН 7,0, содержащем 7 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ трилон Б и 0,4 М KCl. Белки осаждают сульфатом аммония. Разделение метилазы E.coRII и рестриктазы E. coRII осуществляют посредством колоночной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе ДЕ-52 (скорость нанесения и элюции фермента 30 мл/ч), общий объем градиента составляет 10 свободных объемов колонки. Последующую очистку рестриктазы E.coRII проводят на фосфоцеллюлозе Р-11 (скорость нанесения и элюции фермента 30 мл/ч, общий объем градиента 5 свободных объемов колонки).

Фракции, содержащие активный фермент, диализуют против рабочего буфера в течение 6 ч. Затем проводят концентрирование фермента. Активность 45000 ед/мг
белка. Выход 9000 ед/г
биомассы.

П р и м е р 7. Выделение и очистку фермента проводят по периметру 1, изменяют следующие условия:
весовые соотношения
N-ацетилмурамидгли-
каногидролазы и алкил- фенилполиэтиленгли- коля 0,9:190, скорость нанесения и
элюции фермента во
время хроматографии
на ДЭАЭ-целлю- лозе ДЕ-52 25 мл/ч, объем элюента 9 свободных
объемов
колонки,
скорость нанесения и
элюции фермента во
время хроматографии на фосфоцеллюлозе 25 м
диализ перед концен- трированием фермента в течение 5 ч. Активность 40000 ед/мг
белка. Выход 8000 ед/г
биомассы
П р и м е р 8. Выделение и очистку фермента проводят по примеру 1, изменяют следующие условия:
весовые соотношения
N-ацетилмурамидглика-
ногидролазы и алкилфе- нилполиэтиленгликоля 1,1:210,
скорость нанесения и
элюции во время хро-
матографии на ДЭАЭ-целлю- лозе ДЕ-52 35 мл/ч, объем элюента 11 свободных
объемов
колонки, скорость нанесения и элюции ферментов во время хроматографии на фосфоцеллюлозе 35 мл/ч, диализ перед концен- трированием фермента в течение 7 ч. Активность 41000 ед/мг
белка. Выход 83400 ед/г
биомассы
Преимущества изобретения представлены в таблице.

Изобретение относится к способам выделения биологически активных веществ, в частности ферментных препаратов рестриктаз, применяемых в генной инженерии. Цель изобретения - повышение степени очистки фермента от неспецифических нуклеаз и повышение выхода фермента. Сущность изобретения заключается в том, что биомассу штамма Escherichia coli B 834/p SK 323 суспендируют в калий-фосфатном буфере, pH 7,0, добавляют дезинтегрирующую смесь: N-ацетилмурамидгликаногидролазу и алкилфенилполиэтиленгликоль при весовых соотношениях 0,9-1,1:190-210. После разрушения клеток ультразвуком фермент осаждают полиэтиленамином, добавляя его до концентрации 0,3%, ресуспендируют в калий-фосфатном буфере, pH 7,0, содержащем 0,4 М.KCl, осаждают сульфатом аммония. Последующее разделение метилаз и рестриктаз проводят на ДЭАЭ-целлюлозе при скорости нанесения и элюции фермента 25-35 мл/г и общем объеме элюэнта 9-11 объемов колонки. Дальнейшая очистка на фосфоцеллюлозе Р-11 проводится со скоростью 25-35 мл/ч. Фермент концентрируют диализом против рабочего буфера в течение 5-7 ч. 1 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕСТРИКТАЗЫ E.CORII ИЗ ШТАММА БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI B 834/pSK 323 путем дезинтеграции клеток в смеси, содержащей 10 мМ калий - фосфатного буфера, рН 7,0, 7 мМ 2-меркаптоэтанола и 1 мМ трилона Б, разрушения клеток ультразвуком, осаждение фермента из бесклеточного экстракта полиэтиленимином, который добавляют до концентрации 0,3 - 0,5%, экстракции фермента 0,4 М раствором хлористого калия, осаждения сульфатом аммония, очистку на ДЭАЭ-целлюлозе при элюировании фермента раствором хлористого калия с возрастающей концентрацией от 0 до 0,3 М и последующую очистку на фосфоцеллюлозе при элюировании раствором, хлористого калия с возрастающей концентрацией от 0,1 М до 0,5 М и концентрировании, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода фермента и степеней очистки его от неспецифических нуклеаз, в состав дезинтегрируемой смеси вводят N-ацетилмурамидгликоногидролазу и алкилфенилполиэтиленгликоль при весовых соотношениях 0,9 - 1,1 : 190 - 210, очистку на ДЭАЭ-целлюлозе осуществляют со скоростью элюции 25 - 30 мл/ч, при этом объем элюента равен 9 - 11 свободных объемов колонки, а очистку на фосфоцеллюлозе проводят со скоростью 25 - 35 мл/ч, причем перед концентрированием очищенный раствор фермента диализуют против 10 мМ калийфосфатного буфера, рН 7,0, содержащего 7 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ трилон Б и 0,2 М КСI в течение 5 - 7 ч.