СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛА ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНОГО МАРКЕРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛА ЧЕЛОВЕКА, МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МАРКЕР Российский патент 2005 года по МПК G01N33/48 C12N15/11 

Изобретение относится к области молекулярной биологии, криминалистики и генетическим исследованиям в медицине. Изобретение включает новые маркеры, способ их получения и использования для идентификации пола в биологических образцах человека, содержащих ДНК. В настоящее время в медико-генетическом консультировании широко используется цитогенетический метод определения пола или хромосомных аномалий (X/Y дисомии), связанных с болезнями человека. Данный метод требует культивирования клеток человека, является дорогостоящим и продолжительным по времени. Данный метод, как правило, невозможно использовать во многих случаях, когда клетки, пригодные для культивирования, недоступны, например в судебно-медицинских экспертизах.

В последнее время в области криминалистики и судебной медицине используется метод идентификации пола, основаный на проведении одномоментной амплификации копий амелогенинового гена на Х и Y- хромосомах. Гены на Х и Y- хромосомах имеют как участки абсолютной гомологии, так и участки, отличающиеся по длине за счет нуклеотидных делеций. Праймеры выбираются таким образом, что при полимеразной цепной реакции (ПЦР) используется одна пара праймеров на гомологичные области, а продукты амплификации на Х и Y- хромосомах отличаются по размеру, что позволяет проводить их разделение на агарозном или полиакриламидном гелях (Nakahori et al., 1991; Sullivan et al, 1993). При амплификации ДНК женщины на геле детектируется одна полоса, соответствующая ПЦР-продукту X-хромосомы, а при амплификации ДНК мужчины на геле детектируются 2 полосы, соответствующие ПЦР-продуктам на Х и Y- хромосомах, отличающимся по длине.

Несмотря на широкое распространение амелогениновых маркеров, обнаружен ряд их недостатков, затрудняющих или делающих невозможным их использование:

1) амелогениновый маркеры с фрагментами 106/112 п.н., 212/218 п.н. (Sullivan et al., 1993) обладают достаточной чувствительностью, но малая разница фрагментов (всего 6 п.н.) не позволяет проводить эффективное разделение ПЦР-продуктов в агарозных гелях, а использование акриламидных гелей требует больших материальных и временных затрат.

2) Известно использование в судебной медицине амелогенинового маркера 977/788 п.н. (Nakahori et al., 1991), который позволяет быстро и эффективно разделять ПЦР-продукты в агарозном геле (Перепечина, 1992). Но эффективность данного маркера для анализа деградированной ДНК ограничена в связи с большим размером ПЦР- продуктов и разницей между Х и Y- маркерами.

3) Показан ряд случаев ошибочного определения пола за счет мутаций или протяженных делеций в амелогениновом гене (Roffey et al., 2000; Steinlechner et al., 2002; Thangaraj et al., 2002; Chang et al., 2003).

Техническим результатом изобретения является создание маркеров, сочетающих высокую чувствительность, простоту применения и возможность одновременного детектирования геномных участков из разных аутосомных или Х-хромосомных локусов генов и участков Y-хромосомы.

Идеальной была бы детекция с помощью одной пары олигонуклеотидных праймеров одновременно Y-хромосомной ДНК и, отличающейся по длине ПЦР продукта Х- или аутосомной ДНК. Предлагается для использования новый набор маркеров, выбранных на гомологичные (паралогичные) участки генома, один из которых локализован на Y, а другой участок на любой другой хромосоме. ПЦР продукты, получаемые для двух геномных областей, отличаются по длине в результате инсерций, делеций или дупликаций в выбранном районе между олигонуклеотидными праймерами.

Способ получения молекулярного маркера включает следующие стадии:

(А) Выделяются участки ДНК из разных хромосом (Y и любой другой, отличной от Y) гомологичные, но 1) не подвергающиеся гомологичной рекомбинации и 2) отличающиеся по наличию небольших инсерций, делеций или дупликаций ("меж-хромосомный" полиморфизм гомологичных нерекомбинирующих участков); определяются наиболее специфические участки и синтезируются серии олигонуклеотидов, фланкирующих выбранные полиморфные участки; в серии ПЦР тестов определяется половая, популяционная и видовая стабильность маркеров; в серии ПЦР тестов и различных условий электрофореза с использованием последовательных разведении высокомолекулярной (свежие образцы крови) и деградированной (старые образцы крови) геномной ДНК человека, определяется наиболее эффективная комбинация условий для данного маркера (маркер: участок ДНК на Y-хромосоме и гомологичный участок на любой хромосоме, отличной от Y, при этом выбранные участки не должны подвергаться гомологичной рекомбинации и должны отличаться друг от друга наличием полиморфизма в виде инсерций, делеций или дупликаций, пары олигонулеотидных праймеров на эти участки, фланкирующие полиморфизмы, ПЦР продукты, соответствующие выбранным праймерам).

(Б) Так как различные факторы (деградация ДНК, малое количество ДНК, ингибиторы ПЦР, гетерогенность ДНК) могут влиять на эффективность ПЦР предложен следующий подход: 1) разница между ПЦР фрагментами минимальная, но достаточная для простой визуализации в условиях электрофореза; 2) применяется комбинация маркеров, детектирующих более высокомолекулярный ПЦР фрагмент для Y (первый тип маркера) или, наоборот, более высокомолекулярный ПЦР фрагмент Х/аутосомы (второй тип маркера).

(В) Для количественного определения материала Y-ДНК предложен подход с помощью ПЦР, когда сравнивается соотношение разделяющихся фрагментов (Y и Х-/аутосомы). Вариации в эффективности ПЦР для фрагментов Y и X-/аутосомы; или в числе геномных копий матрицы на одной хромосоме (например, n=5 для Y) больше другой (например, n=2 для аутосомы) для ряда маркеров используется для дополнительного подтверждения неравного соотношения мужского и женского генотипов (в случае геномных дупликаций, хромосомных дисомий или смешанных образцов, например присутствие смешанных образцов крови женщины и мужчины. Такое определение необходимо в случае гетерогенности материала (по полу), например, в криминалистике или определении хромосомной патологии (например, YYX, XXY). Данный метод оказался высокоэффективным и является альтернативным цитогенетическому методу для диагностики хромосомных патологий по полу (Пример 3, фиг.3).

(II) Следующие маркеры для идентификации пола, полученные вышеуказанным способом (маркер: участок ДНК на Y-хромосоме и гомологичный участок на любой хромосоме, отличной от Y, при этом выбранные участки не должны подвергаться гомологичной рекомбинации и должны отличаться друг от друга наличием полиморфизма в виде инсерции, делеций или дупликаций, пары олигонулеотидных праймеров на эти участки, фланкирующие полиморфизмы, ПЦР продукты, соответствующие выбранным праймерам):

I) AEM-1, включающий:

1) Участки маркера AEM-1:

А) 1-хромосома: SEQ NО1 (NT_004671.15, 13754734 - 13756758), длина 2025 п.н.

Участок содержит фрагмент гена протеин-фосфатазы 1, регуляторной (ингибиторной) субъединицы 12 В [protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 12B].

Б) Y-хромосома: SEQ NО2 (NT_011903.10, 4604445-4606444, комплементарная последовательность), длина 2000 п.н.

Участок содержит фрагмент гена (псевдогена), сходного с геном протеин-фосфатазы 1, регуляторной (ингибиторной) субъединицы 12B [similar to protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 12B].

2) Любые пары олигонулеотидных праймеров на участки маркера АЕМ-1, фланкирующие полиморфизмы, ПЦР продукты, соответствующие выбранным праймерам. Например,

Праймеры: АЕМ-1 dir - tcagaggaggaggaaggtga; AEM-1rev - gcctggctagctctctgaca ПЦР-продукты - хромосома 1-139 п.н.; хромосома Y - 118 п.н.

II) FEM-2, включающий:

1) Участки маркера FEM-2:

А) Х-хромосома: SEQ NО3 (NT_011757.13, 20163258 - 20165257), длина 2000 п.н.

Участок содержит фрагмент гена ZFX.

Б) Y-хромосома: SEQ NО4 (NT_011896.8, 178982-180981), длина 2000 п.н.

Участок содержит фрагмент гена ZFY.

2) Любые пары олигонулеотидных праймеров на участки маркера FEM-2, фланкирующие полиморфизмы, ПЦР продукты, соответствующие выбранным праймерам.

Например,

Праймеры: FEM-2dir - cctcaatgtctatgccagaac; FEM-2rev - ggcacagtctgctaccaatactt ПЦР-продукты - хромосома Х - 185 п.н.; хромосома У - 167 п.н.

III) MEF-3, включающий:

1) Участки маркера MEF-3:

А) Х-хромосома: SEQ NО5 (NT_011757.13, 20190386-20193255), длина 2870 п.н.

Участок содержит фрагмент гена ZFX.

Б) Y-хромосома: SEQ NО6 (NT_011896.8, 192019 - 194878), длина 2860 п.н.

Участок содержит фрагмент гена ZFY.

2) Любые пары олигонулеотидных праймеров на участки маркера MEF-3, фланкирующие полиморфизмы, ПЦР продукты, соответствующие выбранным праймерам.

Например,

Праймеры: MEF-3dir - agctgaccctggagaagatg; MEF-3rev - tctccacaatgtctacagttcca ПЦР-продукты - хромосома X - 286 п.н.; хромосома Y - 316 п.н.

IV) FEM-4, включающий:

1) Участки маркера FEM-4:

А) Х-хромосома: SEQ NО7 (NT_025302.12, 884797-886836, комплементарная последовательность), длина 2040 п.н.

Б) Y-хромосома: SEQ NО8 (NT_011875.10, 352994-354993), длина 2000 п.н.

2) Любые пары олигонулеотидных праймеров на участки маркера FEM-4, фланкирующие полиморфизмы, ПЦР продукты, соответствующие выбранным праймерам.

Например,

Праймеры: FEM-4dir - ggaaggtcaggcagaacaag; FEM-4rev - atcaacactgtacac(c/t)gcaaca ПЦР-продукты - хромосома X - 296 п.н.; хромосома Y - 258 п.н.

V) АЕМ-5 включающий:

1) Участки маркера АЕМ-5:

A) 3 хромосома: SEQ NO9 (NT_005612.14, 53068924-53071223, комплементарная последовательность), длина 2300 п.н.

Б) Y-хромосома (1): SEQ NO10 (NT_011903.10, 930060-932059, комплементарная последовательность), длина 2000 п.н.

B) Y-хромосома (2): SEQ NO11 (NT_011896.8, 4873046-4875045), длина 2000 п.н.

Г) Y-хромосома (3): SEQ NO12 (NT_011896.8, 5445202-5447201), длина 2000 п.н.

Д) Y-хромосома (4): SEQ NO13 (NT_011875.10, 9543184-9545183), длина 2000 п.н.

Е) Y-хромосома (5): SEQ NO14 (NT_011878.8, 780721-782720, комплементарная последовательность), длина 2000 п.н.

2) Любые пары олигонулеотидных праймеров на участки маркера АЕМ-5, фланкирующие полиморфизмы, ПЦР продукты, соответствующие выбранным праймерам.

Например,

Праймеры: AEM-5dir - agccaa(a/g)gacagaggtctca; AEM-5rev Cagaaggcagagtagaggaaagc ПЦР-продукты - хромосома X - 653 п.н.; хромосома Y - 350, 350, 360,351,373

Выбранные для примеров олигонуклеотиды и ПЦР-продукты маркеров обладают следующими особенностями:

I) ПЦР-продукты маркеров АЕМ-1, FEM-2, MEF-3, FEM-4 обладают небольшими размерами, что увеличивает чувствительность маркеров. Чувствительность маркера АЕМ-5 значительно повышена за счет амплификации сразу нескольких копий генов на хромосомах 3/Y (двух - суммарно на парной хромосоме 3 и пяти - на хромосоме Y).

II) ПЦР-продукты всех маркеров имеют достаточно большую разницу по длине (18-300 п.н.), что позволяет эффективно разделять Y- и Х-/аутосомо-специфичные фрагменты в 2-3% агарозных гелях (фиг.1.,2.).

III) ПЦР-продукты маркеров FEM-2, MEF-3, FEM-4 отличаются тем, что одновременно амплифицируются участки на Х и Y-хромосомах, отличные от амелогенинового гена. Длина фрагментов на Y-хромосоме короче, чем на X-хромосоме для ПЦР-продуктов маркеров FEM-2, FEM-4 и длиннее, чем на X-хромосоме для ПЦР-продукта маркера MEF-3.

IV) ПЦР-продукты маркеров АЕМ-1 и АЕМ-5 отличаются тем, что содержат участки, отличные от амелогенинового гена одновременно на аутосомах (1 или 3 хромосоме соответственно) и Y- хромосоме, что позволяет уменьшить вероятность ошибки идентификации из-за возможных мутаций, делеций или хромосомных перестроек.

Изобретение включает использование маркеров АЕМ-1, FEM-2, MEF-3, FEM-4, АЕМ-5 для идентификации пола в биологических образцах, содержащих ДНК (кровь, слюна, волосы, кожа, сперма и любые другие), как с помощью единичного маркера (с использованием одно-маркерной ПЦР), так и в комбинациях маркеров АЕМ-1, FEM-2, MEF-3, FEM-4, АЕМ-5 между собой или с другими маркерами (с использованием мультиплекс ПЦР).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1.

Использование индивидуальных маркеров АЕМ-1, FEM-2, MEF-3, FEM-4, АЕМ-5 для диагностики пола.

ДНК из лейкоцитов периферической венозной крови выделяли фенолхлороформным методом (Маниатис и др., 1984).

Для проведения ПЦР использовали следующие праймеры:

Название маркераНазвание праймераПоследовательность праймераПЦР-продукты (П.Н.) Х(Аутосома)/YРазница в длине ПЦР-продуктовЧисло копий Х(Аутосома)/Y в диплоидном наборе хромосом 1)мужчины 2)женщиныАЕМ-1AEM-ldirtcagaggaggaggaaggtga139/118211)2/1 AEM-lrevgcctggctagctctctgaca  2)2/0FEM-2FEM-2dircctcaatgtctatgccagaac185/167181)1/1 FEM-2revggcacagtctgctaccaatactt  2)2/0MEF-3MEF-3diragctgaccctggagaagatg286/316301)1/1 MEF-3revtctccacaatgtctacagttcca  2)2/0FEM-4FEM-4dirggaaggtcaggcagaacaag296/258381)1/1 FEM-4revatcaacactgtacac(c/t)gcaaca  2)2/0АЕМ-5AEM-5diragccaa(a/g)gacagaggtctca653/350,350,303,303,
 
293,302,2801)2/5 AEM-5revcagaaggcagagtagaggaaagc360,351,3732)2/0

Электрофорез проводили в мини-камерах в 2-3%-м агарозном геле, содержащем бромистый этидий в концентрации 0,5 мкг/мл при 200 В/50 Вт в течение 15-20 мин (для маркера АЕМ-5) или 40 мин (для остальных маркеров), с последующим анализом полос ДНК в ультрафиолетовом свете.

Для идентификации использовали более 100 образцов ДНК, с заведомо известной половой принадлежностью. Во всех случаях полученные фрагменты ДНК соответствовали ожидаемым, т.е. содержали единичный, Х-специфичный или аутосомо-специфичный фрагменты при амплификации женской ДНК и сочетание двух, Х-/аутосомо- и Y-специфичных фрагментов при исследовании мужской ДНК. Каких-либо артефактов или ошибочных идентификаций не наблюдалось. Фиг.1.(А-Г) иллюстрирует результаты идентификации пола с помощью выбранных маркеров.

Пример 2.

Использование различных комбинаций маркеров АЕМ-1+FEM-2 и FEM-4+АЕМ-5 для диагностики пола.

Предложенные маркеры, для уменьшения вероятности ошибки за счет редких мутаций, делеций или хромосомных перестроек, могут быть использованы в комбинации друг с другом или с другими маркерами (мультиплекс ПНР).

Сочетание различных праймеров при амплификации проводили, учитывая диапазоны длины маркеров, в условиях, описанных выше. В первом случае комбинировали праймеры на маркеры АЕМ-1+FEM-2. Длины фрагментов 118, 139, 167, 185 п.н. детектировались для мужчин и 139, 185 для женщин (фиг.2. А,Б).

Во втором случае комбинировали праймеры на маркеры FEM-4+АЕМ-5. Длины фрагментов 258, 296, около 350, 653 п.н. детектировались для мужчин и 296, 653 для женщин. Во всех случаях полученные фрагменты ДНК соответствовали ожидаемым, каких-либо артефактов или ошибочных идентификаций не наблюдалось (фиг.2. В).

Пример 3.

Использование маркеров FEM-4, MEF-3 и FEM-2 для диагностики хромосомных патологий по полу.

Маркеры FEM-4, MEF-3 и FEM-2 были использованы для подтверждения неравного сотношения мужского и женского генотипов в образцах ДНК от индивидов, обладающих хромосомными патологиями - XYY (синдромом дубль-Y) и XXY (синдромом Клайнфельтера) (фиг.3. А). Маркеры FEM-4, MEF-3 и FEM-2 содержат по одной копии ПЦР-фрагментов на хромосомах Х и Y. По соотношению интенсивности Х и Y полос в контрольной ДНК (здоровый индивид) и ДНК из образцов пациентов, обладающих хромосомными патологиями, можно сделать вывод о наличии дупликаций по Х (XXY) или Y(XYY)-хромосомам (фиг.3.А, Б).

Таким образом, примеры показывают, что предложенные нами альтернативные маркеры удобны и просты в использовании, обладают достаточной эффективностью и могут быть использованы в пренатальной диагностике, медико-генетическом консультировании и судебно-медицинской экспертизе для проведения экспресс-тестов по определению пола и выявления хромосомных аномалий по полу. При проведении тестов (более 100 для каждого из маркеров) каких-либо артефактов или ошибочных идентификаций не наблюдалось. Кроме того, предложенные маркеры для уменьшения вероятности ошибки за счет редких мутаций, делеций или хромосомных перестроек могут быть использованы в комбинации друг с другом или с другими маркерами (мультиплекс ПЦР).

Список литературы:

1) Sullivan K.M., Mannucci A., Kimpton C.P., Gill P. (1993) A rapid and quantitative DNA sex test: fluorescence-based PCR analysis of X-Y homologous gene amelogenine. Bio Techniques, 15, 4, 636-641.

2) Nakahori Y, Hamano К, Iwaya M, Nakagome Y. Sex identification by polymerase chain reaction using X-Y homologous primer. Am J Med Genet. 1991 Jun 15;39(4):472-3.

3) Перепечина И.О. Новый метод установления половой принадлежности объектов биологического происхождения. // Экспертная практика, 1992. - №33. - С.35-38.

4) Roffey P.E., EckhoffC.I, Kuhl J.L. A rare mutation in the amelogenin gene and its potential investigative ramifications // J. For. Sci., 2000. - V.45. - N.5. - P.1016-1019.

5) Steinlechner M, Berger B, Niederstatter H, Parson W. Rare failures in the amelogenin sex test. Int J Legal Med. 2002 Apr;l 16(2):117-20.

6) Thangaraj К, Reddy AG, Singh L. Is the amelogenin gene reliable for gender identification in forensic casework and prenatal diagnosis? Int J Legal Med. 2002 Apr;l 16(2):121-3.

7) Chang YM, Burgoyne LA, Both K. Higher failures of amelogenin sex test in an Indian population group.J Forensic Sci. 2003 Nov;48(6):1309-13.

8) Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. //M.: Мир, 1984.

Табл.1.Последовательности маркеровНазвание маркераПоследовательности маркераАЕМ-1SEQ NO1
SEQ NO2FEM-2SEQ NO3
SEQ NO4MEF-3SEQ NO5
SEQ NO6FEM-4SEQ NO7
SEQ NO8АЕМ-5SEQ NO9
SEQ NO 10
SEQ NO 11
SEQ NO 12
SEQ NO 13
SEQ NO 14

Изобретение относится к области молекулярной биологии, криминалистики и генетическим исследованиям в медицине. Изобретение включает новые маркеры, способ их получения и использования для идентификации пола в биологических образцах человека, содержащих ДНК. Изобретение позволяет более точно и с высокой чувствительностью определить хромосомные аномалии по полу. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 3 ил.

1. Способ получения молекулярного маркера для определения пола человека, характеризующийся тем, что определяют участок ДНК на Y-хромосоме и гомологичный участок на любой хромосоме, отличной от Y, при этом выбранные участки не должны подвергаться гомологичной рекомбинации и должны отличаться друг от друга наличием полиморфизма в виде инсерций, делеций или дупликаций; далее синтезируют праймеры - олигонуклеотиды, обладающие наибольшей специфичностью к выбранным участкам ДНК и фланкирующие полиморфизмы выбранных участков для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР); при этом выбранные гомологичные участки указанных хромосом, олигонулеотидные праймеры на эти участки, фланкирующие полиморфизмы, ПЦР продукты, соответствующие выбранным праймерам, представляют собой молекулярный маркер.2. Молекулярный маркер, полученный способом по п.1 и содержащий не менее чем две последовательности нуклеотидов, выбранные из группы SEQ NO 1-SEQ NO 14, представленные в Табл.1.3. Способ определения пола человека, включающий генетическое исследование биологического образца, содержащего ДНК, с использованием ПЦР и последующего проведения электрофоретического разделения, отличающийся тем, что используют молекулярные маркеры по п.2, электрофорез проводят в агарозном или полиакриламидном геле и по выявлению единичного ПНР-продукта, специфичного для любой хромосомы, отличной от Y, определяют женский пол, а по наличию двух или более ПЦР-продуктов, разделяющихся в геле, один из которых специфичен для любой хромосомы, отличной от Y, а другой/другие специфичен для Y-хромосомы - определяют мужской пол, а при обнаружении различий в соотношении интенсивностей полос ПЦР-продуктов по сравнению с образцами, характеризующими норму, в случае увеличения интенсивности ПЦР-продукта Х-хромосомы/аутосомы к ПЦР-продукту (продуктам) Y-хромосомы/аутосомы определяют наличие геномных дупликаций или удвоений Х-хромосомы/аутосомы, что является аномалией по Х-хромосоме/аутосоме мужского пола, а по увеличению интенсивности ПЦР-продукта Y-хромосомы к ПЦР-продукту (продуктам) Х-хромосомы/аутосомы определяют наличие геномных дупликаций или удвоений Y-хромосомы, что является аномалией по Y-хромосоме мужского пола.4. Способ по п.3, отличающийся тем, что используют смесь маркеров по п.2 в любой комбинации.