СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУЛЯРЕМИИ Российский патент 2009 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для бактериологической диагностики туляремии.

Известен способ культивирования возбудителя туляремии в жидкой питательной среде М.С.Дрожевкиной на основе куриных желтков и стерильного физиологического раствора (Туляремия / Под ред. Н.Г.Олсуфьева. - М.: Медгиз, 1960. - 462 с.).

К недостаткам данного способа следует отнести разрушение компонентов питательной среды при стерилизации и продолжительность размножения в среде возбудителя туляремии до 10 суток.

Наиболее близким является способ культивирования F. tularensis в жидкой питательной среде в колбах в статических условиях в течение 120 ч при температуре 37°С. Используют жидкую питательную среду следующего состава, г/л:

L-аргинин - 0,2;

L-цистеин - 1,5;

L-гистидин - 2,0;

L-изолейцин - 0,3;

DL-метионин - 1,0;

DL-лейцин - 0,4;

L-лизин - 0,4;

L-пролин - 1,0;

DL-треонин - 4,0;

L-тирозин - 0,2;

L-валин - 0,8;

глюкоза - 15,0;

хлорид натрия - 5,0;

сульфат магния - 0,04;

тиамин - 0,02;

пантотенат кальция - 0,05;

натрий фосфорнокислый двузамещенный - 1,8;

калий фосфорнокислый однозамещенный - 2,8;

L-аспарагиновая кислота - 0,2;

L-серин - 0,2;

дистиллированная вода - до 1 л

(Майский В.Г., Шишов И.Н., Басилова Г.И. Питательные потребности Francisella tularensis // Ж. микробиол. - 1984. - №6. - С.20-23).

В известном способе видимый рост возбудителя туляремии появляется через 48 ч после инокуляции посевного материала в жидкую питательную среду.

Общим с заявляемым решением является близкое содержание компонентов жидкой питательной среды и культивирование в статических условиях.

К недостаткам данного способа следует отнести недостаточно высокий рост возбудителя туляремии и большое количество посевного материала.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа культивирования возбудителя туляремии, позволяющего увеличить выход клеток данного микроорганизма при незначительном количестве посевного материала.

Поставленная задача решается путем культивирования F. tularensis в жидкой питательной среде в статических условиях в течение 120 ч при температуре 37°С. Культивирование осуществляют в жидкой питательной двухфазной среде, нижнюю фазу которой представляет собой перфтордекалин (ПФД) - газопереносящая подложка, а верхнюю фазу - жидкая питательная среда следующего состава, г/л:

L-аргинин - 0,2;

L-цистеин - 1,5;

L-гистидин - 2,0;

L-изолейцин - 0,3;

DL-метионин - 1,0;

DL-лейцин - 0,4;

L-лизин - 0,4;

L-пролин - 1,0;

DL-треонин - 4,0;

L-тирозин - 0,2;

L-валин - 0,8;

L-аспарагиновая кислота - 0,2;

L-серин - 0,2;

глюкоза - 15,0;

хлорид натрия - 5,0;

сульфат магния - 0,04;

тиамин - 0,02;

пантотенат кальция - 0,05;

натрий фосфорнокислый двузамещенный - 1,8;

калий фосфорнокислый однозамещенный - 2,8;

дистиллированная вода - до 1 л при соотношении фаз 1:1.

Посев возбудителя туляремии осуществляют на границе раздела фаз жидкой питательной двухфазной среды.

ПФД относится к перфторуглеродам, которые представляют собой фторированные углеводороды, в которых атомы водорода полностью замещены атомами фтора.

ПФД представляет собой химически инертную, гидрофобную жидкость в два раза тяжелее воды, способную растворять в себе большие количества кислорода (51 об.%) и углекислого газа (193 об.%) и легко освобождать эти газы при изменении их содержания в окружающей среде.

Сущность технического решения поясняется следующим.

Предложенный способ за счет улучшения газообмена стимулирует рост возбудителя туляремии, в результате чего выход клеток F. tularensis увеличивается более чем в два раза.

ПФД эффективно поддерживает газообмен в живых системах и биологических объектах. При соединении жидкой среды с ПФД в пробирке формируется двухфазная система, в силу своего большого веса ПФД располагается под средой, не смешиваясь с ней, а на границе раздела фаз создаются оптимальные условия для размножения микроорганизмов за счет улучшенного газообмена и абсорбции питательных веществ на поверхности ПФД. Присутствие в системе культивирования подложки из ПФД с высокой газовой емкостью, прежде всего, дает возможность улучшить аэрацию растущей культуры.

Способ осуществляется следующим образом.

Стерильный ПФД помещают в пробирку в количестве 3 мл, на него наслаивают 3 мл жидкой питательной среды. Таким образом, формируется система, нижнюю фазу которой составляет более тяжелый ПФД, а верхнюю - питательная среда. Посев возбудителя туляремии осуществляют на границе раздела фаз. Культивирование проводят в статических условиях в течение 120 ч при температуре 37°С.

Пример 1. Культивирование F. tularensis Schu осуществляют на среде следующего состава, г/л:

L-аргинин - 0,2;

L-цистеин - 1,5;

L-гистидин - 2,0;

L-изолейцин - 0,3;

DL-метионин - 1,0;

DL-лейцин - 0,4;

L-лизин - 0,4;

L-пролин - 1,0;

DL-треонин - 4,0;

L-тирозин - 0,2;

L-валин - 0,8;

L-аспарагиновая кислота - 0,2;

L-серин - 0,2;

глюкоза - 15,0;

хлорид натрия - 5,0;

сульфат магния - 0,04;

тиамин - 0,02;

пантотенат кальция - 0,05;

натрий фосфорнокислый двузамещенный - 1,8;

калий фосфорнокислый однозамещенный - 2,8;

дистиллированная вода - до 1 л.

В пробирки вносят 3 мл данной среды и добавляют культуру F. tularensis Schu из расчета 1×10⁷ КОЕ/мл (КОЕ - колониеобразующая единица).

Культивирование проводят в статических условиях в течение 120 ч при температуре 37°С. Контроль за ростом культуры осуществляли макрокультуральным методом на плотной питательной среде того же состава. Пробы материала для подсчета количества клеток F. tularensis Schu брали каждые 24 ч после посева.

Предлагаемый способ позволяет получить 8,8×10⁹ КОЕ/мл на 120 ч роста.

Пример 2. Культивирование F. tularensis Schu осуществляют в жидкой питательной двухфазной среде, нижнюю фазу которой представляет собой перфтордекалин - газопереносящая подложка, а верхнюю фазу - жидкая питательная среда следующего состава, г/л:

L-аргинин - 0,2;

L-цистеин - 1,5;

L-гистидин - 2,0;

L-изолейцин - 0,3;

DL-метионин - 1,0;

DL-лейцин - 0,4;

L-лизин - 0,4;

L-пролин - 1,0;

DL-треонин - 4,0;

L-тирозин - 0,2;

L-валин - 0,8;

глюкоза - 15,0;

хлорид натрия - 5,0;

сульфат магния - 0,04;

тиамин - 0,02;

пантотенат кальция - 0,05;

натрий фосфорнокислый двузамещенный - 1,8;

калий фосфорнокислый однозамещенный - 2,8;

L-аспарагиновая кислота - 0,2;

L-серин - 0,2;

дистиллированная вода - до 1 л,

при соотношении фаз 1:1.

Культивирование F. tularensis Schu осуществляют следующим образом.

Стерильный ПФД помещают в пробирку в количестве 3 мл, на него наслаивают 3 мл жидкой питательной среды. Таким образом, формируется система, нижнюю фазу которой составляет более тяжелый ПФД, а верхнюю - питательная среда. Посев возбудителя туляремии осуществляют на границе раздела фаз. Культивирование проводят в статических условиях в течение 120 ч при температуре 37°С. Контроль за ростом культуры осуществляли макрокультуральным методом на плотной питательной среде того же состава, но без добавления ПФД.

Предлагаемый способ позволяет получить 17,4×10⁹ КОЕ/мл на 72 ч роста, что в 2 раза превышает количество клеток, полученное в примере 1 на 120 ч роста.

Пример 3. Культивирование F. tularensis Schu осуществляют по технологии, описанной в примере 1, но добавляют культуру F. tularensis Schu из расчета 1×10⁵ КОЕ/мл.

Предлагаемый способ позволяет получить 8,3×10⁹ КОЕ/мл на 120 ч роста.

Пример 4. Культивирование F. tularensis Schu осуществляют по технологии, описанной в примере 2, но добавляют культуру F. tularensis Schu из расчета 1×10⁵ КОЕ/мл.

Предлагаемый способ позволяет получить 17,1×10⁹ КОЕ/мл на 120 ч роста. Данное количество клеток соответствует максимальному количеству клеток, полученному в примере 2, что показывает возможность использования при культивировании F. tularensis небольшого количества посевного материала.

Пример 5. Культивирование F. tularensis 15 НИИЭГ осуществляют по технологии, описанной в примере 1.

Предлагаемый способ позволяет получить 4,3×10⁹ КОЕ/мл на 120 ч роста.

Пример 6. Культивирование F. tularensis 15 НИИЭГ осуществляют по технологии, описанной в примере 2.

Предлагаемый способ позволяет получить 10,3×10⁹ КОЕ/мл на 72 ч роста, что в 2,4 раза превышает количество клеток, полученное в примере 5 на 120 ч роста.

Пример 7. Культивирование F. tularensis 15 НИИЭГ осуществляют по технологии, описанной в примере 3, при этом отмечается отсутствие видимого роста даже на 120 ч роста.

Предлагаемый способ позволяет получить 2,1×10⁷ КОЕ/мл на 120 ч роста.

Пример 8. Культивирование F. tularensis 15 НИИЭГ осуществляют по технологии, описанной в примере 4.

Предлагаемый способ позволяет получить 10,2×10⁹ КОЕ/мл на 120 ч роста.

Данное количество клеток соответствует максимальному количеству клеток, полученному в примере 6, что показывает возможность использования при культивировании F. tularensis небольшого количества посевного материала.

Сводные данные по абсолютному количеству клеток F. tularensis в описанных выше примерах представлены в таблице.

Из таблицы следует, что максимальное количество клеток F. tularensis в двухфазной среде достигало на 72 ч роста и превышало таковое в обычной среде в 2,0-2,4 раза при количестве посевного материала 1×10⁷ КОЕ/мл, а при количестве посевного материала 1×10⁵ КОЕ/мл максимальное количество клеток F. tularensis в двухфазной среде достигало на 120 ч.

Таким образом, способ культивирования F. tularensis в жидкой питательной двухфазной среде в статических условиях обеспечивает увеличение скорости роста и количества клеток, т.е. способствует повышению эффективности культивирования, при этом достигается хорошая воспроизводимость результатов при культивировании возбудителя туляремии различных подвидов. Данный способ можно использовать при выделении F. tularensis из органов больных и иммунизированных животных с малой обсемененностью.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для бактериологической диагностики туляремии. Способ предусматривает следующее. На стерильный перфтордеколин, представляющий собой нижнюю фазу, наслаивают жидкую питательную среду, содержащую L-аргинин, L-цистеин, L-гистидин, L-изолейцин, DL-метионин, DL-лейцин, L-лизин, L-пролин, DL-треонин, L-тирозин, L-валин, L-аспарагиновую кислоту, L-серин, глюкозу, хлорид натрия, сульфат магния, тиамин, пантотенат кальция, натрий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, дистиллированную воду при соотношении фаз 1:1. Засевают F. tularensis на границе фаз и культивируют. Культивирование F. tularensis в жидкой двухфазной питательной среде осуществляют в статических условиях в течение 120 ч при температуре 37°С. Изобретение позволяет повысить выход клеток микроорганизма. 1 табл.

Способ культивирования F. tularensis в жидкой питательной среде в статических условиях в течение 120 ч при температуре 37°С, отличающийся тем, что культивирование осуществляют в жидкой питательной двухфазной среде, нижнюю фазу которой представляет собой перфтордекалин - газопереносящая подложка, а верхнюю фазу - жидкая питательная среда следующего состава, г/л:
L-аргинин 0,2 L-цистеин 1,5 L-гистидин 2,0 L-изолейцин 0,3 DL-метионин 1,0 DL-лейцин 0,4 L-лизин 0,4 L-пролин 1,0 DL-треонин 4,0 L-тирозин 0,2 L-валин 0,8 глюкоза 15,0 хлорид натрия 5,0 сульфат магния 0,04 тиамин 0,02 пантотенат кальция 0,05 натрий фосфорно-кислый двузамещенный 1,8 калий фосфорно-кислый однозамещенный 2,8 L-аспарагиновая кислота 0,2 L-серин 0,2 дистиллированная вода до 1 л