СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ МАКРОФАГОВ Российский патент 2005 года по МПК C12N5/00 C12N5/08 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии и патологической физиологии, и может быть использована в клинической практике как метод стимулирующего воздействия на биологические процессы, протекающие в клетках и тканях.

Известен способ стимуляции фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов мышей in vitro высокой внешней температурой (40°С), действующей на перитонеальные макрофаги мышей в течение 3^х часов (Yoshioka M., Koga S., Maeta M. et al. Jpn. J.Surg. 1990, Vol.20, №1, P.119-122).

Сущность способа стимуляции фагоцитарной активности макрофагов заключается в том, что перитонеальные макрофаги помещают в среду 199 и подвергают воздействию гелиевой плазмы, полученной при силе тока 30А, напряжении 20В и расходе газа 2 л/мин, воздействие осуществляют 30 секунд с расстояния 20 см от сопла плазмотрона.

Такие параметры и являются оптимальными. Другие параметры расхода газа, силы тока и напряжения, а также расстояние от сопла плазмотрона до объекта либо не изменяло фагоцитарной активности макрофагов, либо оказывало подавляющее действие.

Способ осуществляется следующим образом. В качестве источника макрофагов используют перитонеальный экссудат мышей-гибридов первого поколения (СВА×С57В1/6) F₁, полученных из питомника АМН "Столбовая". Мышей забивают цервикальной дислокацией позвоночника, освобождают доступ к брюшной стенке, срезая на ней участок кожного покрова. В брюшную полость вводят охлажденную среду 199 в объеме 2-2,5 мл. Тщательно массируют в течение 1 мин, затем отсасывают содержимое брюшной полости пастеровской пипеткой. Экссудат наносят в пластиковые чашки Петри однократного пользования диаметром 5 см. Чашки помещают на 1 час в термостат при температуре 37°С с 5% содержанием СО₂. После инкубации экссудата пятикратно смывают неприлипшие клетки 0,9% раствором NaCl. После этого в чашки вносят по 1 мл среды 199 и аккуратно снимают монослой прилипающих клеток (макрофагов) при помощи «poliesman» (стеклянная палочка с резиновым наконечником). Суспензию макрофагов переносят в центрифужные пробирки и ставят на лед. Количество живых и мертвых клеток определяют в камере Горяева в смеси 0,1% раствора трипанового синего, с использованием светового микроскопа МБИ-3. Количество погибших клеток не превышает 8-10%.

В опытах используют плазменную установку СУПР-М и физиотерапевтический плазмотрон. 1×10⁶ исследуемых клеток в объеме 1 мл среды 199 вносят в пластиковые чашки Петри однократного пользования диаметром 5 см. Облучение макрофагов проводят гелиевой плазмой при силе тока 30 А, напряжении 20 В с расстояния 20 см от сопла плазмотрона. Расход гелия составляет 2 л/мин. Макрофаги подвергают воздействию плазменного потока в течение 30 секунд. Все манипуляции проводят на льду для исключения теплового эффекта.

Фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов определяли по способности поглощать и переваривать бактерии Staph. aureus, штамм №209, в концентрации 2 млн/мл. К 1 мл клеточной суспензии с концентрацией макрофагов млн/мл добавляют 1 мл раствора бактерий, ресуспензируют и разливают содержимое на 2 пробирки. Суспензию одной пробирки используют для определения поглотительной способности макрофагов, второй - для определения завершенности фагоцитарного процесса. Пробирки закрывают и помещают в термостат при температуре 37°С. Для определения поглотительной способности макрофагов пробирки инкубируют 30 мин, переваривательной - 90 мин. Через 30 мин инкубации из суспензии первой пробирки приготавливают микропрепараты. На предметное стекло наносят мазок суспензии клеток, мазки высушивают на воздухе, фиксируют метиловым спиртом 10 секунд и окрашивают по Романовскому-Гимзе в течение 8 мин. Те же манипуляции проводят с суспензией, которую инкубируют 90 мин. Используя бинокулярный микроскоп «Биолам» с увеличением на х40, подсчитывают 100 макрофагальных клеток и рассчитывают следующие показатели:

фагоцитарное число (ФЧ) -% клеток, участвующих в фагоцитозе;

фагоцитарный индекс (ФИ) - число бактерий, поглощенных одним макрофагом; индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ), который учитывали по убыли внутриклеточных бактерий и выражали в процентах:

N - число поглощенных бактерий на 100 макрофагов;

N⁰⁰ - число непереваренных бактерий на 100 макрофагов.

Для статистической обработки полученных результатов применяли параметрический метод определения достоверности с вычислением t -критерия Стьюдента.

Пример 1.

В опыт были взяты 6 самцов (CBA×C57Bl/6)F₁. Мыши забиты путем цервикальной дислокации.

Извлекали перитонеальный экссудат и наносили в пластиковые чашки. После инкубации экссудата смывали неприлипшие клетки 0,9% раствором NaCl. После этого средой 199 в объеме 1 мл снимали монослой прилипающих клеток (макрофагов). Суспензию макрофагов переносили в центрифужные пробирки и ставили на лед. Жизнеспособность макрофагов определяли в камере Горяева в 0,1% растворе трипанового синего. 1х10⁶ макрофагальных клеток в объеме 1 мл среды 199 вносили в пластиковые чашки Петри диаметром 5 см. Макрофаги подвергали воздействию гелиевой плазмы, полученной при силе тока 30 А, напряжении 20 В и расходе газа 2 л/мин. Облучение клеток проводили в течение 30 секунд с расстояния 20 см от сопла плазмотрона. Контролем явились макрофаги, не подвергавшиеся воздействию гелиевой плазмы. Все манипуляции проводили на льду для исключения теплового эффекта. К 1 мл клеточной суспензии опытных и контрольных проб с концентрацией макрофагов млн/мл добавляли 1 мл раствора бактерий Staph. aureus, штамм №209, в концентрации 2 млн/мл. Содержимое пробирки ресуспензировали и разливали на 2 пробирки. Суспензию одной пробирки для определения поглотительной способности инкубировали 30 минут, второй 90 минут для определения переваривательной способности макрофагов. После инкубации из суспензии макрофагов готовили микропрепараты, используя окраску по Романовскому-Гимзе. Под микроскопом подсчитывали 100 макрофагов и рассчитывали фагоцитарное число, фагоцитарный индекс и индекс завершенности фагоцитоза.

Эксперимент показал, что облучение клеток гелиевой плазмой в течение 30 секунд приводило к повышению фагоцитарной способности макрофагов, что проявилось увеличением фагоцитарного числа, фагоцитарного индекса и индекса завершенности фагоцитоза.

Пример 2.

В опыт были взяты 5 самцов-гибридов (CBA×C57Bl/6)F₁. Мыши забивались путем цервикальной дислокации. Перитонеальные макрофаги получали по общепринятой методике. 1×10⁶ макрофагов в объеме 1 мл среды 199 внесли в пластиковые чашки Петри диаметром 5 см. Клетки подвергали воздействию гелиевой плазмы, полученной при силе тока 30 А, напряжении 20 В и расходе газа 2 л/мин. Воздействие плазмы на макрофаги осуществлялось в течение 30 секунд с расстояния 20 см от сопла плазмотрона. Контролем явились макрофаги, находившиеся в тех же условиях, но без воздействия плазмы. Все манипуляции проводили на льду для исключения теплового эффекта. Фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов определяли по отношению к золотистому стафилококку штамм №209. С этой целью к 1 мл суспензии макрофагов опытных и контрольных проб с концентрацией клеток млн/мл добавляли 2 млн бактерий в объеме 1 мл. Содержимое пробирки ресуспензировали и разливали на 2 пробирки. Пробирки помещали в термостат при 37°С. Для определения поглотительной способности макрофагов пробирки инкубировали 30 минут, переваривательной - 90 минут. После инкубации из суспензии готовили микропрепараты, используя окраску по Романовскому-Гимзе. Используя бинокулярный микроскопом подсчитывали 100 макрофагальных клеток и рассчитывают фагоцитарное число, фагоцитарный индекс и индекс завершенности фагоцитоза.

Эксперимент показал, что облучение клеток гелиевой плазмой в течение 30 секунд приводило к повышению фагоцитарной активности макрофагов.

Испытание способа проводили на 36 самцах-гибридах (CBA×C57Bl/6)F₁. Для каждой пробы макрофаги перитонеального экссудата пулировали от двух мышей.

Выделяли следующие группы экспериментальных животных:

1. Контрольная группа - перитонеальные макрофаги животных не подвергали воздействию гелиевой плазмы.

2. Подопытная группа - перитонеальные макрофаги животных подвергали воздействию гелиевой плазмы в течение 30 секунд.

После облучения фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов определяли по способности поглощать и переваривать бактерии Staph. aureus, штамм №209. Проведенные эксперименты показали, что воздействие гелиевой плазмы на макрофаги усиливает их фагоцитарную активность, что проявлялось увеличением фагоцитарного числа, фагоцитарного индекса и индекса завершенности фагоцитоза. Результаты опытов представлены в таблице.

Использование предлагаемого способа стимуляции фагоцитарной активности макрофагов обеспечивает следующие преимущества:

1. По сравнению с другими способами стимуляции фагоцитарной активности макрофагов эффект достигается в результате очень короткого времени действия фактора (30 секунд).

2. Способ позволяет локально воздействовать на функции макрофагов как в культуре клеток, так и в пределах целостного организма.

Способ стимуляции фагоцитарной активности макрофаговПоказательКонтрольДействие гелиевой плазмыФЧ83,11±1,5695,11±,1,41*ФИ2,31±0,113,32±0,17*ИЗФ33,8±1,2847,34±1,05*Число животных в группе1818Примечание: ФЧ - фагоцитарное число
ФИ - фагоцитарный индекс
ИЗФ - индекс завершенности фагоцитоза
* - Р< 0,0005 по сравнению с контролем

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в клинической практике для стимулирования биологических процессов в клетках и тканях. Перитонеальные макрофаги помещают в среду 199. Подвергают воздействию гелиевой плазмы, полученной при силе тока 30 А, напряжении 20 В и расходе газа 2 л/мин. Облучение клеток проводят в течение 30 секунд с расстояния 20 см от сопла плазмотрона. Способ обеспечивает сокращение времени действия физического фактора на клетки и позволяет локально воздействовать на функции макрофагов как в культуре клеток, так и в пределах целостного организма. 1 табл.

Способ стимуляции фагоцитарной активности макрофагов, включающий инкубирование в среде 199 с последующей обработкой физическим фактором, отличающийся тем, что в качестве физического фактора используют гелиевую плазму, полученную при силе тока 30А, напряжении 20В и расходе газа 2 л/мин, и осуществляют воздействие плазмы на макрофаги в течение 30 с с расстояния 20 см от сопла плазмотрона.