ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ НАКОПЛЕНИЯ ЛИСТЕРИЙ Российский патент 2000 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической микробиологии, наиболее эффективно может быть использовано для бактериологической диагностики листериоза.

Значительное увеличение роли листериоза в инфекционной патологии человека, трудности, связанные с проведением эпидемиологического анализа этих инфекций, широкое инфицирование листериями пищевых продуктов обусловливают необходимость совершенствования микробиологической диагностики, что требует наличия эффективных питательных сред [1].

В настоящее время для этих целей используют бульон Левинталя (по Раловичу), питательную среду, содержащую ацетат талия и налидиксовую кислоту (TN) [2,3].

Недостатком этих сред является введение в состав сред ех tempore дефибринированной овечьей крови, трипафлавина. Кроме того, эти среды дорогостоящие и недоступны практическим лабораториям, занимающимся диагностикой листериоза.

Наиболее близким решением задачи того же назначения к заявляемому изобретению по совокупности признаков является триптозно-фосфатный бульон с полимиксином В (Бойсен-Мюллер), содержащий в качестве азотистого питания триптозу, а также декстрозу, хлорид натрия, динатрий фосфат, а в качестве ингибитора сопутствующей микрофлоры ex tempore вносят полимиксин В [2].

К причинам, препятствующим достижению указанного технического результата при использовании известной среды, принятой за прототип, является то, что триптозно-фосфатный бульон с полимиксином В является недостаточно селективной средой и, кроме того, данная питательная среда импортного производства, дорогостоящая.

Задача предлагаемого изобретения - повышение селективных свойств среды за счет использования отечественного сырья.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что в качестве основного источника азотистого питания в предлагаемой среде используется питательный бульон для культивирования микроорганизмов, в качестве стимулятора роста витаминный препарат "ЭКД", характеризующийся высоким содержанием аминокислот и комплекса витаминов, а также глюкоза, входящая в состав среды, обеспечивающая энергетическое питание, комплекс минеральных солей - динатрий фосфат и натрий хлористый, придающие среде изотонические свойства, налидиксовая кислота и полимиксин В как ингибитор сопутствующей микрофлоры, при следующем соотношении компонентов, г/л:
Питательный бульон для культивирования микроорганизмов - 15,0
Витаминный препарат "ЭКД" - 2,0
Д(+) глюкоза - 1,0
Динатрий фосфат - 2,5
Натрий хлористый - 3,0
Налидиксовая кислота - 0,04
ex tempore полимиксин В - 0,003
Вода дистиллированная - Остальное
Содержание в предлагаемой среде налидиксовой кислоты и полимиксина В полностью ингибирует рост сопутствующей микрофлоры, кроме того, среда обладает высокой чувствительностью, отмечается рост колоний при посеве из разведения 10^-7. Также среда обладает высокими накопительными свойствами. Эффективность накопления в 10 и более раз. Время генерации, т.е. удвоение массы культуры от 30 до 40 мин. Среда сконструирована из отечественных гостированных ингредиентов на основе питательного бульона для культивирования микроорганизмов и витаминного препарата "ЭКД", имеющих промышленный выпуск на предприятии НПО "Питательные среды" (4,5,6,7,8).

Среду получают следующим образом.

Пример 1. В 1 л дистиллированной воды растворяют следующие ингредиенты среды, взятые в количестве (минимальное): питательный бульон для культивирования микроорганизмов - 14,0 г; витаминный препарат "ЭКД" - 1,5 г; Д (+)-глюкоза - 0,8 г; динатрий фосфат - 2,0 г; натрий хлористый - 2,5 г. Среду доводят до кипения и кипятят 2 мин. Перед стерилизацией вносят налидиксовую кислоту (0,35 г налидиксовой кислоты растворяют в 0,5 мл 1% p-pa Na ОН при добавлении 4,5 мл дистиллированной воды) в 1 л питательной среды. Среду стерилизуют автоклавированием при температуре 121^oC в течение 15 мин. После автоклавирования вносят 0,0025 г полимиксина В. Разливают в стерильные пробирки.

Пример 2. Отличается от примера 1 тем, что растворяют следующие ингредиенты среды, взятые в следующих количествах (оптимальное): питательный бульон для культивирования микроорганизмов - 15,0 г; витаминный препарат "ЭКД" - 2,0 г; Д (+)- глюкоза - 1,0 г; динатрий фосфат - 2,5 г; натрий хлористый - 3,0 г. Среду доводят до кипения и кипятят 2 мин. Перед стерилизацией вносят налидиксовую кислоту (0,5 г налидиксовой кислоты растворяют в 0,5 мл 1% p-pa NaOH при добавлении 4,5 мл дистиллированной воды) и вносят в 1 л питательной среды. Среду стерилизуют автоклавированием при температуре 121^oC в течение 15 мин. После автоклавирования вносят 0,003 г полимиксина В. Разливают в стерильные пробирки.

Пример 3. Отличается от примера 1, 2 тем, что растворяют следующие ингредиенты среды, взятые в следующих количествах (максимальное): питательный бульон для культивирования микроорганизмов - 16,0 г; витаминный препарат "ЭКД" - 2,5 г; Д (+)-глюкоза - 1,2 г; динатрий фосфат - 3,0 г; натрий хлористый - 3,5 г. Среду доводят до кипения и кипятят 2 мин. Перед стерилизацией вносят налидиксовую кислоту (0,55 г налидиксовой кислоты в 0,5 мл 1% p-pa NaOH при добавлении 4,5 мл дистиллированной воды) в 1 л питательной среды. Среду стерилизуют, автоклавируют при температуре 121^oC в течение 15 мин, после чего вносят 0,003 5 г полимиксина В. Разливают в стерильные пробирки.

Каждый вариант среды получали отдельно. Посев микробной взвеси тест-штамма осуществляли в пробирку с питательным бульоном, перемешивали и инкубировали при температуре 37^oC в течение 24 ± 2 ч.

Результаты биологических показателей предлагаемой и известной сред приведены в таблице.

Из данных таблицы видно, что предлагаемая питательная среда имеет преимущество, так как на питательной среде полностью ингибируется рост сопутствующей микрофлоры по сравнению со средой-прототипом, ингибирующей рост сопутствующей микрофлоры частично. Кроме того, чувствительность и эффективность накопления предлагаемой среды выше по сравнению с прототипом.

Питательная среда разработана на основе отечественных ингредиентов, проста в приготовлении, намного дешевле среды- прототипа.

Таким образом, питательная среда обладает высокими селективными и накопительными свойствами. В процессе изготовления использовано отечественное сырье.

Библиографические данные
1. Лабораторная диагностика листерий животных и людей, меры борьбы и профилактика (инструктированные документы) М., 1987 г.

2. Бакулов И. А. , Васильев Д.А. Листериоз как пищевая инфекция. Ульяновск, 1991 г.

3. Бакулов И.А., Васильев Д.А. Методические рекомендации по бактериологическому контролю пищевых продуктов на наличие листерий. Ульяновск, 1992 г.

4. ФС 42-3505 - 98.

5. ФС 42-386 ВС-91.

6. Химические реактивы и высокочистые химические вещества. Каталог. -М.: Химия, 1983 г.

7. ГФХ, стр.426.

8. ТУ 64-6-254-83.

Изобретение предназначено для клинической микробиологии, в частности для бактериологической диагностики листериоза. В качестве основного источника азота среда содержит питательный бульон для культивирования микроорганизмов и витаминный препарат "ЭКД". "ЭКД" характеризуется высоким содержанием аминокислот и комплексом витаминов. Среда содержит глюкозу, обеспечивающую энергетическое питание. Она содержит также комплекс минеральных солей - динатрий фосфат и натрий хлористый. Минеральные соли придают среде изотонические свойства. Налидиксовая кислота и полимиксин В используются как ингибитор сопутствующей микрофлоры. Среда ингибирует полностью рост сопутствующей микрофлоры и обладает высокой чувствительностью и эффективностью накопления листерий. Среда сконструирована из отечественных гостированных ингредиентов, проста в приготовлении и имеет более низкую себестоимость. 1 табл.

Питательная среда для накопления листерий, содержащая глюкозу, натрий хлористый, динатрий фосфат, ингибитор сопутствующей микрофлоры - полимиксин В, дистиллированную воду, отличающаяся тем, что, с целью повышения селективных свойств среды, в качестве стимулятора роста введен витаминный препарат "ЭКД", в качестве питательной основы - питательный бульон для культивирования микроорганизмов, в качестве дополнительного ингибитора сопутствующей микрофлоры введена налидиксовая кислота при следующем соотношении компонентов, г/л:
Питательный бульон для культивирования микроорганизмов - 14,0 - 16,0
Витаминный препарат "ЭКД" - 1,5 - 2,5
Д(+) - глюкоза - 0,8 - 1,2
Динатрий фосфат - 2,0 - 3,0
Натрий хлористый - 2,5 - 3,5
Налидиксовая кислота - 0,35 - 0,55
Полимиксин В - 0,0025 - 0,0035
Вода дистиллированная - Остальное