СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОБИОТИКА НА ОСНОВЕ ШТАММОВ КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ Escherichia coli Г-35-1/59, Escherichia coli Г-35-2/60, Escherichia coli Г-35-3/61 И ФЕКАЛЬНОГО ЭНТЕРОКОККА Enterococcus faecalis Г-35-4/62 Российский патент 2007 года по МПК A61K35/74 

Изобретение относится к медицинской промышленности, в частности биотехнологии, и может быть использовано при производстве лекарственных средств.

В настоящее время лекарственные средства, состоящие из живых микроорганизмов (препараты-пробиотики), широко применяются в медицине и ветеринарии для нормализации кишечной микрофлоры и повышения общей резистентности организма. (Шевелева С.А. Пробиотики, пребиотики и пробиотические продукты. Современное состояние вопроса. //Вопросы питания. - 1999. - Том 68. - №2. - с.32-40)

Известны работы О.Карапетяна и А.Карапетян, в результате которых была разработана биологически активная добавка к пище - концентрат бактериальный сухой Окарин (ТУ 550 МУ 0583467001-93), предназначенная для нормализации микрофлоры желудочно-кишечного тракта. В ее состав вошли три штамма кишечной палочки Escherichia coli Г-35-1/59, Escherichia coli Г-35-2/60, Escherichia coli Г-35-3/61, и один штамм фекального энтерококка Enterococcus faecalis Г-35-4/62, зарегистрированные в Государственном научно-исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича 22.03.83 г. (паспорт №01-07/89) и в коллекции культур США (1992 г.) под депозитными номерами АТСС №55343, АТСС №55344, АТСС №55345, АТСС №55346. Данные штаммы выделены из организма здорового человека, обладают высокой адгезивной и антагонистической активностью против широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, устойчивы к антибиотикотерапии и лучевому воздействию и обладают канцеролитическими свойствами.

Наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигаемому результату, выбранным в качестве прототипа, является способ получения концентрата бактериального сухого Окарин, изложенный Карапетяном О.Г., Карапетян А.О., Фанарджан Б.А., Тер-Казарьян С.Ш. в статье «Улучшение дискомфортного состояния при хронических желудочно-кишечных заболеваниях путем восстановления кишечной микрофлоры с помощью кисломолочного продукта» //Сб.науч.тр. Современная технология сыроделия и безотходная переработка молока. Ереван, 1989 г., стр.310-311//, разрешенного к применению в качестве биологически активной добавке к пище в 1993 г.

Способ включает получение маточных культур штаммов в питательной среде на основе экстракта кукурузы и стационарное раздельное культивирование микроорганизмов в молоке, с последующим смешиванием выращенных культур, добавлением сахарозы и желатины в качестве среды защиты и лиофильным высушиванием.

Недостатком известного способа является невысокое качество конечного продукта: т.е. в нем не удавалось создать равное количество живых микробных клеток каждого из используемых штаммов, при этом значительно превалировал энтерококк; показатель антагонистической активности концентрата при отсроченном антагонизме, выраженный в зонах задержки роста тест-штаммов, составлял не более 10 мм. Это связано с тем, что при стационарном выращивании невозможно создать стандартные условия культивирования в каждой серии: отсутствует возможность контролирования процесса культивирования контрольно-измерительными приборами; молоко, являющееся одним из компонентов питательной среды, имеет ряд недостатков: нестандартность состава в различных регионах, присутствие в молоке антимикробных препаратов, содержание лактозы, контаминация посторонней микрофлорой. Кроме того, питательная среда на экстракте кукурузы не рекомендована в технологии получения медицинских иммунобиологических препаратов. Выбранные условия способа стационарного культивирования не экономичны, т.к. при длительности культивирования в течение (18±1) ч выход биомассы с 1 мл питательной среды составляет не более 6·10⁶ живых микробных клеток штаммов кишечной палочки и фекального энтерококка. Показатель антагонистической активности концентрата при отсроченном антагонизме, выраженный в зонах задержки роста тест-штаммов, составляет не более 10 мм.

Задача, решаемая предлагаемым изобретением, - создание промышленного способа получения пробиотика на основе штаммов кишечной палочки Escherichia coli Г-35-1/59, Escherichia coli Г-35-2/60, Escherichia coli Г-35-3/61 и фекального энтерококка Enterococcus faecalis Г-35-4/62.

Технический результат от использования изобретения заключается в получении стандартного препарата с равным количеством живых микробных клеток каждого из исследуемых штаммов и увеличении антагонистической активности пробиотического препарата.

Указанный результат достигается тем, что в способе получения пробиотика на основе штаммов кишечной палочки Escherichia coli Г-35-1/59, Escherichia coli Г-35-2/60, Escherichia coli Г-35-3/61 и фекального энтерококка Enterococcus faecalis Г-35-4/62 методом глубинного культивирования маточных культур в питательной среде, добавление защитной среды и лиофильное высушивание, глубинное культивирование маточных культур осуществляют совместно в казеиновом бульоне с желатиной в течение 7-9 час при рН 7,4-7,8, при температуре 37-38°С, постоянном перемешивании, аэрации и подаче 40%-ного раствора глюкозы.

Глубинное культивирование осуществляют раздельно или совместно, на любых стандартных питательных средах, используемых при промышленном способе культивирования этих микроорганизмов, при постоянном перемешивании и аэрации, и подаче питательных растворов. В качестве среды защиты используют любые среды, используемые при получении бактерийных препаратов. Среду защиты или приготавливают заранее и вносят в реактор после окончания культивирования, или отдельные компоненты защитной среды вводят в питательную среду.

Преимущество предлагаемого способа заключается в том, что процесс культивирования осуществляют в стандартных условиях, время культивирования сокращается до 8 ч, при этом выход биомассы увеличивается в 10 раз, что позволяет получить высокий экономический эффект. Антагонистическая активность, являющаяся одной из основных качественных характеристик препарата, увеличивается в 1,5-2 раза.

Способ осуществляют следующим образом:

Используют одну из готовых питательных сред, например казеиново-дрожжевую, казеиновый бульон, казеиновый бульон с желатиной, казеиновый бульон с желатиной и альгинатом натрия. В питательную среду вводят при раздельном культивировании маточную культуру одного из штаммов, при совместном культивировании последовательно маточные культуры штаммов кишечных палочек Escherichia coli Г-35-1/59, Escherichia coli Г-35-2/60, Escherichia coli Г-35-3/61 и фекального энтерококка Enterococcus faecalis Г-35-4/62.

Культивирование проводят при постоянном контроле показателей рН, температуры, постоянном или периодическом перемешивании и аэрации, подаче питательного раствора. После окончания процесса культивирования в реактор вводят одну из заранее приготовленных сред защиты, например сахарозо-желатино-молочную, сахарозо-молочную. Полученную биомассу разливают и далее высушивают.

Нижеследующие примеры иллюстрируют изобретение.

Пример 1.

В биореактор с питательной казеиново-дрожжевой средой (производственный регламент ПР 732-98) вносят последовательно маточные культуры каждого из четырех штаммов. Осуществляют процесс культивирования в течение (8±1) ч при рН 7,4-7,8, температуре (37,5±0,5)°С, постоянном перемешивании и подаче стерильного воздуха и 40%-ного раствора глюкозы. После окончания процесса культивирования в реактор вводят заранее приготовленную стерильную среду защиты сахарозо-желатино-молочную (ПР 732-98). Полученную биомассу охлаждают до температуры (27±3)°С и разливают при постоянном перемешивании, или во флаконы, или в металлические емкости и далее лиофилизируют. Выход биомассы с 1 мл питательной среды составляет от 2·10⁷ до 4·10⁷ живых микробных клеток штаммов кишечной палочки и фекального энтерококка. Показатель антагонистической активности препарата, выраженный в зоне задержки роста тест-штаммов, составляет от 14 до 16 мм.

Пример 2.

Культивирование проводят в четырех биореакторах. В каждый из четырех биореакторов с питательной казеиново-дрожжевой средой (ПР 732-98) вносят по одной маточной культуре штаммов кишечных палочек Escherichia coli Г-35-1/59, Escherichia coli Г-35-2/60, Escherichia coli Г-35-3/61 и фекального энтерококка Enterococcus faecalis Г-35-4/62. Осуществляют процесс культивирования в течение (8±1) ч при рН 7,4-7,8, температуре (37,5±0,5)°С, постоянном перемешивании и подаче стерильного воздуха и 40%-ного раствора глюкозы. После окончания процесса культивирования соединяют содержимое четырех биореакторов в один и вводят заранее приготовленную стерильную среду защиты сахарозо-желатино-молочную (ПР 732-98). Полученную биомассу охлаждают до температуры (27±3)°С и разливают при постоянном перемешивании или во флаконы, или в металлические емкости и далее лиофилизируют. Выход биомассы с 1 мл питательной среды составляет от 10⁷ до 3·10⁷ живых микробных клеток штаммов кишечной палочки и фекального энтерококка. Показатель антагонистической активности препарата, выраженный в зоне задержки роста тест-штаммов, составляет от 10 до 13 мм.

Пример 3.

В биореактор с казеиновым бульоном (ПР 730-98) вносят последовательно маточные культуры каждого из четырех штаммов. Осуществляют процесс культивирования в течение (8±1) ч при рН 7,4-7,8, температуре (37,5±0,5)°С, постоянном перемешивании и подаче стерильного воздуха и 40%-ного раствора глюкозы. После окончания процесса культивирования в реактор вводят заранее приготовленную стерильную среду защиты сахарозо-желатино-молочную (ПР 732-98). Полученную биомассу охлаждают до температуры (27±3)°С и разливают при постоянном перемешивании, или во флаконы, или в металлические емкости и далее лиофилизируют. Выход биомассы с 1 мл питательной среды составляет от 2·10⁸ до 6·10⁸ живых микробных клеток штаммов кишечной палочки и фекального энтерококка. Показатель антагонистической активности препарата, выраженный в зоне задержки роста тест-штаммов, составляет от 17 до 19 мм.

Пример 4.

Культивирование проводят в четырех биореакторах. В каждый из четырех биореакторов с казеиновым бульоном (ПР 730-98) вносят маточные культуры каждого штамма кишечных палочек Escherichia coli Г-35-1/59, Escherichia coli Г-35-2/60, Escherichia coli Г-35-3/61 и фекального энтерококка Enterococcus faecalis Г-35-4/62. Осуществляют процесс культивирования в течение (8±1) ч при рН 7,4-7,8, температуре (37,5±0,5)°С, постоянном перемешивании и подаче стерильного воздуха и 40%-ного раствора глюкозы. После окончания процесса культивирования соединяют содержимое четырех биореакторов в один и вводят заранее приготовленную стерильную среду защиты сахарозо-желатино-молочную (ПР 732-98). Полученную биомассу охлаждают до температуры (27±3)°С и разливают при постоянном перемешивании, или во флаконы, или в металлические емкости и далее лиофилизируют. Выход биомассы с 1 мл питательной среды составляет от 10⁸ до 2·10⁸ живых микробных клеток штаммов кишечной палочки и фекального энтерококка. Показатель антагонистической активности препарата, выраженный в зоне задержки роста тест-штаммов, составляет от 15 до 17 мм.

Пример 5.

В биореактор с казеиновым бульоном с желатиной (ПР 730-98) вносят последовательно маточные культуры каждого из четырех штаммов. Осуществляют процесс культивирования в течение (8±1) ч при рН 7,4-7,8, температуре (37,5±0,5)°С, постоянном перемешивании и подаче стерильного воздуха и 40%-ного раствора глюкозы. После окончания процесса культивирования в реактор вводят заранее приготовленную стерильную среду защиты сахарозо-молочную (ПР 732-98). Полученную биомассу охлаждают до температуры (27±3)°С и разливают при постоянном перемешивании, или во флаконы, или в металлические емкости и далее лиофилизируют.Выход биомассы с 1 мл питательной среды составляет от 4·10⁸ до 7·10⁸ живых микробных клеток штаммов кишечной палочки и фекального энтерококка. Показатель антагонистической активности препарата, выраженный в зоне задержки роста тест-штаммов, составляет от 18 до 20 мм.

Пример 6.

Культивирование проводят в четырех биореакторах. В каждый из четырех биореакторов с казеиновым бульоном (ПР 730-98) с желатиной вносят маточные культуры каждого штамма, кишечных палочек Escherichia coli Г-35-1/59, Escherichia coli Г-35-2/60, Escherichia coli Г-35-3/61 и фекального энтерококка Enterococcus faecalis Г-35-4/62.

Осуществляют процесс культивирования в течение (8±1) ч при рН 7,4-7,8, температуре (37,5±0,5)°С, постоянном перемешивании и подаче стерильного воздуха и 40%-ного раствора глюкозы. После окончания процесса культивирования соединяют содержимое четырех биореакторов в один и вводят заранее приготовленную стерильную среду защиты сахарозо-молочную (ПР 732-98). Полученную биомассу охлаждают до температуры (27±3)°С и разливают при постоянном перемешивании, или во флаконы, или в металлические емкости и далее лиофилизируют. Выход биомассы с 1 мл питательной среды составляет от 2·10⁸ до 4·10⁸ живых микробных клеток штаммов кишечной палочки и фекального энтерококка. Показатель антагонистической активности препарата, выраженный в зоне задержки роста тест-штаммов, составляет от 14 до 16 мм.

Пример 7.

В биореактор с казеиновым бульоном (ПР 730-98) с желатиной и альгинатом натрия вносят последовательно маточные культуры каждого штамма. Осуществляют процесс культивирования в течение (8±1) ч при рН 7,4-7,8, температуре (37,5±0,5)°С, постоянном перемешивании и подаче стерильного воздуха и 40%-ного раствора глюкозы. После окончания процесса культивирования в реактор вводят заранее приготовленную стерильную среду защиты сахарозо-молочную (ПР 732-98). Полученную биомассу охлаждают до температуры (27±3)°С и разливают при постоянном перемешивании, или во флаконы, или в металлические емкости и далее лиофилизируют. Выход биомассы с 1 мл питательной среды составляет от 6·10⁸ до 8·10⁸ живых микробных клеток штаммов кишечной палочки и фекального энтерококка. Показатель антагонистической активности препарата, выраженный в зоне задержки роста тест-штаммов, составляет от 19 до 22 мм.

Пример 8

Культивирование проводят в четырех биореакторах. В каждый из четырех биореакторов с казеиновым бульоном (ПР 730-98) с желатиной и альгинатом натрия вносят маточные культуры каждого штамма, кишечных палочек Escherichia coli Г-35-1/59, Escherichia coli Г-35-2/60, Escherichia coli Г-35-3/61 и фекального энтерококка Enterococcus faecalis Г-35-4/62.

Осуществляют процесс культивирования в течение (8±1) ч при рН 7,4-7,8, температуре (37,5±0,5)°С, постоянном перемешивании и подаче стерильного воздуха и 40%-ного раствора глюкозы. После окончания процесса культивирования соединяют полученные культуры каждого штамма в одном реакторе и вводят заранее приготовленную стерильную среду защиты сахарозо-молочную (ПР 732-98). Полученную биомассу охлаждают до температуры (27±3)°С и разливают при постоянном перемешивании, или во флаконы, или в металлические емкости и далее лиофилизируют. Выход биомассы с 1 мл питательной среды составляет от 3·10⁸ до 4·10⁸ живых микробных клеток штаммов кишечной палочки и фекального энтерококка. Показатель антагонистической активности препарата, выраженный в зоне задержки роста тест-штаммов, составляет от 16 до 18 мм.

Изучение эффективности полученного заявленным способом пробиотика проводилось в Гастроэнтерологическом центре Дорожной клинической больницы (г.Н.Новгород) по разрешению Минздрава РФ (от 13.02.2003 г. №42). В результате проведенных клинических испытаний на 80 больных была показана высокая эффективность препарата для профилактики и лечения дисбактериоза кишечника у больных с хроническими заболеваниями желудочно-кишечного тракта, выразившаяся в уменьшении сроков купирования основных симптомов заболевания на 2-3 дня, полной нормализации микробного пейзажа кишечника у 95% больных.

По решению Комитета медицинских иммунобиологических препаратов (Протокол №4 от 25.06.2003 г.) пробиотик окарин рекомендован к регистрации в РФ.

Изучение эффективности полученного заявленным способом пробиотика проводилось также на базе Нижегородского ветеринарного института нечерноземной зоны РФ и Нижегородской государственной сельскохозяйственной академии в ряде животноводческих хозяйств Нижегородской области. Испытания проводились на двух видах сельскохозяйственных животных: телятах и цыплятах. В результате проведенных клинических испытаний была показана высокая эффективность препарата для профилактики и лечения желудочно-кишечных болезней телят, выразившаяся в положительном действии окарина на сохранность поголовья цыплят и телят, а также в большем приросте живой массы опытных животных по сравнению с контролем.

Преимущество предлагаемого способа заключается в том, что процесс культивирования осуществляют в стандартных условиях, время культивирования сокращается до 8 ч, при этом выход биомассы увеличивается в 10 раз, что позволяет получить высокий экономический эффект. Предлагаемый способ позволяет получить стандартный препарат с равным количеством живых микробных клеток каждого из используемых штаммов. Антагонистическая активность, являющаяся одной из основных качественных характеристик препарата, увеличивается в 1,5-2 раза.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве лекарственных средств. В способе получения пробиотика на основе штаммов кишечной палочки E.coli Г-35-1/59, E.coli Г-35-2/60, E.coli Г-35-3/61 и фекального энтерококка E.faecalis Г-35-4/62 глубинное культивирование осуществляют совместно в казеиновом бульоне с желатиной в течение 7-9 ч при постоянном перемешивании и аэрации, и подаче питательного раствора глюкозы. Изобретение обеспечивает получение многокомпонентного пробиотика с улучшенными специфическими характеристиками - повышенной антагонистической активностью препарата, а также интенсификацию технологического процесса, который характеризуется сокращением времени культивирования, увеличением выхода биомассы.

Способ получения пробиотика на основе штаммов кишечной палочки Escherichia coli Г-35-1/59, Escherichia coli Г-35-2/60, Escherichia coli Г-35-3/61 и фекального энтерококка Enterococcus faecalis Г-35-4/62 методом глубинного культивирования маточных культур в питательной среде, добавление защитной среды и лиофильное высушивание, отличающийся тем, что глубинное культивирование маточных культур осуществляют совместно в казеиновом бульоне с желатиной в течение 7-9 ч, при рН 7,4-7,8, при температуре 37-38°С, постоянном перемешивании, аэрации и подаче 40%-ного раствора глюкозы.