СРЕДСТВО ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА C Российский патент 2005 года по МПК A61K35/78 A61P31/12 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области медицины, а более конкретно относится к изысканию новых эффективных средств профилактики вирусного гепатита С.

Уровень техники

Вирусные гепатиты относятся к категории наиболее опасных и распространенных инфекционных заболеваний. Ежегодно в мире от патологий, связанных с этой болезнью, умирают около 2 миллионов человек.

Причиной возникновения вирусных гепатитов являются, по крайней мере, 5 различных вирусов - энтеральные вирусы А и Е и парентеральные (В, С, Д).

Вирус гепатита С является самым "молодым", он был открыт лишь в 1989 году. С его открытием началось интенсивное изучение этой разновидности гепатита, являющейся основной причиной развития хронических диффузных заболеваний печени и гепатоклеточной карциномы.

Отличительной особенностью вируса гепатита С является способность к длительному персистированию в организме, что обуславливает высокий уровень хронизации инфекции (50-80% случаев). Устойчивость вируса обусловлена его способностью реплицироваться с высоким уровнем "мутации", в результате чего возникает несколько иммунологически различающихся вариантов, благодаря которым вирус избегает иммунного надзора. Образующиеся вируснейтрализирующие антитела являются высокоспецифичными и не способны нейтрализовать вновь появляющиеся варианты вируса.

Крайне высокий уровень заболеваемости вирусным гепатитом и, в частности, гепатитом С обуславливает актуальную задачу изыскания и создания эффективных средств лечения и профилактики этой инфекции.

Сущность изобретения

Ранее авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что экстракт бересты (белой части коры березы) обладает in vivo антивирусной активностью по отношению к вирусу гепатита С и может быть применен для лечения этого заболевания.

Дальнейшие исследования препарата экстракта бересты показали, что он обладает не только терапевтическим, но и профилактическим эффектом в отношении вирусного гепатита С, что и составляет сущность настоящего изобретения.

Первым аспектом настоящего изобретения является применение экстракта бересты с содержанием бетулина более 70% для профилактики вирусного гепатита С.

Вторым аспектом изобретения является применение экстракта бересты с содержанием бетулина более 70% для приготовления препаратов для профилактики гепатита С.

Осуществление изобретения

Далее описаны результаты исследований по изучению профилактической активности экстракта бересты в отношении инфекции, вызванной вирусом гепатита С у мышей.

Материалы

Экстракт бересты. Исследования проводились с экстрактом бересты, полученным от OOO «Березовый мир», Россия, Москва, производящего его для изготовления биологически активных пищевых добавок и косметических средств. Экстракт поставляется в сухом виде. Основной компонент экстракта - бетулин, содержание которого в экстракте составляет более 70 вес.% Однако поскольку исследования проводились не с чистым бетулином, а с экстрактом, содержащим целый комплекс веществ, у авторов изобретения нет оснований утверждать, что именно и только бетулин является действующим началом в отношении вируса гепатита С.

Вирус. В работе использовали цитопатогенный вариант вируса гепатита С (ВГС), выделенный из сыворотки крови хронически инфицированной ВГС больной. По данным генотипирования, изолированный вариант ВГС относится к наиболее распространенному в России генотипу 1b ВГС. В исследованиях использовали инфекционные дозы ВГС, равные 10,0 ТЦД 50.

Животные. Для изучения противовирусной активности экстракта бересты использовали белых беспородных половозрелых мышей массой 18-20 г.

Методы.

Экстракт бересты на физиологическом растворе, содержащем 1% Твин 80, в дозах 50 мг, 100 мг и 150 мг на 1 кг веса вводили разным группам мышей перорально в течение 4 дней. Через 2 дня после 4-го введения мышей заражали внутрибрюшинно ВГС. Три группы мышей служили в качестве контрольных: группа животных, инфицированных вутрибрюшинно ВГС, но не получавших препарат, группа незараженных животных и группа незараженных животных, которым препарат в дозе 150 мг на 1 кг веса вводили в течение 4-х дней. Через неделю после заражения животных вскрывали, извлекали печень, головной мозг, забирали кровь. Пробы сывороток крови, надосадочную жидкость, полученную после центрифугирования при 3000 об/мин в течение 15 мин гомогенатов ткани печени и головного мозга использовали для определения антигенов ВГС и инфекционной активности вируса гепатита С. С этой целью вируссодержащие пробы титровали в культурах клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ), которые выращивали на среде 199 с добавлением 10% сыворотки эмбриона телят и 100 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина.

Антиген ВГС в данных пробах изучали в реакции гемагглютинации, используя классический метод, описанный Clarke и Casals (1968 г.).

Культуры клеток. Были использованы высокочувствительные к цитопатогенному действию ВГС культуры перевиваемых клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ), полученные из фирмы «Нарвак», Москва. Их использовали в виде однодневного монослря клеток, выращенного в 24-луночных пластиковых панелях. Культуры клеток СПЭВ выращивали на среде 199 с 10% сыворотки эмбриона телят с добавлением глютамина и антибиотиков (100 ЕД/мл).

Инфекционную активность ВГС, содержащегося в пробах органов и тканей инфицированных мышей, учитывали по результатам титрования, как правило, на 6-7 дни инфекции, когда развивалось максимальное цитопатогенное действие вируса, используя формулу Рида и Менча для подсчета титра вируса гепатита С.

Результаты

Данные исследования представлены в таблицах 1а, б, в. Профилактическое применение экстракта бересты, как правило, приводит к снижению показателей инфекции, вызванных ВГС в организме ВГС инфицированных мышей. В частности, исследование проб сывороток крови животных (Таблица 1а) дало возможность сделать следующее заключение:

1) Профилактическое применение экстракта в дозе 50 мг на 1 кг веса приводит к существенному (18-кратному) снижению гемагглютинирующей активности вируса, а инфекционные титры ВГС в сыворотке крови животных в среднем снижались на 2,4 lg.

2) Профилактическое применение препарата в дозе 100 мг на 1 кг веса животных приводило к 13-кратному снижению содержания антигенов ВГС в крови, инфекционные титры ВГС снижались при этом почти в 100 раз.

3) В случае использования дозы препарата, равной 150 мг на 1 кг веса, снижение показателей инфекции ВГС у животных было незначительным (по сравнению с контрольной группой мышей снижение менее чем в 10 раз). Следует отметить, что наблюдение за группой мышей получавших только экстракт в дозе 150 мг на 1 кг веса, в течение 10 дней, показало, что внешний вид и поведение животных не отличались от контрольной группы неинфицированных мышей, что свидетельствовало о том, что препарат, вводимый мышам в высоких дозах, не обладает токсическими свойствами..

Аналогичные данные были получены и при анализе ткани печени, взятой от разных групп животных (таблица 1б). Обнаружено снижение антигенной активности ВГС в печени мышей, получавших профилактическую дозу препарата в дозе 50 и 100 мг на 1 кг веса. Отличия в группе животных, получавших ежедневно 150 мг на 1 кг веса, от контрольной группы ВГС инфицированных животных были несущественны. Не было получено серьезных различий в этой группе животных и по инфекционной активности ВГС в печени. Однако в группе мышей, получавших препарат дозах 50 и 100 мг на 1 кг веса, инфекционные титры вируса в среднем снижались на 1,6 и 0,9 lg.

Изучение тканей головного мозга ВГС инфицированных мышей (Таблица 1в) позволило получить данные, свидетельствующие о том, что профилактическое применение экстракта бересты в дозе 50 мг на 1 кг веса приводило почти к 100-кратному снижению инфекционной активности ВГС и к 4-кратному снижению титра антигенов ВГС. Несколько в меньшей степени препарат действовал, когда ежедневная доза его составляла 100 мг на 1 кг веса. В то же время профилактический эффект отсутствовал при применении препарата в дозе 150 мг на 1 кг веса.

Таблица 1
а) Показатели инфекции ВГС, обнаруженные в сыворотках крови животныхГруппы мышей, получавших экстракт в дозе (мг в 50 мкл/кг веса)Показатели ВГС инфекции в сыворотке кровиРГАLg ТЦД₅₀/20 мкл501:6,44,0±0,21001:84,5±0,11501:585,5±0,1Без препарата1:1096,4±0,2Незараженные мыши00

б) Показатели инфекции ВГС, обнаруженные в печени животныхГруппы мышей, получавших экстракт в дозе (мг в 50 мкл/кг веса)Показатели ВГС инфекции в печеночной тканиРГАLg ТЦД₅₀/20 мкл501:2203,0±0,31001:4503,7±0,31501:6004,5±0,3Без препарата1:8504,6±0,бНезараженные мыши1:500

в) Показатели инфекции ВГС, обнаруженные в головном мозге животныхГруппы мышей, получавших экстракт в дозе (мг в 50 мкл/кг веса)Показатели ВГС инфекции в тканях головного мозгаРГАLg ТЦД₅₀/20 мкл501:1204,2±0,11001:2804,8±01501:4207,2±0,1Без препарата1:4806,15±0,5Незараженные мыши1:500

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и применяется для профилактики вирусного гепатита С. Применение экстракта бересты с содержанием в нем бетулина более 70% для профилактики вирусного гепатита С. Применение экстракта бересты с содержанием в нем бетулина более 70% для изготовления препарата для профилактики вирусного гепатита С. Экстракт бересты с содержанием в нем бетулина более 70% способствует эффективной профилактике вирусного гепатита С. 2 н.п. ф-лы, 1 табл.

1. Применение экстракта бересты с содержанием в нем бетулина более 70% для профилактики вирусного гепатита С.2. Применение экстракта бересты с содержанием в нем бетулина более 70% для изготовления препарата для профилактики вирусного гепатита С.