СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ Российский патент 2007 года по МПК G01N33/53 

Описание патента на изобретение RU2293330C1

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии и может быть использовано для определения уровня антителообразования в организме животных при оценке его иммунного статуса, нарушений клеточного иммунитета, изучения воздействия вакцинных и иммунотропных препаратов на иммунокомпетентные клетки.

Известен способ определения антител путем добавления к лимфоцитам специфического антигена, инкубированием, фиксацией лимфоцитов и регистрацией реакции с помощью иммуноферментной метки (Патент РФ № 2021616, МКИ5 G 01 N 33/535, БИ № 19, 1994).

Однако известный способ не позволяет определить изотип исследуемых антител.

Задачей заявленного технического решения является повышение точности способа при определении антителообразования в организме животного.

Поставленная задача решается в способе определения антител путем добавления к лимфоцитам специфического антигена, инкубированием, фиксацией лимфоцитов и регистрацией реакции с помощью иммуноферментной метки тем, что к лимфоцитам добавляют 1,0-3,0% раствор лимонной кислоты в объемном соотношении 1:5-10, инкубирование осуществляют в 5-15% растворе сыворотки лошади в среде RPMI-1640, фиксацию лимфоцитов проводят до добавления специфического антигена, а в качестве специфического антигена используют антитела к иммуноглобулину М. Также поставленная задача решается в способе определения антител тем, что специфический антиген используют в разведении 1:10000-20000.

Иммуноглобулин М - это изотип иммуноглобулинов, который первым появляется в процессе развития В-лимфоцитов, играя центральную роль в регуляции синтеза антител (Литмен С. и Гуд Р. Иммуноглобулины. М: Мир, 1981, с.471).

В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие режимы определения антител аналогичные заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию "новизны".

Все режимы способа осуществимы в лабораторных условиях, направлены на решение реальной технической задачи, т.е. предложение "промышленно применимо".

Впервые предложен способ определения антител, позволяющий определить цитоплазматические и мембранные иммуноглобулины лимфоцитов животных (заявленные режимы добавления лимонной кислоты к лимфоцитам, инкубация с сывороткой лошади при 4°С и использование в качестве специфического антигена антител к иммуноглобулину М), как нами установлено, позволяют достичь максимально точного результата определения антител. Также по соотношению цитоплазматических (Ц-Ig) и мембранных (M-Ig) иммуноглобулинов можно определить уровень антителообразования в организме животных. Если это отношение больше 1,0 - это является показателем начальной стадии антигенного раздражения, так как IgM являются "ранними" антителами иммунного ответа на сложные по составу патогенные микроорганизмы (Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М. Мир, 2000, с.100).

Способ иллюстрируется на следующих примерах.

Пример 1. Лимфоциты выделяли из свежевзятой крови крупного рогатого скота (КРС). Далее обработку их проводили следующим образом:

а) Пипеткой с тонким наконечником отбирали взвесь лимфоцитов (1-2×106 кл/мл) и разбавляли клеточную суспензию средой RPMI-1640 до 200 мкл. Затем добавляли 40 мкл 3%-ного раствора лимонной кислоты (объемное соотношение взвеси лимфоцитов и раствора лимонной кислоты 5:1) и отмывали 5 раз в 0,2 М фосфатном буфере (PBS) с рН 7,2. После тщательного отмывания клетки инкубировали с 15% сывороткой лошади в RPMI-1640 в течение 18 часов при 4°С. Отмывали 3 раза в PBS. На следующем этапе 200 мкл взвеси лимфоцитов наносили на обезжиренное предметное стекло и делали мазок, далее высушивали и фиксировали. Предметное стекло помещали в раствор моноклональных антител (МКА) к иммуноглобулину М рогатого скота в разведении 1:10000 на PBS. Инкубировали при 37°С 60 мин. Следующим этапом определения антител, как и в известном способе, является проведение иммуноформентного анализа. Для этого предметные стекла отмывали 3 раза в PBS, высушивали и помещали в раствор антител к мышиным иммуноглобулинам, конъюгированных с пероксидазой хрена (разведение 1:1000). Клетки инкубировали при 37°С в течение 60 мин и отмывали 3 раза в PBS. На 10 мин погружали препараты в раствор АЭК(3-амино-9-этилкарбазол). Затем предметные стекла промывали проточной водой, высушивали, определяя антитела по появлению специфического окрашивания лимфоцитов в коричневый цвет. Клетки, окрашенные по периферии в коричневый цвет, считали В-лимфоцитами с мембранной формой иммуноглобулинов. Клетки с окрашенной цитоплазмой считали антителообразующими лимфоцитами. Уровень антителообразования в организме животных определяли подсчитыванием не менее 200 клеток по соотношению Ц-Ig/M-Ig IgM-антител, которое составило 0,56. При определении антителообразования в соответствии с известным способом антитела в свежевзятой крови КРС не определялись.

б) Пипеткой с тонким наконечником отбирали взвесь лимфоцитов (1-2×106 кл/мл) и разбавляли клеточную суспензию средой RPMI-1640 до 200 мкл. Затем добавляли 20 мкл 1%-ного раствора лимонной кислоты (объемное соотношение взвеси лимфоцитов и раствора лимонной кислоты 10:1) и отмывали 5 раз в 0,2 М фосфатном буфере (PBS) с рН 7,2. После тщательного отмывания клетки инкубировали с 5% сывороткой лошади в RPMI-1640 в течение 18 часов при 4°С. Отмывали 3 раза в PBS. На следующем этапе 200 мкл взвеси лимфоцитов наносили на обезжиренное предметное стекло и делали мазок, далее высушивали и фиксировали. Предметное стекло помещали в раствор моноклональных антител (МКА) к иммуноглобулину М рогатого скота в разведении 1:20000 на PBS. Инкубировали при 37°С 60 мин. Следующим этапом определения антител, как и в известном способе, является проведение иммуноферментного анализа. Для этого предметные стекла отмывали 3 раза в PBS, высушивали и помещали в раствор антител к мышиным иммуноглобулинам, конъюгированных с пероксидазой хрена (разведение 1:1000). Клетки инкубировали при 37°С в течение 60 мин. и отмывали 3 раза в PBS. На 10 мин погружали препараты в раствор АЭК(3-амино-9-этилкарбазол). Затем предметные стекла промывали проточной водой, высушивали, определяя антитела по появлению специфического окрашивания лимфоцитов в коричневый цвет. Клетки, окрашенные по периферии в коричневый цвет, считали В-лимфоцитами с мембранной формой иммуноглобулинов. Клетки с окрашенной цитоплазмой считали антителообразующими лимфоцитами. Уровень антителообразования в организме животных определяли подсчитыванием не менее 200 клеток по соотношению Ц-Ig/M-Ig IgM-антител, которое составило 0,62. При определении антителообразования в соответствии с известным способом антитела в свежевзятой крови КРС не определялись.

в) Пипеткой с тонким наконечником отбирали взвесь лимфоцитов (1-2×106 кл/мл) и разбавляли клеточную суспензию средой RPMI-1640 до 200 мкл. Затем добавляли 30 мкл 2%-ного раствора лимонной кислоты (объемное соотношение взвеси лимфоцитов и раствора лимонной кислоты 7:1) и отмывали 5 раз в 0,2 М фосфатном буфере (PBS) с рН 7,2. После тщательного отмывания клетки инкубировали с 5% сывороткой лошади в RPMI-1640 в течение 18 часов при 4°С. Отмывали 3 раза в PBS. На следующем этапе 200 мкл взвеси лимфоцитов наносили на обезжиренное предметное стекло и делали мазок, далее высушивали и фиксировали. Предметное стекло помещали в раствор моноклональных антител (МКА) к иммуноглобулину М рогатого скота в разведении 1:20000 на PBS. Инкубировали при 37°С 60 мин. Следующим этапом определения антител, как и в известном способе, является проведение иммуноферментного анализа. Для этого предметные стекла отмывали 3 раза в PBS, высушивали и помещали в раствор антител к мышиным иммуноглобулинам, конъюгированных с пероксидазой хрена (разведение 1:1000). Клетки инкубировали при 37°С в течение 60 мин и отмывали 3 раза в PBS. На 10 мин погружали препараты в раствор АЭК(3-амино-9-этилкарбазол). Затем предметные стекла промывали проточной водой, высушивали, определяя антитела по появлению специфического окрашивания лимфоцитов в коричневый цвет. Клетки, окрашенные по периферии в коричневый цвет, считали В-лимфоцитами с мембранной формой иммуноглобулинов. Клетки с окрашенной цитоплазмой считали антителообразующими лимфоцитами. Уровень антителообразования в организме животных определяли подсчитыванием не менее 200 клеток по соотношению Ц-Ig/M-Ig IgM-антител, которое составило 0,65. При определении антителообразования в соответствии с известным способом антитела в свежевзятой крови КРС не определялись.

Пример 2. Лимфоциты выделяли из свежевзятой крови коз, иммунизированных 3%-й суспензией эритроцитов мышей. Далее обработку лимфоцитов проводили следующим образом:

а) Пипеткой с тонким наконечником отбирали взвесь лимфоцитов (1-2×106 кл/мл) и разбавляли клеточную суспензию средой RPMI-1640 до 200 мкл. Затем добавляли 40 мкл 3%-ного раствора лимонной кислоты (объемное соотношение взвеси лимфоцитов и раствора лимонной кислоты 5:1) и отмывали 5 раз в 0,2 М фосфатном буфере (PBS) с рН 7,2. После тщательного отмывания клетки инкубировали с 15% сывороткой лошади в RPMI-1640 в течение 18 часов при 4°С. Отмывали 3 раза в PBS. На следующем этапе 200 мкл взвеси лимфоцитов наносили на обезжиренное предметное стекло и делали мазок, далее высушивали и фиксировали. Предметное стекло помещали в раствор моноклональных антител (МКА) к иммуноглобулину М рогатого скота в разведении 1:10000 на PBS. Инкубировали при 37°С 60 мин. Следующим этапом определения антител как и в известном способе является проведение иммуноферментного анализа. Для этого предметные стекла отмывали 3 раза в PBS, высушивали и помещали в раствор антител к мышиным иммуноглобулинам, конъюгированных с пороксидазой хрена (разведение 1:1000). Клетки инкубировали при 37°С в течение 60 мин и отмывали 3 раза в PBS. На 10 мин погружали препараты в раствор АЭК(3-амино-9-этилкарбазол). Затем предметные стекла промывали проточной водой, высушивали, определяя антитела по появлению специфического окрашивания лимфоцитов в коричневый цвет. Клетки, окрашенные по периферии в коричневый цвет, считали В-лимфоцитами с мембранной формой иммуноглобулинов. Клетки с окрашенной цитоплазмой считали антителообразующими лимфоцитами. Уровень антителообразования в организме животных определяли подсчитыванием не менее 200 клеток по соотношению Ц-Ig/M-Ig IgM-антител, которое составило 3,42. При определении антителообразования в соответствии с известным способом антитела в свежевзятой крови коз не определялись.

б) Пипеткой с тонким наконечником отбирали взвесь лимфоцитов (1-2×106 кл/мл) и разбавляли клеточную суспензию средой RPMI-1640 до 200 мкл. Затем добавляли 20 мкл 1%-ного раствора лимонной кислоты (объемное соотношение взвеси лимфоцитов и раствора лимонной кислоты 10:1) и отмывали 5 раз в 0,2 М фосфатном буфере (PBS) с рН 7,2. После тщательного отмывания клетки инкубировали с 5% сывороткой лошади в RPMI-1640 в течение 18 часов при 4°С. Отмывали 3 раза в PBS. На следующем этапе 200 мкл взвеси лимфоцитов наносили на обезжиренное предметное стекло и делали мазок, далее высушивали и фиксировали. Предметное стекло помещали в раствор моноклональных антител (МКА) к иммуноглобулину М рогатого скота в разведении 1:20000 на PBS. Инкубировали при 37°С 60 мин. Следующим этапом определения антител как и в известном способе является проведение иммуноформентного анализа. Для этого предметные стекла отмывали 3 раза в PBS, высушивали и помещали в раствор антител к мышиным иммуноглобулинам, конъюгированных с пероксидазой хрена (разведение 1:1000). Клетки инкубировали при 37°С в течение 60 мин и отмывали 3 раза в PBS. На 10 мин погружали препараты в раствор АЭК(3-амино-9-этилкарбазол). Затем предметные стекла промывали проточной водой, высушивали, определяя антитела по появлению специфического окрашивания лимфоцитов в коричневый цвет. Клетки, окрашенные по периферии в коричневый цвет, считали В-лимфоцитами с мембранной формой иммуноглобулинов. Клетки с окрашенной цитоплазмой считали антителообразующими лимфоцитами. Уровень антителообразования в организме животных определяли подсчитыванием не менее 200 клеток по соотношению Ц-Ig/M-Ig IgM-антител, которое составило 3,56. При определении антителообразования в соответствии с известным способом антитела в свежевзятой крови коз не определялись.

в) Пипеткой с тонким наконечником отбирали взвесь лимфоцитов (1-2×106 кл/мл) и разбавляли клеточную суспензию средой RPMI-1640 до 200 мкл. Затем добавляли 30 мкл 2%-ного раствора лимонной кислоты (объемное соотношение взвеси лимфоцитов и раствора лимонной кислоты 7:1) и отмывали 5 раз в 0,2 М фосфатном буфере (PBS) с рН 7,2. После тщательного отмывания клетки инкубировали с 5% сывороткой лошади в RPMI-1640 в течение 18 часов при 4°С. Отмывали 3 раза в PBS. На следующем этапе 200 мкл взвеси лимфоцитов наносили на обезжиренное предметное стекло и делали мазок, далее высушивали и фиксировали. Предметное стекло помещали в раствор моноклональных антител (МКА) к иммуноглобулину М рогатого скота в разведении 1:20000 на PBS. Инкубировали при 37°С 60 мин. Следующим этапом определения антител, как и в известном способе, является проведение иммуноферментного анализа. Для этого предметные стекла отмывали 3 раза в PBS, высушивали и помещали в раствор антител к мышиным иммуноглобулинам, конъюгированных с пероксидазой хрена (разведение 1:1000). Клетки инкубировали при 37°С в течение 60 мин и отмывали 3 раза в PBS. На 10 мин погружали препараты в раствор АЭК(3-амино-9-этилкарбазол). Затем предметные стекла промывали проточной водой, высушивали, определяя антитела по появлению специфического окрашивания лимфоцитов в коричневый цвет. Клетки, окрашенные по периферии в коричневый цвет, считали В-лимфоцитами с мембранной формой иммуноглобулинов. Клетки с окрашенной цитоплазмой считали антителообразующими лимфоцитами. Уровень антителообразования в организме животных определяли подсчитыванием не менее 200 клеток по соотношению Ц-Ig/M-Ig IgM-антител, которое составило 3,48. При определении антителообразования в соответствии с известным способом антитела в свежевзятой крови коз не определялись.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет определить антитела в организме животного, а также уровень антителообразования, что более точно позволяет определить начальную стадию иммунного ответа.

Похожие патенты RU2293330C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ МУЛЬТИПЛЕКСНОГО АНАЛИЗА В-КЛЕТОК ДЛЯ ОЦЕНКИ КЛЕТОЧНОГО ЗВЕНА ИММУННОЙ СИСТЕМЫ РОГАТОГО СКОТА 2020
  • Ездакова Ирина Юрьевна
  • Капустина Ольга Владимировна
  • Вальциферова Светлана Владимировна
  • Григорьев Артем Геннадьевич
  • Ковайкина Валентина Михайловна
RU2761468C1
Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L. - продуцент моноклональных антител к дифференцировочному антигену @ -лимфоцитов человека 1990
  • Сидоренко Светлана Павловна
  • Ветрова Елена Петровна
  • Шлапацкая Лариса Николаевна
  • Бердова Анна Григорьевна
SU1705343A1
СРЕДСТВО, СТИМУЛИРУЮЩЕЕ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ СИНТЕЗ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ 1995
  • Миронов Владимир Флорович
  • Чернышев Евгений Андреевич
  • Малочкин Виктор Васильевич
  • Мартынов Александр Игорьевич
  • Куликов Геннадий Алексеевич
RU2108096C1
Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L., продуцирующий моноклональные антитела к поверхностному белку коронавируса крупного рогатого скота 1989
  • Муканов Касым Касенович
  • Несмеянов Владимир Андреевич
  • Гоголев Михаил Михайлович
  • Соколова Надежда Львовна
  • Надточей Григорий Андреевич
  • Булашев Айтбай Кабыкешович
  • Байтубаев Тутсун Габдуллаевич
SU1661231A1
ШТАММ 8С12 ПОСТОЯННОЙ МЕЖВИДОВОЙ ГИБРИДНОЙ ЛИНИИ КЛЕТОК МЫШИ Mus. musculus И ОВЦЫ Ovis aries - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ГЛИКОПРОТЕИДНОМУ АНТИГЕНУ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 2008
  • Юдин Виктор Игоревич
  • Козлов Владимир Егорович
  • Безгин Вячеслав Михайлович
  • Гулюкин Михаил Иванович
  • Иванова Людмила Александровна
RU2377297C1
ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО MUS MUSCULUS L. BPM VD-10 - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА 5H/E К АНТИГЕНУ 200 KDA ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА 2014
  • Храпова Наталья Петровна
  • Замарина Татьяна Валерьевна
  • Корсакова Ирина Игоревна
  • Пименова Екатерина Владимировна
  • Ким Екатерина Эдуардовна
RU2570638C1
ШТАММ 5А10 ПОСТОЯННОЙ ГИБРИДОМНОЙ ЛИНИИ КЛЕТОК МЫШИ Mus. musculus - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К IgG КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 2008
  • Юдин Виктор Игоревич
  • Козлов Владимир Егорович
  • Безгин Вячеслав Михайлович
  • Гулюкин Михаил Иванович
  • Иванова Людмила Александровна
RU2377299C1
Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L., продуцирующий моноклональные антитела к нуклеокапсидному белку коронавируса крупного рогатого скота 1989
  • Муканов Касым Касенович
  • Несмеянов Владимир Андреевич
  • Гоголев Михаил Михайлович
  • Соколова Надежда Львовна
  • Надточей Григорий Андреевич
  • Булашев Айтбай Кабыкешович
  • Байтубаев Турсын Габдуллаевич
SU1666532A1
МЫШИНАЯ ГИБРИДОМА Р56 - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА, ОБЛАДАЮЩЕГО СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ К ЯДЕРНОМУ АНТИГЕНУ ПРОЛИФЕРИРУЮЩИХ КЛЕТОК PCNA ЧЕЛОВЕКА 2010
  • Ползиков Михаил Александрович
  • Зацепина Ольга Владимировна
RU2435850C1
ШТАММ 1Н8 ПОСТОЯННОЙ ГИБРИДОМНОЙ ЛИНИИ КЛЕТОК МЫШИ Mus. Musculus - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К IgG ОВЦЫ 2008
  • Юдин Виктор Игоревич
  • Козлов Владимир Егорович
  • Безгин Вячеслав Михайлович
  • Гулюкин Михаил Иванович
  • Иванова Людмила Александровна
RU2377298C1

Реферат патента 2007 года СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии и может быть использовано для определения уровня антителообразования в организме животных. Сущность включает добавление к лимфоцитам, выделенным из крови рогатого скота. При этом добавляют 1,0-3,0% раствор лимонной кислоты в объемном соотношении 5-10:1, отмывают 0,2М фосфатным буфером с рН 7,2, инкубируют с в 5-15% раствором сыворотки лошади в среде RPMI-1640 при 4°С, фиксацию лимфоцитов проводят до добавления антигена, а в качестве антигена используют моноклональные антитела к иммуноглобулину М рогатого скота. Моноклональные антитела к иммуноглобулину М рогатого скота используют в разведении 1:10000-20000. Использование способа позволяет повысить точность определения антител, дает возможность определить цитоплазматические и мембранные иммуноглобулины лимфоцитов животных, а также уровень антителообразования в организме животных. 1 з.п. ф-лы.

Формула изобретения RU 2 293 330 C1

1. Способ определения антител путем добавления к лимфоцитам антигена, инкубирования, фиксации лимфоцитов и регистрации реакции с помощью иммуноферментной метки, отличающийся тем, что к лимфоцитам, выделенным из крови рогатого скота, добавляют 1,0-3,0%-ный раствор лимонной кислоты в объемном соотношении 5-10:1, отмывают 0,2М фосфатным буфером с рН 7,2, инкубирование осуществляют в 5-15%-ном растворе сыворотки лошади в среде RPMI-1640 при 4°С, фиксацию лимфоцитов проводят до добавления антигена, а в качестве антигена используют моноклональные антитела к иммуноглобулину М рогатого скота.2. Способ определения антител по п.1, отличающийся тем, что моноклональные антитела к иммуноглобулину М рогатого скота используют в разведении 1:10000-20000.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2007 года RU2293330C1

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ 1990
  • Гуров А.В.
  • Фаворов М.О.
  • Яшина Т.Л.
  • Хижнякова Т.М.
  • Гольдберг Е.З.
  • Ананьев В.А.
RU2021616C1
Лимфоциты
Методы
Под ред
Дж
КЛАУСА
- М.: Мир, 1990, с.150-151
Иммуноглобулины
Под ред
Г.ЛИТМЕНА и др
- М.: Мир, 1981, с.464-467
ARATAKE Y
et al
Application of the avidin-biotin-complex method for the light microscopic analysis of lymphocyte subsets with monoclonal antibodies on air-dried smears
Acta
Cytol.

RU 2 293 330 C1

Авторы

Ездакова Ирина Юрьевна

Даты

2007-02-10Публикация

2005-07-04Подача