СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 2002 года по МПК C12Q1/04 G01N33/569 

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам диагностики туберкулеза с помощью микробиологических методов исследования.

В настоящее время для диагностики туберкулеза используют, как правило, методы высевания микроорганизмов на селективных питательных средах с последующим определением количества колоний и природы бактерий (Современные методы микробиологической диагностики туберкулеза. Метод. рекомендации. Сост. М.Б. Должанский, Т.Н. Щенко. М., 1975, 40 с.; Микробиологическая диагностика туберкулеза мочеполовой системы. Метод. реком. Сост. Н.К. Кочетков, Е. Н. Мякотина, М., 1980, 13 с.; Приготовление и использование питательных сред на основе препаратов микробного синтеза для культивирования микобактерий туберкулеза. . Метод. реком. Сост. В.А. Анинин, В.М. Должанский, М., 1986, 8 с.).

Недостатками указанных методов являются длительность анализа (несколько месяцев) и недостаточная точность.

Наибольшую надежность продемонстрировал метод диагностики туберкулеза, являющийся прототипом заявляемого изобретения (Техника и методика бактериологической диагностики туберкулеза. Метод. рек. Сост. И.П. Черноградский и Ю.П. Афанасьева, Якутск, 1988, 20 с.).

Сущность метода состоит в том, что диагностируемый материал смешивают в соотношении 1: 1 с 1% серной кислотой и выдерживают 24 часа при комнатной температуре. Затем смесь разливают в пробирки и центрифугируют при скорости 1500 об/мин, в течение 10 минут. Надосадочную жидкость сливают, а в осадок добавляют среду Школьниковой в количестве 0,6-0,8 мл и рассевают в 4 пробирки с питательной средой (2 пробирки - со средой Финн-2 и 2 - со средой Левенштейна-Йенсена). Засеянные пробирки кладут в горизонтальном положении в терминальную комнату на 2-3 дня, затем на 3-4 день ставят в вертикальное положение. Посевы выдерживают в термостате.

Просмотры проводятся в течение 3 месяцев с интервалом 7-10 дней для выявления начального роста микобактерий. Рост микобактерий туберкулеза (МБТ) чаще наблюдается на 3-4 неделе. При отсутствии роста в течение 90 дней выдается отрицательный ответ (рост МБТ отрицательный). При наличии колоний МБТ отмечается срок выхода культур и интенсивность роста (указывается рост МБТ и количество колоний). Врач-фтизиатр, сопоставляя клиническую и рентгеновскую картину с полученными результатами, устанавливает диагноз туберкулеза.

Недостатками известного способа являются большой срок ожидания результатов диагностики (до 3 месяцев) и ошибки диагностики, обусловленные недостаточной высеваемостью и массивностью колоний микобактерий.

Задачей, решаемой в рамках настоящего изобретения, являлся поиск и создание условий, позволяющих ускорить рост микобактерий и повысить массивность колоний, что позволило бы сократить время анализа и повысить его надежность.

Было найдено, что скорость роста микобактерий резко возрастает, если засеянную культуру микроорганизмов обработать световым облучением при длине волны в диапазоне 0,6-1,0 мкм мощностью 25-250 Вт в течение 0,5-20 мин.

В качестве источника облучения используют гелий-неоновый или полупроводниковый инфракрасный лазеры, а также инфракрасные световые диоды, однако возможно применение иных источников облучения, излучающих световой поток в данной области при указанной мощности.

Оптимальный режим облучения подбирается индивидуально под конкретный источник облучения, т.к. отсутствует однозначная связь между скоростью роста и режимом облучения.

В настоящее время в литературе отсутствует информация о возможности стимуляции микобактерий красным и инфракрасным облучением. Напротив, было показано, что применение лазерного облучения в сопоставимых дозах ведет к торможению их роста (Малиев Б.М., Калюк А.Н. Действие гелий-неонового лазерного излучения на рост микобактерий туберкулеза. ЖМЭИ, 1991, 5, с.33-35; А.с. СССР 1835300, 1993, кл. А 61 N 5/06).

Способ реализовался следующим образом. Для опытов была использована суспензия 2-недельной культуры лабораторного штамма H₃₇RV. Суспензия приготавливалась из сухой навески живой культуры, которая методом серийных разведений на физиологическом растворе была приведена к двум рабочим разведениям: - 200 клеток в 0,2 мл (5-е разведение) и 20 клеток в 0,2 мл (6-е разведение).

Посев каждого разведения производился на 2 питательные среды (2 пробирки со средой Левенштейна-Йенсена и 2 пробирки со средой Финн-2).

После посева пробирки с плотной питательной средой и засеянной суспензией подвергались облучению (в лазерных установках - круглым пятном с диаметром, соответствующим диаметру пробирки; в светодиодной установке - излучением, рассеянным по площадке, перекрывающей ширину пробирки и имеющей вертикальный размер порядка 30 мм).

Параллельно для контроля производился на две среды посев без облучения - суспензия 5-го и 6-го разведении (всего 4 пробирки для контроля каждой установки).

Засеянные пробирки помещались в термостат при температуре 37^oС, причем еженедельно проводился замер количества полученных колоний.

Результаты экспериментов при различных режимах облучения приведены в таблице 1.

Практическая реализация способа осуществлялась с использованием аппарата "Митоз" на реальном патологическом материале.

Исследуемый материал (мокрота) заливали равным объемом 1% серной кислоты на 24 часа при комнатной температуре для подавления сопутствующей микрофлоры. На следующий день весь материал центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 минут. Надосадочную жидкость сливали, а полученный осадок разводили средой Школьниковой из расчета 1:1 и засевали в 4 пробирках с плотной питательной средой Левенштейна-Йенсена (2 пробирки) и Финн-2 (2 пробирки) по 2,0 мл в каждую.

Каждую засеянную пробирку подвергали облучению в аппарате "Митоз" в соответствии с вышеописанной методикой. Засеянные пробирки термостатировали при 37^oС (в первые 2-3 суток в горизонтальном состоянии, а затем - в вертикальном).

Просмотр проводился с интервалом в 7 суток для проросших пробирок и для выявления начального роста микобактерий. Было исследовало 11 проб патологического материала (мокроты) от больных активными формами туберкулеза легких (таблица 2). Параллельно производилась бактериологическая диагностика по стандартной методике без оптической биостимуляции на том же патологическом материале. Полученные результаты приведены в таблице 2.

Из результатов испытаний следует, что частота высеваемости микобактерий туберкулеза благодаря оптической биостимуляции увеличилась до 45,4% по сравнению с 27,3% в контрольном необлученном материале. Массивность роста в облученном материале до 3 раз выше, чем в контроле. Начальный рост колоний микобактерий наблюдался на 17 сутки вместо 26 в контроле.

Таким образом, проведенные испытания подтверждают возможность повышения эффективности бактериологической диагностики туберкулеза, что свидетельствует о корректности методик и технических решений, положенных в основу заявляемого способа.

Как показали эксперименты, использование заявляемого метода позволило в 5-7 раз повысить колониеобразующую способность микроорганизмов и сдвинуть начало роста микобактерий на 5-12 дней, что позволяет ставить диагноз в более ранние сроки. (Начало роста микобактерий в контроле 26 сут, при облучении гелий-неоновым лазером - 17 сут, при облучении светодиодами - 18 сут, при облучении полупроводниковым лазером с мощностью 85 мВт - 14 сут).

Способ прошел успешную проверку в баклабораториях противотуберкулезных учреждений С. Петербурга.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам диагностики туберкулеза с помощью микробиологических методов исследования, предназначен для использования в медицине и ветеринарии. Способ диагностики туберкулеза заключается в предварительном облучении перед культивированием засева в питательную среду бактерий световым излучением при длине волны 0,6-1,0 мкм, мощностью 25-250 мВт в течение 0,5-2,0 мин. Применение способа позволяет в 5-7 раз повысить колониеобразующую способность микобактерий, сократить время анализа в 2-3 раза. 2 табл.

Способ диагностики туберкулеза, включающий в себя отбор пробы для анализа, культивирование микроорганизмов на селективных питательных средах, определение количества проросших колоний и постановку диагноза, отличающийся тем, что перед культивированием пробу, содержащую засеянные на питательную среду бактерии, обрабатывают потоком светового облучения при длине волны 0,6-1,0 мкм в течение 0,5-2,0 мин при мощности потока 25-350 мВт.