Способ получения глиальных производных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с повышенной экспрессией BDNF для терапии ишемического инсульта Российский патент 2024 года по МПК C12N5/95 A61K35/12 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение в области биомедицинских исследований и разработок для поиска новых терапевтических подходов к лечению ишемического инсульта. Изобретение позволяет получить глиальные производные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки с повышенной экспрессией нейротрофического фактора головного мозга (BDNF).

Уровень техники

Одним из перспективных направлений регенеративной медицины является выделение из дифференцированных культур или стволовых клеток биологически активных веществ, прежде всего сигнальных молекул, и использование их для стимуляции регенерации. Потому как все больше исследователей подтверждают гипотезу паракринной индукции репаративных процессов при различных вариантах клеточной терапии [1]. Применение охарактеризованного и стандартизованного комплекса биологически активных веществ может обладать той же эффективностью, но гораздо большей безопасностью по сравнению c живыми клеточными культурами [1]. К настоящему времени известно несколько аналогичных по своему назначению изобретений, представляющих собой нейропептидные лекарственные препараты, полученные из тканей головного мозга млекопитающих, которые представляют собой композицию биологически-активных полипептидов, стимулирующих регенерацию нервной ткани. Для получения активных фармкомпозиций используются ткани мозга сельскохозяйственных животных. Эти препараты отличаются по источнику сырья, срокам гестации при заборе, молекулярным массам входящих в него белково - полипептидных фракций, их качественному составу, по способу применения (парентерально, интратекально, интраназально, субконъюктивально), по биологической и фармакологической активности. К таким препаратам относят: церебролизин - средство для лечения геморрагического или ишемического инсультов фирмы «Ebewe» (Австрия) - является продуктом обработки мозга интактных свиней; цереброкурин - лечебное средство при заболеваниях, сопровождающихся нарушением функций центральной нервной системы, фирмы ООО «НИР» (Украина)- является продуктом обработки мозга эмбрионов животных; кортексин - препарат полипептидной природы, получаемый путем экстракции из коры головного мозга крупного рогатого скота и свиней, фирмы ООО «Герофарм» (Россия), обладающий ноотропным, нейропротекторным, противосудорожным и антиоксидантным действием; церебролизат - препарат, повышающий устойчивость ткани головного мозга к интоксикации, гипоксии, гипогликемии, механической травме, фирмы «Микроген» НПО ФГУП (Иммунопрепарат), представляющий собой гидролизат коры головного мозга крупного рогатого скота. Однако ксеногенное происхождение препаратов ограничивает их применение из-за их высокой иммуногенности. Решение этой проблемы стало возможным благодаря разработанному Ш. Яманака методу получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека. Были разработаны технологии, позволяющие получать и наращивать неограниченное количество клеток нейроглиального происхождения человека, из которых можно выделить биологически активные молекулы. Поэтому культуры глиальных производных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с повышенной экспрессией нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) будут иметь более высокую значимость для терапии ишемического инсульта, чем уже существующие ноотропные препараты.

Ишемический инсульт является ведущей глобальной причиной смерти, связанной с высокой заболеваемостью и рецидивами. Ишемическое повреждение вызывает резкие изменения всего комплекса нейронных сетей и стимулирует их спонтанную реорганизацию. Однако этих модификаций недостаточно для значительного функционального восстановления после ишемического инсульта. В дополнение к начальному повреждению в центральной нервной системе (ЦНС) накапливаются дополнительные повреждения от реперфузии, нарушения гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), а также воспаления в ходе иммунного ответа. В конечном итоге инсульт приводит к значительной гибели тканей в ЦНС [2, 3].

Ишемия приводит к истощению запасов клеточной энергии, что, в свою очередь, приводит к неспособности нейронов поддерживать ионный баланс или обратному захвату нейротрансмиттеров. В частности, при инсульте происходит внеклеточное накопление глутамата, основного возбуждающего нейротрансмиттера. Избыток внеклеточного глутамата связывается с рецепторами NMDA и AMPA и активирует их, тем самым способствуя высокому притоку кальция. Перегрузка кальцием в нейронах активирует протеазы и липазы, которые разрушают клеточные органеллы и белки, что в свою очередь способствует клеточной гибели. Отек также способствует гибели клеток и потере ткани после ишемического инсульта. Сверхактивация рецепторов глутамата на нейронах способствует притоку натрия и воды, вызывая тем самым патогенное набухание клеток. Кроме того, нарушение целостности ГЭБ позволяет чужеродным белкам, жидкости и иммунным клеткам проникать во внеклеточное пространство ЦНС, что способствует вазоактивному отеку и усиливает повреждение тканей, что способствует поведенческой дисфункции и инвалидности после инсульта [3].

Снижение уровня кислорода в зоне инфаркта после инсульта приводит к активации широкого спектра сигнальных каскадов, связанных с факторами роста, которые оказывают нейропротекторное, противовоспалительное и антиапоптотическое действие. Тем не менее, эндогенных факторов роста недостаточно для индукции выживания клеток, нейрогенеза и ангиогенеза. Накопленные данные свидетельствуют о том, что дефицит факторов роста, в первую очередь нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), вероятно, способствует аберрантным структурным изменениям. Предполагается, что увеличение факторов роста с помощью белковой или генной терапии может быть потенциальной стратегией лечения инсульта. Хотя восстановительные эффекты различных факторов роста были исследованы для лечения инсульта, их короткий период полураспада ограничивает их прямое применение [4, 5].

BDNF является одним из наиболее хорошо изученных членов семейства нейротрофинов, считается нейротрофином с самым высоким уровнем экспрессии в центральной нервной системе взрослых. Этот фактор роста является важнейшим медиатором нейропластичности и нейропротекции, играя фундаментальную роль в ремоделировании синапсов и пластичности мозга, удлинении нейритов, развитии нейронов и выживании клеток, а также участвует во многих нейродегенеративных и психических расстройствах [4].

Сообщалось, что после инсульта экспрессия BDNF в области инфаркта постоянно снижена [6], а дефицит одного аллеля BDNF (+/-) приводил к увеличению площади инфаркта [7]. Кроме того, было показано, что лечение BDNF привело к уменьшению размера поражения [8] и улучшению функциональной двигательной активности [9]. Также были исследованы изменения уровня апоптотической активности методом TUNEL, который показал снижение клеточной гибели [10, 11]. Концентрация BDNF в пределах от 10 до 50 нг/мл повышает выживаемость нейронов in vitro; прямые инъекции 0,6-4,5 мкг BDNF в мозг также стимулируют выживаемость нейронов [12]. При интраназальном введение он способен проникать в ткани головного мозга. Его концентрация в лобной коре, гиппокампе и шейном ганглии спинного мозга составляет 10,7 нг/мл, 12,1 нг/мл и 18,1 нг/мл, соответственно, через час после введения 70 мкг [13]. Однако из-за короткого периода полураспада BDNF этот терапевтический подход не дает долгосрочных эффектов. Учитывая, что BDNF не проникает через гематоэнцефалический барьер и может оказывать пагубное системное воздействие [14], поиск новых способов доставки BDNF в мозг в течение длительного времени периоды времени имеет большое значение. Одной из возможных стратегий для обеспечения долговременных эффектов BDNF после ишемии является использование клеток, которые стабильно сверхэкспрессируют этот белок.

Известен способ, который является ближайшим аналогом настоящего изобретения - BDNF-сверхэкспрессирующие мезенхимальные стволовые клетки (МСК) человека, которые секретируют BDNF в пределах 1 - 125 нг/мл в день [15]. Его основным недостатком является тип трансдуцированных клеток. Способность глиальных предшественников к секреции не только BDNF, но и других нейротрофических факторов, характерных для ранних этапов формирования ЦНС, делают эту культуры более подходящим объектом для клеточной терапии ишемического инсульта по сравнению с МСК. Главным отличием и преимуществом настоящего изобретения является более повышенная секреция BDNF - 250±25,4 нг/мл, что в 2 раза выше существующего аналога.

Для решения данной проблемы предложено получение глиальных производных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, модифицированных путем введения гена нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) посредством лентивирусной трансдукции. Модифицированные клетки отличаются повышенной секрецией BDNF по сравнению со стандартной культурой. При этом клеточная культура модифицированных глиальных предшественников демонстрирует экспрессию глиального маркера s100β и состоит из 97±6% s100β ⁺ - клеток. Данные тестов показывают, что клетки стимулируют повышенную выживаемость кортикальных нейронов в модели глутаматной эксайтотоксичности по сравнению с глиальными предшественниками без модификации и обладают противоишемическим действием, заключающимся в снижении гибели животных и улучшению неврологического дефицита.

Раскрытие изобретения

Технической задачей изобретения является разработка способа получения клеточных культур человека с повышенной экспрессией нейротрофического фактора BDNF, демонстрирующих высокую эффективность в моделях глутаматной эксайтотоксичности in vitro и глобального ишемического инсульта in vivo.

Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является возможность получения глиальных производных индуцированные плюрипотентные стволовые клетки с выраженными нейропротективными свойствами за счет повышенной экспрессии BDNF. На всех стадиях получения глиальных производных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, модифицированных путем введения гена BDNF, используются только культуральные бессывороточные среды полностью охарактеризованного состава, не содержащие компонентов ксеногенного происхождения. Видовая специфичность используемых клеточных культур позволяет избежать иммунологических конфликтов, развитие которых возможно при введении пептидов ксеногенного происхождения. Кроме того, использование клеточных культур человека позволит получать не только BDNF в повышенной концентрации, но и другие полноразмерные белковые ростовые и нейротрофические факторы. Эффективность действия такой композиции потенциально выше, чем у коротких пептидов, а иммуногенность отсутствует.

Для достижения указанного технического результата предложено изобретение, характеризующееся выполнением следующей последовательности действий: из первичной культуры фибробластов получают индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (ИПСК) с помощью генетических конструкций на основе вируса Сендай, культивируют ИПСК человека в количестве 40000 клеток/см², проводят лентивирусную трансдукцию ИПСК геном BDNF, затем осуществляют дифференцировку трансдуцированных ИПСК в глиальном направлении и культуру глиальных предшественников стандартизуют по количественному анализу s100β + - клеток, которых должно быть не менее 97±6% в культуре. В итоге получают глиальные производные индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с повышенной экспрессией BDNF - 250±25,4 нг/мл.

Осуществление изобретения

Изобретение осуществляется следующим образом.

В процессе проведения исследований была установлена значимость следующих принципиальных моментов на различных этапах реализации изобретения:

1. Получение первичных культур фибробластов кожи человека

Для получения культуры фибробластов проводят биопсию небольшого участка кожи за ушной раковиной (0,5-1см²). Биоптат переносят в чашку Петри, промывают раствором Хэнкса с цефазолином (ПанЭко, РФ), затем добавляют раствор Трипсин/Версен 1:1 (ПанЭко, РФ) и инкубируют 1,5 часа при 37°C. Затем суспензию пипетируют и проводят центрифугирование при 1100 об/мин 10 минут. Супернатант удаляют, а осадок ресуспедируют в среде DMEM/F12 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 mM L-глутамина, пенициллина-стрептомицина 100 мг/л (ПанЭко, РФ) и рассевают на чашки Петри диаметром 35 мм (Corning, США) в плотности 1500-2000 клеток/см². Смена культуральной среды происходит раз в три дня. При достижении 70-80% конфлюентности клетки снимали раствором Трипсин/Версен 1:1 и рассеивали в плотности 1500-2000 клеток/см².

2. Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК) с помощью генетических конструкций на основе вируса Сендай

За день до репрограммирования фибробласты высевают в количестве 200 тысяч на лунку 6-луночного планшета. На следующий день добавляют векторы, несущие гены Oct4, Sox2, L-Myc, Klf-4 в количестве вирусных частиц на клетку (MOI) - 5, 5, 5 и 3 соответственно. Через сутки производят замену среды для фибробластов и далее среду заменяют ежедневно в течение 6 дней. На 7-ой день после репрограммирования клетки промывают дважды фосфатно-солевым буфером (ПанЭко, РФ), открепляют их реагентом TrypLE Select (Gibco, США) и центрифугируют при 1100 об/мин в течение 5 минут. Полученный супернатант отбирают, а клеточный осадок пересаживают в количестве 100 тысяч на чашку Петри диаметром 60 мм, предварительно обработав раствором витронектина в концентрации 10 мкг/мл (ThermoFisher Scientific, США). Через 24 часа после посева производят замену среды на Essential 8 Medium (Gibco, США) для культивирования плюрипотентных стволовых клеток человека. Смену среды осуществляют каждый день. Стандартизацию ИПСК проводят по экспрессии генов, специфичных для эмбриональных стволовых клеток OCT4, SOX2, NANOG, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60 иммуноцихимическим методом и ПЦР с обратной транскрипцией.

3. Культивирование ИПСК человека

ИПСК культивируют в коммерческой среде Essential E8 Medium. В качестве подложки для культивирования используют рекомбинантный витронектин (Gibco, США) в концентрации 10 мкг/мл и инкубируют 1 час при комнатной температуре. Каждый клон культивируют до достижения 80% конфлюентности и затем рассевают на новые чашки в соотношении 1:3. Пассирование ИПСК осуществляют с помощью раствора Версена (ПанЭко, РФ).

4. Лентивирусная трансдукция ИПСК

В качестве матрицы для синтеза гена BDNF используют коммерческие клоны от компании Евроген. Амплификацию фрагмента ДНК проводят методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Реакцию проводят следующим образом: первичная денатурация 95°C, 5 мин.; денатурация 95°C, 20 сек.; отжиг праймеров 60°C, 20 сек.; элонгация 72°C, 20 секунд (25 циклов). Последовательность праймеров: for GATAGGATCCATGACCATC CTTTTCCTTACTA и rev ACTAGGATCCCTATCTTCCCCTTTTAATGGTC. Далее ПЦР-продукты очищают с помощью комерческого набора для элюции ДНК из геля Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Cat. № A9282) согласно протоколу фирмы-производителя. После ДНК фрагменты лигируют в p-GEM-T вектор (Promega, Cat. № A3600). Для этого берут буфер для ДНК лигазы T4, 50 нг вектора pGEM-T, 3 ед. Т4 ДНК-лигазы (SibEnzyme, Cat. № E319) и инкубируют в течение часа при комнатной температуре. Затем проводят трансформацию клеток E.coli (штамм Top10F). После их трансформации выделяют p-GEM-T векторы, содержащие фрагменты ДНК, кодирующие ген BDNF человека. Полученные фрагменты секвенируют для проверки. Полученный p-GEM-T вектор со вставленным геном BDNF подвергают рестрикции для выделения гена BDNF.

Полученные фрагменты гена BDNF подвергают кинированию с помощью фермента Т4-полинуклеотид киназы (T4 Polynucleotide Kinase, SibEnzyme, Cat. № E311). Кинированные фрагменты ДНК, содержащий ген BDNF, имеющие «липкие» концы BamHI, лигируют в дефосфорилированный вектор pCMV, также рестрицированный по сайтам BamHI. Далее проводят наращивание вектора pCMV в компетентных клетках E. coli штамма Top10F. После чего клетки осаждают центрифугированием при 13000 оборотов/минуту в течение 30 секунд. Супернатант сливают, а к осажденным клеткам добавляют 200 μл лизирующего буфера (1% SDS, 0.1 H NaOH). Далее смесь центрифугируют в течение 15 минут при 13000 оборотов/минуту. К супернатанту добавляют изопропиловой спирт, после чего плазмидную ДНК высаживают центрифугированием в течение 15 минут на 12000 g при +4 С. Осадок промывают в 75% этаноле, высушивают на при комнатной температуре и растворяют в деионизованной воде (mQ). Сборку лентивирусных частиц осуществляют в специализированных клетках линии HEK293T с помощью трансфекции трех базовых плазмид, кодирующих вирусные белки, и полученной ранее плазмиды на основе вектора pCMV, содержащий ген BDNF. После сборки лентивирусных частиц их суспензию концентрируют на ультрацентрифуге для достижения рабочей концентрации.

Рабочую концентрацию лентивирусных частиц добавляют ИПСК и инкубируют в течение 24 часов. После проводят смену среды. Из полученной гетерогенной культуры получают клональные клеточные линии с оптимальным уровнем экспрессии BDNF.

Далее ИПСК со сверэкспрессией BDNF дифференцируют в нейральном направлении. Для этого клетки культивируют в среде DMEM/F12 (Gibco, США) с 1% N2 (Gibco, США), 2мМ глутамина (Панэко, РФ), 100 мг/л пенициллин-стрептомицина (Панэко, РФ), 10 мкМ SB431542 (Stemcell Technologies, США), 2 мкМ дорсоморфина (Stemcell Technologies, США), 200 нМ LDN193189 (Sigma-Aldrich, США). Образовавшиеся нейральные стволовые клетки дифференцируют в глиальные предшественники путем добавления в среду DMEM/F12 следующих компонентов: 1% заменителя сыворотки, 1% N2, 2мМ глутамина, 100 мг/л пенициллин-стрептомицина (Панэко, РФ), 10 нг/мл FGF-2, 20 нг/мл EGF (ProSpec, Великобритания), 20нг/мл CNTF (PeproTech, США). Следующие три дня культивировали клетки в среде DMEM/F12, 1% заменителя сыворотки, 1% N2 добавка, 2мМ глутамин, 100 мг/л пенициллин-стрептомицина (Панэко, РФ), 20 нг/мл EGF (ProSpec, Великобритания), 20нг/мл CNTF (PeproTech, США). Стандартизацию глиальных предшественников проводят по количественному анализу s100β + - клеток, которых должно быть не менее 97±6% в культуре (фиг. 1 А, Б).

Кондиционированную среду (КС) модифицированных глиальных предшественников получают следующим образом: клетки дважды промывают фосфатно-солевым буфером, инкубируют в среде DMEM/F12 (1:1) 12 ч., полученную КС центрифугируют при 3000 об/мин. в течение 5 мин., супернатант отбирают и проводят иммуноферментный анализ согласно инструкции производителя. Средняя концентрация BDNF после лентивирусной трансдукции должна составлять не менее 250±25,4 нг/мл.

Пример 1. Эффективность лентивирусной трансдукции.

Эффективность лентивирусной продукции оценивается опосредованно содержанием фактора BDNF в кондиционированных средах, полученных при культивировании глиальных предшественников. Для оценки секреции проводят иммуноферментный анализ согласно инструкции производителя, концентрация BDNF выражается в нг/мл.

Было исследовано 10 образцов кондиционированных сред для каждой культуры глиальных предшественников. Средняя концентрация BDNF после лентивирусной трансдукции составляет 250±25,4 нг/мл, что в разы превышает концентрацию в КС глиальных предшественников без модификаций (Таблица 1). При этом культура демонстрировала экспрессию глиального маркера s100b, и количество таких клеток было не менее 97±6% (фиг.1).

Пример 2. Оценка эффективности кондиционированных сред на модели глутаматной эксайтотоксичности in vitro

Оценку нейропротективного действия кондиционированных сред, полученных при культивировании глиальных предшественников со сверхэкспрессией BDNF и без модификаций, проводят на модели глутаматной эксайтотоксичности, выполненной на кортикальных нейронах. Для этого у крысят линии Wistar (Ро) производят декапитацию в соответствии с этическими требованиями по работе с животными. Суспензию кортикальных нейронов получали путем обработки ткани мозга папаином (0,5 мг/мл, Gibco, США), и дальнейшим осаждением в центрифуге (300×g) в Ca2+-содержащем растворе. Клеточный осадок ресуспендируют в соответсвующем объеме культуральной среды Neurobasal Medium (Gibco, США), содержащей 2% добавки B27 (Gibco, США), и переносят в лунки 48-луночных планшетов (Corning, США), предварительно покрытые поли-DL-лизином (ПанЭко, РФ) в концентрации 0,1 мг/мл. В каждую лунку вносят по 250 тысяч клеток в 500 мкл среды. На второй-третий день добавляют 10 мкМ арабинозинмоноцитозида (Sigma-Aldrich, США), который удаляют спустя сутки. В течение культивирования каждые три дня производят смену среды. Культуру кортикальных нейронов инкубируют в течение 10 сут. (37°C, 5% СО2, относительная влажность 98%) для достижения необходимой экспрессии глутаматных рецепторов. Добавление кондиционированной среды (20 мкл), предварительно сконцентрированной в 25 раз на фильтрах 3 кДа (Amicon Ultra), проводят за 16-18 часов до моделирования глутаматной эксайтотоксичности. Для моделирования глутаматной эксайтотоксичности культуральную среду собирают в отдельные пробирки, а культуру кортикальных нейронов дважды промывают раствором DPBS без Ca2+ и Mg2+ (ПанЭко, РФ), затем клетки инкубируют 1 ч. в присутствии глутамата (100 мкМ) в буферном растворе следующего состава (мМ): NaCl - 140, KCl - 5, CaCl2 - 2, глицин - 10, HEPES - 20, глюкоза - 5, (рН 7,4, доводили 1М NaOH) (Sigma-Aldrich, США). После добавления глутамата клетки на 1 час оставляют при комнатной температуре. Затем дважды промывают буфером, содержащим (мМ): NaCl - 140, KCl - 5, MgCl2 - 2, HEPES - 20, глюкоза - 5, (рН 7,4) (Sigma-Aldrich, США) и заливают исходной культуральной средой. МТТ анализ проводят на следующий день после моделирования. МТТ вносят в культуральную среду до конечной концентрации 0,5 мг/мл и инкубируют при 37°С в течение 1,5 ч. с последующим растворением кристаллов формазана в ДМСО (ПанЭко, РФ). Оптическую плотность измеряют при длине волны 570/620 нм на планшетном ридере (PerkinElmer, США). Результаты оценивают по отношению к контролю, который принимают за 100%.

Было показано, что сокультивирование глиальных предшественников без модификации (ГП), приводит к увеличению жизнеспособных клеток на 25±5,2% в модели глутаматной эксайтотоксичности in vitro. Инкубация с глиальными предшественниками со сверхэкспрессией BDNF (МГП) повышает число жизнеспособных клеток в культуре кортикальных нейронов на 49,4±7,2% (фиг. 2).

Пример 3. Оценка эффективности клеточных культур на модели глобального ишемического инсульта in vivo

Перед моделированием глобального ишемического инсульта крыс наркотизируют изофлюраном на воздушной смеси в концентрации 3% при введении и 1,5-2,5% при поддержании наркоза. Затем животных помещают на операционный стол, проводят разрез в области шеи и осуществляют выделение 2 общих сонных артерий с последующей одномоментной их перевязкой до места бифуркации. Ложно оперированным животным под наркозом проводят разрез и выделение артерий без последующей перевязки. После проведения операционных процедур крыс помещают на подогреваемую поверхность в целях избегания гипотермии до полного пробуждения от наркоза. Ежедневно регистрируют гибель животных. Крыс взвешивают до операции и на 3, 7 и 14 сутки после операции на весах SK-1000 (A&D Company Ltd., Япония).

Неврологический дефицит у животных определяют по шкале Stroke-index McGrow на 3, 7 и 14 сутки после моделирования глобальной ишемии.

Регистрируют количество животных с легкой симптоматикой (вялость движений, слабость конечностей, одно-, двусторонний полуптоз/птоз, тремор) и тяжелыми проявлениями неврологических нарушений (парезы конечностей, паралич нижних конечностей, боковое положение, кома).

Птозы и полуптозы оценивают визуально по степени опущенности века: полуптоз - опущение века на половину глаза, птоз - опущение века полностью. Манежные движения оценивают визуально по круговым движениям вокруг своей оси или по периметру круглого открытого поля. Парезы конечностей оценивают визуально, помещая животных на поверхность стола, а также в тесте «Вращающийся стержень». При парезе конечностей регистрируют отклонение походки животного по сравнению с показателем ложно оперированных крыс. Слабость конечностей регистрируют в тестах «Перекладина» и «Ротарод».

Тестируемые образцы вводят однократно интрацеребрально на 1 сутки после перевязки сонных артерий в количестве 1,5 млн. клеток на животное.

В группе контрольных крыс с ишемический инсультом наблюдается развитие неврологических осложнений, приводящих к гибели 21 % животных на 3 сутки и 53 % на 14 сутки после операции. При регистрации неврологического статуса на 3 и 7 и 14 сутки после моделирования глобальной ишемии среди животных контрольной группы выявляется большое количество крыс, у которых имеются неврологические нарушения. Введение ГП в течение 7 дней не способствует ослаблению неврологических нарушений. Наблюдается гибель 19% крыс на 3 сутки и 39% на 14 сутки регистрации. МГП с аналогичным режимом введения способствуют значительному ослаблению неврологических нарушений на 3 и 7 сутки после операции (Таблица 2). Процент гибели животных в данной группе был существенно снижен: 11% крыс на 3 сутки и 25,5% на 14 сутки регистрации. Таким образом, модификация глиальных предшественников приводит к более выраженному нейропротективному и противоишемическому действию за счет повышенной секреции нейротрофина BDNF клетками.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется таблицами и фигурами, где

Таблица 1 - в которой представлены данные об эффективности лентивирусной трансдукции, оцениваемой опосредованно содержанием фактора BDNF в кондиционированных средах, полученных при культивировании глиальных предшественников.

Таблица 2 - результаты, отражающие неврологический дефицит животных, таблица 3 - шкала Stroke-index McGrow.

Таблица 3- шкала Stroke-index McGrow.

и фигурами, где

Фиг. 1 Характеристика модифицированных глиальных предшественников, где

А - морфология и иммуноцитохимический анализ на маркер глиальных предшественников S100b (красный). Ядра окрашены DAPI (синий);

Б - данные проточной цитометрии, отражающие количество S100β+-клеток в культуре модифицированных глиальных предшественников.

представлена характеристика модифицированных глиальных предшественников.

Фиг. 2 - Относительная жизнеспособность клеток культуры кортикальных нейронов. МТТ-тест. *p≤0,05 достоверность отличия от глутамата; #p≤0,05 от контроля. Данные проанализированы с помощью однофакторного дисперсионного анализа с поправкой теста Холма-Сидака и представлены в виде средних значений и стандартных отклонений.

нейропротективные свойства их кондиционированных сред.

Список литературы

[1] Baraniak P. R., McDevitt T. C. Stem cell paracrine actions and tissue regeneration // Regenerative medicine. - 2010. - Т. 5. - №. 1. - С. 121-143.

[2] Kaur H. et al. Endovascular Stem Cell Therapy Promotes Neuronal Remodeling to Enhance Post Stroke Recovery by Alleviating Endoplasmic Reticulum Stress Modulated by BDNF Signaling // Stem Cell Rev. Reports. 2023. Vol. 19, № 1. P. 264-274.

[3] Boese A.C. et al. Neural stem cell therapy for subacute and chronic ischemic stroke // Stem Cell Res. Ther. Stem Cell Research & Therapy, 2018. Vol. 9, № 1. P. 1-17.

[4] Salehi M.S. et al. The Beneficial Potential of Genetically Modified Stem Cells in the Treatment of Stroke: a Review // Stem Cell Rev. Reports. Stem Cell Reviews and Reports, 2022. Vol. 18, № 2. P. 412-440.

[5] Liu G. et al. Use of induced pluripotent stem cell derived neurons engineered to express BDNF for modulation of stressor related pathology // Front. Cell. Neurosci. 2014. Vol. 8, № OCT. P. 1-12.

[6] Ferrer I. et al. Brain-derived neurotrophic factor reduces cortical cell death by ischemia after middle cerebral artery occlusion in the rat // Acta Neuropathol. 2001. Vol. 101, № 3. P. 229-238.

[7] Endres M. et al. Ischemic Brain Damage in Mice after Selectively Modifying BDNF or NT4 Gene Expression // J. Cereb. Blood Flow Metab. 2000. Vol. 20, № 1. P. 139-144.

[8] Zhang Y., Pardridge W.M. Blood-brain barrier targeting of BDNF improves motor function in rats with middle cerebral artery occlusion // Brain Res. 2006. Vol. 1111, № 1. P. 227-229.

[9] Andsberg G. et al. Neuropathological and Behavioral Consequences of Adeno-Associated Viral Vector-Mediated Continuous Intrastriatal Neurotrophin Delivery in a Focal Ischemia Model in Rats // Neurobiol. Dis. 2002. Vol. 9, № 2. P. 187-204.

[10] Jiang Y. et al. Effects of brain-derived neurotrophic factor on local inflammation in experimental stroke of rat //Mediators of inflammation. - 2010. - Т. 2010.

[11] Hasegawa Y. et al. Anti-apoptotic effects of BDNF-TrkB signaling in the treatment of hemorrhagic stroke //Brain Hemorrhages. - 2020. - Т. 1. - №. 2. - С. 124-132.

[12] Arancibia S. et al. Protective effect of BDNF against beta-amyloid induced neurotoxicity in vitro and in vivo in rats //Neurobiology of disease. - 2008. - Т. 31. - №. 3. - С. 316-326.

[13] Alcalá-Barraza S. R. et al. Intranasal delivery of neurotrophic factors BDNF, CNTF, EPO, and NT-4 to the CNS //Journal of drug targeting. - 2010. - Т. 18. - №. 3. - С. 179-190.

[14] Pilakka-Kanthikeel S. et al. Targeted brain derived neurotropic factors (BDNF) delivery across the blood-brain barrier for neuro-protection using magnetic nano carriers: an in-vitro study //PloS one. - 2013. - Т. 8. - №. 4. - С. e62241.

[15] Scheper V. et al. BDNF-overexpressing human mesenchymal stem cells mediate increased neuronal protection in vitro //Journal of neuroscience research. - 2019. - Т. 97. - №. 11. - С. 1414-1429.

Способ получения глиальных производных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с повышенной экспрессией BDNF для терапии ишемического инсульта

Таблица 1. Концентрация BDNF Исследуемый пептид Концентрация, нг/мл Модифицированные глиальные предшественники Глиальные предшественники BDNF 250±25,4 0,60±0,001

Таблица 2. Влияние интрацеребрального введения ГП и МГП на количество крыс с неврологическим дефицитом по шкале Stroke-index McGrow. *p≤0,05 достоверность отличия от контроля Показатели поведения Ложно оперированные Контроль ГП МГК 3 сутки Stroke-индекс 0,29 ± 0,20 1,78 ± 0,49 1,25 ± 0,53 1,44 ± 0,76 7 сутки Stroke-индекс 0,21 ± 0,14 1,61 ± 0,52 1,55 ± 0,47 0,86 ± 0,34^* 14 сутки Stroke-индекс 0,21 ± 0,20 1,56 ± 0,31 1,46 ± 0,65 0,75 ± 0,41^*

Способ получения глиальных производных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с повышенной экспрессией BDNF для терапии ишемического инсульта

Таблица 3. Шкала Stroke-index McGrow Неврологические симптомы Баллы Вялость, замедленность движений 0,5 Тремор 1 Односторонний полуптоз 1 Двусторонний полуптоз 1 Слабость конечностей 1,5 Односторонний птоз 1,5 Двусторонний птоз 1,5 Манежные движения 2,0 Парез 1-4 конечностей 2,0-5,0 Паралич 1-4 конечностей 3,0-6,0 Коматозное состояние 7 Смерть 10

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="GPCs-BDNF.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"

productionDate="2024-06-07">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023129048/10(064562)</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-11-09</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>100407</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023129048/10(064562)</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-11-09</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Dmitry Goldshtein </ApplicantName>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ получения глиальных

производных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с

повышенной экспрессией BDNF для терапии ишемического

инсульта</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>32</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..32</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gataggatccatgaccatccttttccttacta</INSDSeq_sequenc

e>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>32</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..32</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>actaggatccctatcttccccttttaatggtc</INSDSeq_sequenc

e>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к cпособу получения глиальных предшественников, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, с повышенной экспрессией BDNF для терапии ишемического инсульта. Изобретение обеспечивает получение клеточной культуры модифицированных глиальных предшественников, которая демонстрирует экспрессию глиального маркера s100β, стимулирует повышенную выживаемость кортикальных нейронов и обладает противоишемическим действием, заключающимся в снижении гибели животных и улучшении неврологического дефицита. 2 ил., 3 табл., 3 пр.

Способ получения глиальных предшественников, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, с повышенной экспрессией BDNF для терапии ишемического инсульта, характеризующийся тем, что для получения культуры фибробластов проводят биопсию небольшого участка кожи за ушной раковиной 0,5-1 см², при достижении 70-80% конфлюентности фибробласты снимают раствором Трипсин/Версен 1:1 и рассеивают в плотности 1500-2000 клеток/см², затем получают индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека с помощью генетических конструкций на основе вируса Сендай, при этом за день до репрограммирования фибробласты высевают в количестве 200 тысяч на лунку 6-луночного планшета, на следующий день добавляют векторы, несущие гены Oct4, Sox2, L-Myc, Klf-4, в количестве вирусных частиц на клетку - 5, 5, 5 и 3 соответственно, проводят культивирование ИПСК человека, при этом каждый клон культивируют до достижения 80% конфлюентности и затем рассевают на новые чашки в соотношении 1:3, осуществляют лентивирусную трансдукцию ИПСК, амплификацию фрагмента ДНК проводят методом полимеразной цепной реакции, используют последовательность праймеров: for GATAGGATCCATGACCATCCTTTTCCTTACTA и rev ACTAGGATCCCTATCTTCCCCTTTTAATGGTC, полученный p-GEM-T вектор со вставленным геном BDNF подвергают рестрикции для выделения гена BDNF, полученные фрагменты гена BDNF подвергают кинированию с помощью фермента Т4-полинуклеотид киназы и лигируют в дефосфорилированный вектор pCMV, сборку лентивирусных частиц осуществляют в специализированных клетках линии HEK293T с помощью трансфекции трех плазмид, кодирующих вирусные белки, и плазмиды на основе вектора pCMV, содержащего ген BDNF, далее ИПСК со сверэкспрессией BDNF дифференцируют в нейральном направлении, образовавшиеся нейральные стволовые клетки дифференцируют в глиальные предшественники путем добавления в среду DMEM/F12 следующих компонентов: 1% заменителя сыворотки, 1% N2, 2 мМ глутамина, 100 мг/л пенициллин-стрептомицина, 10 нг/мл FGF-2, 20 нг/мл EGF, 20 нг/мл CNTF, стандартизацию глиальных предшественников проводят по количественному анализу s100β⁺-клеток, которых должно быть не менее 97±6% в культуре, при этом клеточная культура модифицированных глиальных предшественников демонстрирует экспрессию глиального маркера s100β, стимулирует повышенную выживаемость кортикальных нейронов и обладает противоишемическим действием, заключающимся в снижении гибели животных и улучшении неврологического дефицита.