ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ L-ФОРМ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 2004 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и касается питательных сред для экспериментального получения и культивирования L-форм микобактерий туберкулеза.

Известна плотная питательная среда для выделения из биоматериала животных и культивирования микобактерий туберкулеза, содержащая яйца куриные, желтки куриных яиц, молоко, картофельный отвар, малахитовый зеленый, калий фосфорнокислый двухзамещенный, натрий лимоннокислый, магний сернокислый, пептон, глицерин, тетра, или пента, или гексадекан, дистиллированную воду [1].

Однако известная среда не является пригодной для культивирования L-форм, так как для них требуется полужидкая питательная среда, обеспечивающая необходимые для их роста осмотические условия.

Наиболее близким аналогом является полужидкая среда в модификации Дорожковой для выращивания L-форм микобактерий туберкулеза, содержащая: источник азота, сахарозу, нативную сыворотку крови крупного рогатого скота или лошади, лимоннокислый натрий, лимоннокислое аммиачное железо, калий фосфорнокислый, двухзамещенный натрий, магний сернокислый, глицерин, агар-агар и воду [2].

Однако известная среда не позволяет получить в лабораторных условиях экспериментальные L-культуры микобактерий, необходимые для опытов по изучению особенностей вызываемого ими инфекционного процесса. Кроме этого она не обеспечивает быстрого роста L-форм микобактерий туберкулеза и достаточного накопления биомассы, а присутствие примесей в солевой основе оказывают токсическое влияние на клетку.

Задачей изобретения является: сокращение сроков роста и повышение выхода биомассы L-форм микобактерий, которая достигается тем, что в предлагаемой среде солевая основа (готовый стандартный раствор Хенкса) характеризуется отсутствием токсичных ионов, создает необходимую буферность и играет существенную роль в обмене веществ. Для ее приготовления пользуются предварительно очищенными реактивами и деионизированной водой.

Солевую основу (раствор Хенкса) готовят из двух основных растворов “А” и “Б”.

Основной раствор “А”, г:

Хлористый натрий 160,0

Хлористый калий 8,0

Хлористый кальций безводный 2,8

Сернокислый магний 4,0

Вода, мл До 1000

Стерилизуют, автоклавируя 20 мин 1,5 атм.

Основной раствор “Б”, г:

Двууглекислый натрий 7,0

Двузамещенный фосфат натрия 1,2

Однозамещенный фосфат калия 1,2

Глюкоза 20

Вода, мл До 1000

Раствор “Б” стерилизуют фильтрованием через пластины ЕК₂ в фильтре Зейтца.

К 900 мл дистиллированной воды добавляют 50 мл раствора “А”, автоклавируют и асептически добавляют 50 мл раствора “Б”. Устанавливают pH 7,2 - 7,3 путем добавления стерилизованного фильтрованием 1,5% раствора двууглекислого натрия.

В качестве стимулятора роста питательная среда содержит один из предельных углеводородов с длиной цепи С₁₄-С₁₇. Предельные углеводороды с длиной цепи C₁₄-C₁₇ в дозе 0,1-0,2 мл на пробирку оказывают ростостимулирующее влияние, активно воздействуют на обменные процессы в микробной клетке, активизируют синтез углеводов, являются источником энергии и пластическим материалом, понижение дозы не оказывает ростостимулирующего влияния, а повышение дозы приводит к снижению скорости роста, поэтому это количество (0,1-0,2 мл) является оптимальным для достижения эффекта.

В качестве L-трансформирующего агента питательная среда содержит изониазид, который влияет на белковый синтез микобактериальной клетки, в результате чего происходит нарушение целостности клеточной стенки бактерий и образование L-форм.

Патогенные микобактерии являются биохимически менее активными, о чем свидетельствует их медленное размножение и потребность в определенном комплексе питательных веществ. Они содержат меньше энзимов и ростовых веществ, поэтому являются более чувствительными к антибактериальным препаратам.

Необходимо наличие в среде нативной сыворотки крови крупного рогатого скота или лошади. Она обладает буферными свойствами, а также оказывает стимулирующее влияние на размножение и рост L-форм, так как с сывороткой крови в среду поступают белки и ряд прочно связанных с ними витаминов.

Пример 1

Было испытано влияние различных доз изониазида на культуры М. bovis шт. 8 и М. avium шт. 9. Культуры сеяли на испытуемую питательную полужидкую среду. Результаты исследования представлены в таблице 1.

При проведении микроскопии мазков нами отмечено, что в пробирках с содержанием 0,5 мкг/мл изониазида обе культуры были представлены типичными клетками (97-100%).

При концентрации 1 мкг/мл в культуре бычьего вида типичные клетки отсутствовали, а измененные формы представлены коккоподобными и вакуолизированными клетками (37-43%) зернистыми палочками и шаровидными телами (10-20%). М. avium шт. 9 в этом случае также был представлен типичными клетками (93%).

При увеличении концентрации в 2 раза типичные клетки М. bovis шт. 8 – отсутствовали, измененные формы наблюдались в виде коккоподобных клеток (55%), в пробирках с М. avium шт. 9 отмечалось большое количество типичных клеток (68%), но уже наблюдались и измененные формы, в основном зернистые палочки (23%).

При увеличении содержания до 5 мкг/мл рост М. bovis 8 - отсутствовал, а М. avium 9 рос в виде смешанной культуры: типичные 60% и измененные 40%. И только при увеличении концентрации изониазида до 10 мкг/мл в культуре М. avium 9 - не наблюдалось типичных клеток.

Таким образом, нами экспериментально установлено, что изониазид оказывает на патогенные микобактерии L-трансформирующее действие в дозе 1 мкг/мл среды. Микобактерии вида avium и атипичные микобактерии синтезируют больше ростовых веществ и витаминов, поэтому химиотерапевтическое вещество действует на них в более высоких концентрациях (10 мкг/мл). Поэтому изониазид в предлагаемой среде используется в дозе от 1 до 10 мкг/мл, которая является эффективной для достижения поставленной цели.

Приготовление среды. Навеску агар-агара (0,3-0,4 г) разводят (подогревая на водяной бане при 50-60°С) в 50 мл раствора Хенкса, после этого добавляют 9-12 мл 200%-ной сахарозы, углеводород (1,1-2,2 мл), изониазид (1-10 мкг/мл), доводят объем среды до 100 мл раствором Хенкса и автоклавируют при 0,5 атм. 30 мин. Питательную среду разливают по 9 мл в пробирку и выдерживают в термостате при 37°С в течение 2-3 суток для проверки на стерильность. Хранят среду в хорошо укупоренных пробирках при 0 – (+5)°С в течение 3-4 недель. Перед посевом добавляют нативную сыворотку крови крупного рогатого скота или лошади (10-20 мл).

Предлагаемая питательная среда отличается от известной тем, что дополнительно содержит предельный углеводород с длинной цепи С₁₄-С₁₇, изониазид, а солевая основа представлена буферным раствором Хенкса при следующем соотношении компонентов:

Агар-агар, г 0,3-0,4

Нативная сыворотка крови

крупного рогатого скота

или лошади, мл 10-20

Сахароза 200%-ная, мл 9-12

Предельный углеводород

с длиной цепи С₁₄-С₁₇, мл 1,1-2,2

Изониазид, мкг/мл 1-10

Солевая основа - буферный

раствор Хенкса, мл До 100

Пример 2.

Для приготовления 100 мл питательной среды берут следующие ингредиенты:

Агар-агар, г 0,3

Сахароза 200%-ная, мл 9

Предельный углеводород

с длиной цепи С₁₄-С₁₇, мл 1,1

Нативная сыворотка крови

крупного рогатого скота

или лошади, мл 10

Изониазид, мкг/мл 1

Солевая основа - буферный

раствор Хенкса, мл До 100

Навеску агар-агара разводят в солевой основе, после этого добавляют сахарозу 200%-ную, углеводород, изониазид и автоклавируют при 0,5 атм 30 мин. После охлаждения добавляют нативную сыворотку крови крупного рогатого скота или лошади. Питательную среду разливают по 9 мл в пробирку, выдерживают в термостате при 37°С в течение 2-3 суток для проверки на стерильность. Хранят среду в хорошо укупоренных пробирках при 0 – (+5)°С в течение 3-4 недель.

Пример 3.

Готовят среду в соответствии с примером 2, но компоненты берут в следующих количествах:

Агар-агар, г 0,4

Сахароза 200%-ная, мл 12

Предельный углеводород

с длиной цепи С₁₄-С₁₇, мл 2,2

Нативная сыворотка крови

крупного рогатого скота

или лошади, мл 20

Изониазид, мкг/мл 10

Солевая основа - буферный

раствор Хенкса, мл До 100

Результаты испытания питательных сред, приготовленных в примерах 1 и 2 для культивирования L-форм различных видов микобактерий, представлены в таблице 2.

Сопоставительный анализ показал, что в отличие от прототипа использование предлагаемой питательной среды позволяет ускорить рост L-форм в 2-3 раза, повысить интенсивность накопления биомассы в 2 раза.

Таким образом, использование новой среды обеспечивает достижение цели изобретения, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критерию “положительный эффект”.

Совокупность отличительных признаков соответствует критерию “новизна” и “изобретательский уровень”.

Источники информации

1. А.С. № 2059728, C 12 Q 1/04. Питательная среда для выделения из биоматериала животных и культивирования микобактерий туберкулеза. Авторы: Ходун Л.М., Таллер Л.А. и др.

2. Дорожкова И.Р., Кочемасова З.Н., Дыхно М.М. Выделение L-форм микобактерий туберкулеза из патологического материала / Методические рекомендации, М., 1984.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и касается питательных сред для получения L-форм микобактерий туберкулеза. Среда дополнительно содержит предельный углеводород с длиной цепи С₁₄-С₁₇, изониазид, а солевая основа представлена буферным раствором Хенкса. Изобретение обеспечивает сокращение сроков роста и повышение выхода биомассы L-форм микобактерий. 2 табл.

Питательная среда для выделения и культивирования L-форм микобактерий туберкулеза, содержащая сахарозу, нативную сыворотку крови крупного рогатого скота или лошади, агар-агар, солевую основу, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит предельный углеводород с длиной цепи С₁₄-С₁₇, изониазид, а в качестве солевой основы – буферный раствор Хенкса при следующем соотношении компонентов:

Агар-агар, г 0,3-0,4

Нативная сыворотка крови крупного

рогатого скота или лошади, мл 10-20

Сахароза 200%-ная, мл 9-12

Предельный углеводород

с длиной цепи C₁₄-C₁₇, мл 1,1-2,2

Изониазид, мкг/мл 1-10

Солевая основа - буферный раствор

Хенкса, мл До 100