СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-СУБКУЛЬТУР ШТАММА BRUCELLA ABORTUS И-206 Российский патент 2005 года по МПК C12N1/20 C12N1/20 C12R1/00 

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, в частности к микробиологии и иммунологии, и может быть использовано для получения L-субкультур В.abortus, обладающих высокой антигенной активностью и специфичностью и применяемых для приготовления антигена при получении диагностических сывороток, а также определения специфических антител против бруцелл в L-форме в сыворотках крови людей и животных.

Известно, что бруцеллы в L-форме обладают слабыми иммуногенными свойствами и вызывают образование специфических антител (AT), определяемых в сыворотках крови в реакции агглютинации (РА) в низких титрах, не превышающих 1:640, поэтому получение субкультур бруцелл в L-форме с целью приготовления антигена (АГ) для иммунизации при получении высокоактивных и высокоспецифичных сывороток является актуальной задачей.

Известен способ получения L-субкультур В.abortus с использованием питательных сред, где наиболее оптимальной основой питательной среды (печеночно-глюкозоглицериновая, среда Альбими и мясопептонная сывороточно-декстрозная) является печеночно-глюкозоглицериновая среда. Пользуясь этой средой как основой, испытаны 14 вариантов питательных сред, в состав которых дополнительно входили: агар-агар в концентрации 0,14-0,35%, сахароза в концентрациях 10, 15 и 20%, сернокислая магнезия 10, 15 и 20%, натрия хлорид 0,1, 0,6, 1,5 и 3,0%, нормальная лошадиная сыворотка 20%. В качестве трансформирующего агента использовали пенициллин в дозах 0,15, 62, 125, 250, 1000, 5000, 10000 ЕД/мл среды. Однако при исследовании полученных L-субкультур бруцелл со специфической антибруцеллезной сывороткой, меченной изоционатом флюоресцеина, отмечена неоднородность популяции культур, наличие стабильных (диффузное свечение) и нестабильных L-клеток, сохранивших элементы клеточной стенки (обусловливающих свечение) (Островская Н.Н., Вершилова П.А., Толмачева Т.А. // Журн. микробиол. - 1972. - №4. - С.108-112). Поэтому использование данных L-субкультур не позволяет приготовить высокоактивный и высокоспецифичный антиген для получения иммунных антисывороток.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения L-субкультур В.abortus 149, 318, включающий использование среды, содержащей в основе полужидкий триптический перевар бычьих сердец, 10-20% сахарозу, 0,05-5% сульфат магния, 0,01-1% натрия хлорид, 15-25% лошадиную сыворотку, 1% глицерин, 0,01-0,03% налидиксовую кислоту, а в качестве трансформирующего агента бициллин-3 от 50 до 20000 ЕД/мл и глицин от 0,1% до 3%. Однако полученные по данному способу L-субкультуры бруцелл отличаются сниженными, а иногда и полностью утраченными антигенными свойствами. Антисыворотка, полученная с помощью данных L-субкультур бруцелл, была недостаточно специфична, так как агглютинировала исходные бактериальные S-формы в разведении 1:320, а гомологичный L-антиген - 1:640, что свидетельствует о сохранении выраженных антигенных связей с исходным родительским штаммом (Базиков И.А. Л-трансформация бруцелл. / Эпидемиология, микробиология и иммунология бактериальных и вирусных инфекций. Тезисы докладов областной научной конференции молодых ученых, 17-20 октября 1989 г., Ростов-на-Дону, 1989, стр.5-8.) Кроме того, данный способ достаточно дорог.

Целью изобретения является получение L-субкультур бруцелл, обладающих высокой антигенностью и специфичностью, удешевление способа.

Поставленная цель достигается многократным пассированием штамма В.abortus И-206 в S-форме из коллекции живых культур Иркутского НИПЧИ, отличающегося высокой антигенной активностью и высокой резистентностью к антибиотикам пенициллинового ряда на среде, содержащей трансформирующий агент. Состав среды включает: печеночный настой, агар-агар, натрия хлорид, магния сульфат, сахарозу, глицерин, нормальную лошадиную сыворотку при следующем соотношении компонентов, мас.%:

агар-агар 1,2натрия хлорид 0,1магния сульфат 0,05сахароза 10глицерин 1,0нормальная лошадиная сыворотка 10печеночный настой остальное

Для получения L-субкультур, обладающих способностью при однократном введении животным вызывать у них выработку неполных антител исходный штамм В.abortus И-206 пятикратно пассируют на питательной среде, в которую добавляют бициллин-3 в нарастающих концентрациях: 10-50-100-1000-2000 ЕД/мл среды, а для получения L-субкультур, вызывающих при однократном введении животным выработку агглютининов, проводят двенадцатикратное пассирование на питательной среде с концентрациями бициллина-3: 10-50-100-1000-2000-3000-4000-5000-6000-7000-8000-9000 ЕД/мл среды.

Сопоставительный анализ с прототипом показал, что предлагаемое техническое решение отличается от известного тем, что для получения L-субкультур используют многократное пассирование штамма В.abortus И-206 на питательной среде, содержащей печеночный настой, агар-агар, натрия хлорид, магния сульфат, сахарозу, глицерин, нормальную лошадиную сыворотку, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

агар-агар 1,2натрия хлорид 0,1магния сульфат 0,05сахароза 10глицерин 1,0нормальная лошадиная сыворотка 10печеночный настой остальное

При многократном пассировании в питательную среду добавляют бициллин-3 в концентрациях: 10-50-100-1000-2000-3000-4000-5000-6000-7000-8000-9000 ЕД/мл среды.

Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критерию изобретения «новизна».

Проведенный анализ патентной и научно-технической литературы показал, что предлагаемый способ отличается не только от прототипа, но и других технических решений в данной и смежной областях. Так, авторами не найден способ получения L-субкультур штамма В.abortus И-206, включающий предлагаемые режимы. А именно данные режимы позволяют достичь поставленной цели - получить L-субкультуры штамма В.abortus И-206, обладающие высокой антигенной активностью и специфичностью, которые используют для приготовления АГ, который при введении кроликам вызывает выработку высокоактивных и высокоспецифичных AT, а при исследовании сывороток крови людей и животных выявляет AT против бруцелл в L-форме. Кроме того, данный способ более дешев, так как не требует специального оборудования и дорогостоящих реактивов и может быть осуществлен в обычных лабораторных условиях, а также в производстве иммунобиологических препаратов.

Таким образом, данный способ соответствует критериям «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».

Способ осуществляется следующим образом:

Берут штамм В.abortus И-206 и проводят L-трансформацию путем многократного пассирования на питательной среде, содержащей печеночный настой, агар-агар, натрия хлорид, магния сульфат, сахарозу, глицерин, нормальную лошадиную сыворотку, при следующем соотношении компонентов, мас.%: агар-агар - 1,2, натрия хлорид - 0,1, магния сульфат - 0,05, сахароза - 10, глицерин - 1,0, нормальная лошадиная сыворотка - 10, печеночный настой - остальное. Бициллин-3 добавляют в питательную среду при многократном пассировании в нарастающих концентрациях: 10-50-100-1000-2000-3000-4000-5000-6000-7000-8000-9000 ЕД/мл среды. Для получения L-субкультуры, обладающей способностью при однократном введении животным вызывать выработку неполных антител, штамм В.abortus И-206 пассируют на питательной среде до концентрации бициллина-3 2000 ЕД/мл (пятый пассаж). Для получения L-субкультуры, вызывающей при однократном введении животным выработку агглютининов, пассирование проводят на питательной среде до концентрации бициллина-3 9000 ЕД/мл среды (12-ый пассаж). Для получения бактериальной массы L-субкультуры 5 и 12 пассажей высевают на флаконы с питательной средой и соответствующим пассажу содержанием антибиотика. После выращивания бактериальную массу L-субкультур смывают физиологическим раствором рН 7,2-7,4, определяют концентрацию микробных клеток по отраслевому стандартному образцу мутности бактериальных взвесей (ОСО 42-28-59-85) в 10 ед. Для приготовления антигена бактериальную массу инактивируют добавлением 2,5% формалина и выдерживают в течение 24 часов. Полученный таким способом антиген контролируют на специфическую стерильность.

Изменения биологических свойств L-субкультур В.abortus И-206 5 и 12 пассажей по сравнению с исходной культурой и референтными штаммами бруцелл приведены в таблице 1. При фазово-контрастном микроскопировании в мазках L-субкультур бруцелл 5 и 12 пассажей наблюдается полиморфная морфологическая картина, включающая присутствие значительного количества шаровидных и нитевидных форм. Полученные L-субкультуры не теряют своих свойств в течение двух лет (срок наблюдения). Результаты ПЦР свидетельствуют о том, что исследуемые микроорганизмы в S- и L-формах относятся к роду бруцелл. В качестве праймеров используют олигонуклеотиды, ограничивающие фрагмент хромосомной ДНК бруцелл всех видов в 269 пар нуклеотидов. Последовательности праймеров: Bru 1 (5' - GCA GTC AGA CGT TGC СТА TT - 3'); Bru 2 (5' - GCT TCA GGT GTT CAG CCT Т - 3'). В качестве положительного контроля используют клеточную суспензию В.abortus И-206 (S-форма), в качестве отрицательного - дистиллированную воду. Программу амплификации: 94°С - 35 сек, 52°С - 35 сек, 72°С - 35 сек, из 40 циклов, осуществляют на многоканальном амплификаторе «МС-2» (ЗАО «ДНК технология». Москва). Для проверки антигенных свойств L-субкультур В.abortus И-206 5 и 12 пассажей используют экспериментальных животных (кролики породы шиншилла), которым внутривенно вводят по 1 мл суспензии живых клеток L-субкультур в дозе 10⁹ м.к. Через 7 суток животным проводят кровопускание и получают иммунные сыворотки. Об антигенной активности полученных L-субкультур судят по титру специфических AT в сыворотках крови зараженных животных, выявляемых в реакциях Кумбса (РК) и РА. Специфичность полученных антигенов из L-субкультур В.abortus И-206 5 и 12 пассажей проверяют в РА с различными сыворотками (таблица 2). Как видно из результатов, представленных в таблице 2, о высокой антигенной активности L-субкультур штамма В.abortus И-206 5 и 12 пассажей свидетельствует тот факт, что антисыворотка, полученная против L-субкультуры 5 пассажа, содержит неполные AT, которые дают положительный результат в РК с L-субкультурами 5 и 12 пассажей в титре 1:400. Эти же L-субкультуры не взаимодействуют в РА. Антисыворотка, полученная против L-субкультуры 12 пассажа, содержит агглютинины, которые положительно реагируют в РА с L-субкультурами 5 и 12 пассажей в титре 1:1600. О высокой специфичности полученных L-субкультур В.abortus И-206 свидетельствуют позитивные результаты в РК (1:400) и РА (1:1600) с гомологичными антисыворотками и отрицательные - в РА с сыворотками: экспериментальной против исходного штамма В.abortus И-206 в S-форме; коммерческими: туляремийной, холерной «О», холерной «Огава», иерсиниозными 0:9 и 0:3. При этом исходная S-культура В.abortus И-206 положительно реагировала в РА с сыворотками: экспериментальной против исходного штамма B.abortus И-206 в S-форме (1:3200); коммерческими: туляремийной, холерной «О», холерной «Огава» и иерсиниозной 0:3 (1:40), иерсиниозной 0:9 (1:1600) и не взаимодействовала с экспериментальными сыворотками против L-субкультур В.abortus И-206 5 и 12 пассажей.

Пример 1.

Берут штамм В.abortus И-206 в S-форме и получают L-субкультуру пятого пассажа путем многократного пассирования на питательной среде, содержащей печеночный настой, агар-агар, натрия хлорид, магния сульфат, сахарозу, глицерин, нормальную лошадиную сыворотку при следующем соотношении компонентов, мас.%: агар-агар - 1,2, натрия хлорид - 0,1, магния сульфат - 0,05, сахароза - 10, глицерин - 1,0, нормальная лошадиная сыворотка - 10, печеночный настой - остальное. Бициллин-3 добавляют в питательную среду в нарастающих концентрациях: 10-50-100-1000-2000 ЕД/мл среды. Для получения бактериальной массы L-субкультуры пятого пассажа осуществляют операции, как описано выше.

Пример 2.

Берут штамм В.abortus И-206 в S-форме и получают L-субкультуру 12 пассажа путем многократного пассирования на питательной среде, содержащей печеночный настой, агар-агар, натрия хлорид, магния сульфат, сахарозу, глицерин, нормальную лошадиную сыворотку при следующем соотношении компонентов, мас.%: агар-агар - 1,2, натрия хлорид - 0,1, магния сульфат - 0,05, сахароза - 10, глицерин - 1,0, нормальная лошадиная сыворотка - 10, печеночный настой - остальное. Бициллин-3 добавляют в питательную среду в нарастающих концентрациях: 10-50-100-1000-2000-3000-4000-5000-6000-7000-8000-9000 ЕД/мл среды. Для получения бактериальной массы L-субкультуры бруцелл 12 пассажа осуществляют операции, как описано выше.

Полученные по данному способу L-субкультуры 5 и 12 пассажей штамма В.abortus И-206 обладают высокой антигенной активностью, так как при однократном внутривенном введении кроликам вызывают образование специфических антител, выявляемых в сыворотках крови в РК в титрах 1:400 (5 пассаж) и в PA - 1:1600 (12 пассаж) и высокой специфичностью, о чем свидетельствуют отрицательные результаты в РА L-субкультур с сыворотками: экспериментальной против исходного штамма В.abortus И-206 в S-форме; коммерческими: туляремийной, холерной «О», холерной «Огава», иерсиниозными 0:9 и 0:3. Приготовленный по предлагаемому способу из L-субкультур инактивированный АГ технологичен, так как проведение иммунизации животных или постановка серологических реакций при выявлении специфических AT в сыворотках крови людей и животных не требует организации специальных мер по защите работающего персонала от заражения бруцеллезом. По сравнению с прототипом данный способ позволяет получить L-субкультуры бруцелл, обладающие более высокой антигенной активностью и специфичностью, введение которых животным вызывает образование специфических AT в более высоких титрах в РА 1:1600 и в РК 1:400, в прототипе в PA - 1:640, при этом антисыворотки, полученные против предлагаемых L-субкультур В.abortus И-206, не взаимодействуют в РА с исходным штаммом в S-форме, в прототипе - в титре 1:320. О высокой специфичности предлагаемых L-субкультур свидетельствуют отрицательные результаты РА с сыворотками, дающими перекрестные реакции с бруцеллами в S-форме, коммерческими: туляремийной, холерной «О», холерной «Огава», иерсиниозными 0:9 и 0:3. Антиген, приготовленный из L-субкультур В.abortus И-206 5 и 12 пассажей, используют для получения высокоактивной и высокоспецифичной диагностической сыворотки для детекции бруцелл в L-форме, а также для определения специфических AT к бруцеллам в L-форме в сыворотках крови людей и животных.

Кроме того, предлагаемый способ получения L-субкультур бруцелл по сравнению с прототипом более дешев.

Таблица 1
Биологические свойства бруцелл в S- и L-формахШтаммыЛизис фагом ТБДиссоциацияБактериостатаческие свойстваАгглютинабельностьПродукция сероводорода (мм)Уреазная активность (на среде Кристенсена)реакция с трипафлавиномреакция термопреципитациитионинфуксинсыворотка поливалентнаясыворотки моноспецифиче-ские1 сутки2 сутки3 сутки20 мин2 часа5 часов24 часа1:25 тыс.1:50 тыс.1:100 тыс.1:50 тыс.1:100 тыс.АMВ.m.16M---+++++1:1600-1:160333-Сл.Сл.+++В.а.544+-----++1:16001:40-Сл.Сл.2----В.suis 1330---+++--1:16001:40-655++++++++++В.а.И-206
S-форма+-----++1:16001:80-1Сл.Сл.--Сл.+++В.а.И-206
L-форма (5 пассаж)-+++++++*1:100-----++++++++++В.а.И-206
L-форма (12 пассаж)-+++++++*1:100------±+++++Примечание:
- результат взаимодействия не типичный (отсутствует зонтик, надосадочная жидкость мутная, образование тяжей)
В.а. - В.abortus
B.m. - В.melitensis
Сл. - следовые количества
А - антиабортус
М - антимелитензис

Таблица 2
Специфичность бруцеллезных S- и L-антигенов в реакциях агглютинации и КумбсаСывороткиАнтигеныВ.abortus И-206 в L-форме (5 пассаж)В.abortus И-206 в L-форме (12 пассаж)В.abortus И-206 в S-формеЭкспериментальная против В.abortus И-206 в S-формеОтр.*Отр.*1:3200*Экспериментальная против В.abortus И-206 в L-форме (5 пассаж)1:400**
Отр.*1:400**
Отр.*Отр.**
Отр.*Экспериментальная против В. abortus И-206 в L-форме (12 пассаж)1:1600*1:1600*Отр.*Коммерческая туляремийнаяОтр.*Отр.*1:40*Коммерческая холерная «О»Отр.*Отр.*1:40*Коммерческая холерная «Огава»Отр. *Отр.*1:40*Коммерческая иерсиниозная 0:9Отр.*Отр.*1:1600*Коммерческая иерсиниозная 0:3±*Отр.*1:40*Примечание:
* результат реакции агглютинации
** результат реакции Кумбса

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в иммунологии. Предложенное изобретение характеризует способ получения L-субкультур Brucella abortus И-206. Способ предусматривает пассирование бруцелл штамма Brucella abortus И-206 на питательной среде, содержащей печеночный настой, нормальную лошадиную сыворотку, агар-агар, натрия хлорид, сульфат магния, сахарозу, глицерин с добавлением в питательную среду бициллина-3 в нарастающих концентрациях, при следующем соотношении компонентов, мас.%: агар-агар - 1,2; натрия хлорид - 0,1; магния сульфат - 0,05; сахароза - 10; глицерин - 1,0; нормальная лошадиная сыворотка - 10; печеночный настой - остальное, где бициллин-3 добавляют в питательную среду в нарастающих концентрациях от 10 до 9000 ЕД/мл среды. Данный способ позволяет получить L-субкультуры бруцелл при конечной концентрации бициллина-3 2000 ЕД/мл среды, которые при однократном внутривенном введении кроликам вызывают выработку специфических неполных антител, выявляемых в реакции Кумбса в титре 1:400. При конечной концентрации бициллина-3 9000 Ед/мл среды получают L-субкультуры бруцелл, которые при однократном внутривенном введении кроликам вызывают выработку специфических агглютининов, выявляемых в реакции агглютинации в титре 1:1600. Изобретение может найти применение в иммунологии с целью получения высокоактивных и высокоспецифичных сывороток бруцелл L-форм. 2 табл.

Способ получения L-субкультур B.abortus, включающий пассирование бруцелл на питательной среде, содержащей натрия хлорид, сульфат магния, сахарозу, глицерин, нормальную лошадиную сыворотку и бициллин-3 в нарастающих концентрациях, отличающийся тем, что используют штамм B.abortus И-206, а питательная среда дополнительно содержит печеночный настой и агар-агар при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Агар-агар 1,2Натрия хлорид 0,1Магния сульфат 0,05Сахароза 10Глицерин 1,0Нормальная лошадиная сыворотка 10Печеночный настой Остальное

а бициллин-3 добавляют в питательную среду в нарастающих концентрациях от 10 до 9000 ЕД/мл среды.