ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ "АВМ" Российский патент 2008 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 

Изобретение относится к области прикладной микробиологии, точнее к диагностическим средам для выявления энтеробактерий, и может быть использовано в медицине, ветеринарии, прикладной биотехнологии, пищевой промышленности и смежных отраслях промышленности, в частности для бактериологического контроля состояния продуктов питания, кормов и питьевой воды, а также помещений, приборов и оборудования.

Использование диагностических сред является одним из наиболее простых и широко распространенных методов диагностики патогенной микрофлоры. Как правило, ее идентификация основана на изменении цвета среды в зависимости от вида и особенностей микроорганизмов, что дает полную информативную картину микробного фона в данной пробе. Однако подбор оптимального состава диагностической среды представляет определенную проблему, т.к. сахаролитические и протеолитические ферменты микроорганизмов весьма многообразны и универсальны и часто встречаются у представителей разных видов бактерий, что делает используемую среду применимой только для диагностики ограниченного круга микроорганизмов.

В частности, желчный бульон, среды Раппопорта, Мюллера, Штерна и т.д. применяют для диагностики Е.coli и сальмонелл, среду Эндо (мясопептонный агар с лактозой, фуксином и сульфитом натрия) для определения кишечной палочки, сальмонелл ишигелл; среда Левина - для протей и кишечной палочки (агар с эозиноном и метиленовым синим), среда с солями резурина и т.д. (Каталог питательных сред, выпускаемых в СССР, Махачкала, 1992; В.Г.Иванов, Ю.Н.Шихалеев. Ветеринария, 1979, N 11, с.74; Коровин и др., Лабораторная диагностика болезней птиц., М.: Агропромиздат, 1989, с.71-83).

Недостатком указанных сред является узкий спектр микроорганизмов, которые могут быть диагностированы.

Более широкий круг микроорганизмов позволяет определить среда Левина, в состав которой входят агар, красители - метиленовый синий и эозин, углеводы (лактоза и сахароза), а также и соли (K₂НРО₄) (Каталог сухих питательных сред, выпускаемых в СССР для медицинской бактериологии. Выпуск 1. М., 1980, с.8; пат. РФ №2103367, 1998).

Наиболее близкой к заявляемому изобретению по составу и достигаемому эффекту являлась разработанная авторами среда ВБВ (пат. РФ №2103367, 1998), в состав которой входят минеральные соли - 7.5-9.5 г/л; лактоза - 8-12 г/л; манит - 0.3-0.7 г/л; агар - 5-10 г/л; красители - нейтральный красный - 0.03-0.05 г/л и бромтимоловый синий - 0.01-0.03 г/л, вода - остальное. В качестве минеральных солей используют смесь, содержащую NaCl, K₂SO₄, MgSO₄, Na₂HPO₄, (NH₄)₂SO₄ и NaCO₃. В присутствии микроорганизмов наблюдается появление следующих цветов: при наличии Е.coli - малиново-красный; при наличии Citrobacter - оранжево-красный, при наличии Klebsiella - цвет не изменяется или среда приобретает легкий красный оттенок, при наличии Hafhia - красный, при наличии Proteus - грязно-зеленый (характерная форма колоний), при наличии Salmonella - лимонно-зеленый.

Среду получают смешиванием агара с красителями и минеральными солями, растворением компонентов в воде, кипячением, фильтрованием, доведением рН до 7.0-7.2, стерилизацией с последующим добавлением раствора лактозы и маннита при рН 7.0-7.2. Недостатками среды ВБВ является невозможность ее хранения в готовом сухом виде, продолжительное время определения (около 2 суток).

Задачей, решаемой в рамках заявляемого изобретения, является создание новой питательной среды, компоненты которой до разбавления их водой способны длительное время храниться в виде готовой сухой смеси, на базе которой среда легко может быть получена в полевых условиях, которая обладает повышенными дифференцирующими свойствами, в частности, позволяющей проводить экспресс-определение видового и количественного состава энтеробактерий.

Технический результат достигался в результате использования при диагностике среды АВМ следующего состава: лактоза - 15-25 г/л; маннит - 0.8-1.2 г/л; пептон - 12-18 г/л; дрожжевой экстракт - 0.8-1.2 г/л; агар (порошок) - 8-15 г/л; красители - нейтральный красный - 0.03-0.05 г/л, бромтимоловый синий - 0.01-0.04 г/л, метиловый красный - 0.01-0.02, NaCl - 3.5-4,7 г/л, K₂SO₄ - 1.7-2.2 г/л; Na₂HPO₄×12H₂O - 1.2-1.5 г/л; (NH₄)₂SO₄ - 0,9-1.2 г/л; MgSO₄×7H₂O - 0.3-0.8 г/л; Na₂СО₃ 0.3-0.8 г/л; Na₂SO₃ - 0.1-0.3 г/л; вода - остальное.

До разбавления водой среда представляет собой сухую смесь, содержащую растворяемые ингредиенты в следующем соотношении (мас.%): лактоза - 20-40; маннит - 1.5-2.0; пептон - 20-30; дрожжевой экстракт - 1.5-2.0; агар (порошок) - 15-25; красители - нейтральный красный - 0.05-0.08, бромтимоловый синий - 0.02-0.07, метиловый красный - 0.02-0.04, NaCl - 6.0-8.0, K₂SO₄ - 3.0-4.0; Na₂HPO₄×12H₂O - 2.0-2.5; (NH₄)₂SO₄ - 1.5-2.0; MgSO₄×7H₂O - 0.5-1.5; Na₂СО₃ 0.5-1.5; Na₂SO₃ - 0.2-0.5.

Отличиями заявляемой среды, получившей условное наименование АВМ, является существенное увеличение концентрации в готовой смеси источников азота и углерода и расширение их ассортимента за счет введения в исходную смесь дополнительно пептона, дрожжевого экстракта, а также в качестве красителя - метилового красного и в состав минеральных солей - сульфита натрия. Изменение состава питательных веществ в среде ведет к более высокой интенсивности развития бактерий и большей дифференциации их метаболитов, что позволяет лучше фиксировать относительно небольшие изменения состава и свойств выделяемых ими метаболитов.

В присутствии микроорганизмов наблюдается появление следующих цветов: при наличии E.coli - малиново-красный; при наличии Citrobacter - оранжевый, при наличии Klebsiella - серо-розовый, при наличии Hafhia - красный, при наличии Proteus - грязно-зеленый (характерная форма колоний), при наличии Salmonella - лимонно-зеленый.

Диагностическая среда «АВМ» может быть использована для проведения таких бактериологических исследований, как выделение бактерий из патологического материала, определение бактериологической обсемененности, видового состава и количественного состава микрофлоры сыпучих материалов, жидкостей и воздуха.

Указанные граничные интервалы компонентов являются оптимальными. Их изменение либо снижает эффективность роста микроорганизмов, либо ухудшает эксплуатационные характеристики среды, например плотность геля, прозрачность и т.п.

Среду получают смешением ингредиентов в заданном соотношении и их измельчении. Перед использованием полученный порошок растворяют водой при нагревании, доводят рН до 7,4±0,02, стерилизуют, после чего разливают в чашки Петри по общепринятой методике. Чашки оставляют до застывания среды.

Эффективность и возможность практического применения среды иллюстрируется примерами.

Пример 1. Приготовление питательных сред «АВМ». Навески ингредиентов по таблице 1 из расчета на 1 кг среды смешивали и измельчали в роторном смесителе до получения гомогенного порошка.

Таблица 1РеагентНа 1 литр (г)На 1 набор (г)На 50 наборов (г)NaClчда3,641,155Na₂HPO₄×12H₂Oхч1,36 (0,54 б/в)0,41 (0,16 б/в)20,4 (7,84 б/в)(NH₄)₂SO₄чда10,315K₂SO₄чда20,630MgSO₄×7H₂Oчда0,50,157,5Na₂CO₃ б/вхч0,450,1356,75Na₂SO_{3 б/в}чда0,20,063Лактозачда206300Манитчда10,315Пептонформ154,5225Дрожжевой экстрактICN10,315Метиловый красныйчда0,0170,00510,255Нейтральный красныйчда0,0360,011 (0,022)0,54 (1,1)Бромтимоловый синийчда0,0270,0081 (0,0162)0,405 (0,81)Агар-агар (порошок)Difco103150ИТОГО: 56,23 (55,41)16,87(16,623)843,5 (831,15)

Затем полученный порошок расфасовывали в полиэтиленовые пакеты или пластиковую тару по 16,87 г. На каждую упаковку помещали этикетку с названием препарата, датой изготовления и инструкцией по применению.

Приготовление формы питательной среды, готовой к употреблению, осуществляли следующим образом. Полиэтиленовый пакет со средой АВМ стерильно вскрывают. Порошок концентрата среды помещают в коническую колбу, содержащую 300 мл дистиллированной воды, и при нагревании растворяют. Затем проверяют рН среды при помощи рН-метра и доводят его до 7,4±0,02. Среду стерилизуют в конических колбах, укупоренных ватно-марлевыми пробками и обернутых пергаментными колпачками при 110 С° и давлении 0,5 кг/см² в течение 30 минут. Затем среду разливают в чашки Петри по общепринятой методике. Чашки оставляют до застывания среды. В результате проведенных манипуляций получается среда со следующими свойствами (табл. 2).

Таблица 2Свойства среды АВМ после автоклавирования и застывания агара (геля)№ПоказателиСвойства1.Внешний видПри 20°С - гелеобразная масса без посторонних включений2.Цвет (%, не менее)Бурый (40)3.Концентрация водородных ионов (рН)7,2 - 7,44.СтерильностьДолжна быть стерильная

Контроль ростовых свойств среды АВМ производили путем посева методом истощающего штриха агаровых культур тест-штаммов (Е.coli, Proteus, Citrobacter, Klebsiella, Salmonella). Культуры наносили бактериальной петлей зигзагообразно по поверхности чашки Петри со средой. Чашки закрывали и выдерживали в термостате при 37°С в течение 24 ч. Полученные результаты приведены в таблице 3.

Таблица 3Определение видового состава энтеробактерий на средеСредаЦвет среды до посеваИндикаторЦвет колоний и среды в зависимости от ферментации лактозыбактерии+-АВМКоричневая с зеленоватым оттенком (бурая)метиловый красный,
бромтимоловый E.coliКрасно-розовыйрозовыйцвет среды красныйSalmonella sp.,Лимонно-зеленыйГрязно-зеленый   синий,
нейтральный красный Цвет среды не изменяетсяKlebsiella sp,Серо-розовыйСеро-розовыйЦвет среды не изменяетсяCitro bacter spОранжевыйОранжевыйцвет среды оранжевый

Пример 2. В условиях примера 1 готовят минимальные и максимальные по составу среды. Состав полученных сред приведен в табл.4.

Таблица 4Состав сред «АВМ»Реагент На 1 литр (г) оптимальнаяминимальнаямаксимальнаяNaClчда3,643,34,7Na₂HPO₄×12H₂Oхч1,361,21,5(NH₄)₂SO₄чда10,91,2К₂SO₄чда21,72,2MgSO₄×7H₂Oчда0,50,30,8Na₂CO₃ б/вхч0,450,30,8Na₂SO₃ б/вчда0,20,30,1Лактозачда201525Манитчда10,81,2Пептон из мяса фермент.фарм151218Дрожжевой экстрактICN10,81,2Метиловый красныйчда0,0170,020,01Нейтральный красныйчда0,0360,050,03Бромтимоловый синийчда0,0270,010,04Агар-агар (порошок)Difco10815

Пример 3. Было проведено сопоставление эффективности среды «АВМ» и стандартных диагностических питательных сред. Полученные результаты приведены в таблице 5. Установлено почти полное совпадение результатов (в 98,7% случаев) по выделению и идентификации рода культур на среде АВМ и по общепринятым методикам. Использование новой питательной среды позволяет примерно в два раза сократить сроки исследования и проводить не только качественный, но и количественный анализ, используется меньший набор сред при проведении исследований, что экономически более выгодно для птицеводческих хозяйств.

Таблица 5Сравнительная характеристика роста энтеробактерий на дифференциально-диагностических средах и на новой питательной средеСредаДифференцирующие компонентыИндикаторЦвет колоний энтеробактерий в зависимости от ферментации углеводовбактерии+-Агар Плоски ревалактозаНейтральный красныйЕ.coli, Salmonella sp., Klebsiella sp, Citrobacter sp.Розовый, красныйБесцветный, серовато-белыйЭМС (Среда Левина)лактоза, сахарозаЭозин, метиленовый синийE.coli Salmonella sp., Klebsiella sp, Citrobacter spТемно-фиолетового с металлическим блеском, почти черного цветаБесцветный, розовато-фиолетового цветаСреда ЭндолактозаОсновной фуксинE.coli Salmonella sp., Klebsiella sp, Citrobacter spКрасный с металлическим блеском или без него; розовыеБесцветный, светло-розовыеСреда АВМЛактоза, маннитнейтральный красный, бромтимоловый синий, метиловый красныйE.coli Salmonella sp., Klebsiella sp., Citrobacter spКрасно-розовый Лимонно-зеленый Серо-розовый ОранжевыйРозовый Грязно-зеленый Серо-розовый Оранжевый

Пример 4. Проведение бактериологических исследований.

Выделение бактерий из патологического материала. Высевы проводили пастеровской пипеткой на поверхность среды чашки Петри. Для этого наносили капли физиологического раствора на поверхность агара, затем той же пипеткой делали укол в исследуемый орган трупа или другого материала и полученный изолят переносили в каплю физиологического раствора на поверхности среды, а затем стерильным шпателем каплю распределяли по всей поверхности агара. Инкубировали при 37°С 24 часа.

Определение обсемененности и видового состава микрофлоры кормов, примексов, мясокостной муки, продуктов питания и других материалов.

Для исследования брали навески образцов и делали их последовательное разведение, кратные 10. Из разведений делали посевы на среду АВМ (0,1 мл материала) в чашках Петри и инкубировали их при 27°С 20 часов.

Определение обсемененности воды и других жидкостей.

Разведение проб производили в физиологическом растворе, кратное 10. Посевы делали из разведений 0.1 мл материала на среду АВМ в чашках Петри и инкубировали при 37°С 20 часов.

Определение обсемененности воздуха в животноводческих помещениях.

Для анализа готовили среду АВМ в чашках Петри. В исследуемом помещении 5 чашек со средой открывали, разместив их на расстоянии 50-100 см от пола, и держали их открытыми в течение различного времени: 1-ую чашку - 5 минут, 2-ую - 10 мин, 3-ью - 20 мин, 4-ую - 40 мин, 5-ую - 1 час 20 мин. (При сильном бактериальном загрязнении можно инкубировать чашки в течение 5 и 10 минут.) Затем чашки закрывали и инкубировали в термостате при 37°С 22 часа. Результаты опытов приведены в таблице 6-9.

Таблица 6Выявление специфической среды к различным бактериямСредаНаличие специфического роста бактерийЕ.coliSl. pullorumKlebsiellaAcuterobacterShigellaProteus1234567Среда Эндо++--++Среда Левина++--++Висмут-сульфит агар-+--++МПА-----+Данный способ++++++

Таблица 7Выявление обсемененности воздуха в свинарникеСреда по примеру2Наличие специфического роста бактерийЕ. coliSalmonellaKlebsiellaAcuterobacterProteus123456№2 (миним.)+++++№1 (оптим.)+++++№3 (максим.)+++++

Таблица 8Анализ жидкой искусственной смеси бактерий на различных средахСостав среды с 7 г/л агар-агара + 0,036 г/л нейтр. красный + 0,027 г/л брил. синий + 0,017 г/л метиловый красныйНаличие специфического роста культур бактерийЕ.coliSalmonellaKlebsiellaAcuterobacterShigellaProteusЛактоза, г/лМаннит, г/лСмесь солей мин., г/л1234567891,20,061,0-----+2,50,122,1-+-+-+50,254,3±+++-+100,58,5++++++150,7512,5++-+±+251,217,0+--+-+

Таблица 9Эффективность использования сред для диагностики микроорганизмовСредаМикроорган измыЦвет колонийРазведение10^-210^-310^-410^-510^-610^-7123456789АВМЕ.coliМалиново-красныйГазонГазонГазон154017618 SalmonellaЛимонно-зеленыйГазонГазонГазон92010211Среда ЛевинаЕ.coliТемно-фиолетовыйГазонГазонГазон147016817 SalmonellaБесцветныйГазонГазонГазон9101019Среда ПлоскиреваЕ.coliРозовыйГазонГазонГазон151017118 SalmonellaБесцветныйГазонГазонГазон90810211Среда ЭндоЕ.coliТемно-красныйГазонГазонГазон157017819 SalmonellaБесцветныйГазонГазонГазон90710611

Во всех опытах на среде «АВМ» наблюдалось изменение цвета в местах роста бактерий в зависимости от их вида:

Е.coli - малиново-красный; Klebsiella - серо-розовый; Hafhia - красный; Proteus - грязно-зеленый, характерная форма колоний; Salmonella - лимонно-зеленый.

Стафилококки и стрептококки, как правило, не изменяют цвета среды, поэтому для более полного анализа некоторые колонии можно исследовать микроскопически и приготовить мазки для морфологического исследования.

Проведенная экспериментальная проверка показала, что предлагаемая среда пригодна для диагностики общей бактериальной обсемененности и определения патогенной микрофлоры. При высеве на предлагаемую питательную среду удается получить результат через 18-26 часов благодаря использованию принципа изменения окраски среды и различной видовой окраски колоний микроорганизмов. При использовании общепринятых методов на эти исследования требуется не менее 48 часов, причем качественный состав микрофлоры выявляется на разных питательных средах.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологии, и может быть использовано в медицине, ветеринарии, прикладной биотехнологии, пищевой промышленности и смежных отраслях промышленности. Питательная среда содержит лактозу, пептон, дрожжевой экстракт, маннит, агар-агар, NaCl, Na₂SO₃, K₂SO₄, MgSO₄×7Н₂О, Na₂HPO₄×12H₂O, (NH₄)₂SO₄, Na₂СО₃, нейтральный красный, метиловый красный, бромтимоловый синий и дистиллированную воду. Изобретение позволяет сократить сроки выявления и увеличить спектр выявляемых микроорганизмов. 9 табл.

Питательная среда для выявления энтеробактерий, содержащая лактозу, маннит, нейтральный красный, бромтимоловый синий, агар-агар, NaCl, Na₂СО₃, Na₂HPO₄·12H₂O, (NH₄)₂SO₄, K₂SO₄, MgSO₄·7H₂O, дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит пептон, дрожжевой экстракт, метиловый красный, Na₂SO₃ при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

пептон12-18дрожжевой экстракт0,8-1,2лактоза15-25маннит0,8-1,2NaCl3,5-4,7Na₂СО₃0,3-0,8Na₂HPO₄·12H₂O1,2-1,5(NH₄)₂SO₄0,9-1,2K₂SO₄1,7-2,2MgSO₄·7H₂O0,3-0,8Na₂SO₃0,1-0,3нейтральный красный0,03-0,05бромтимоловый синий0,01-0,04метиловый красный0,01-0,02агар-агар8-15дистиллированная водаостальное.