Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L. - продуцент моноклональных антител к дифференцировочному антигену @ -лимфоцитов человека Советский патент 1992 года по МПК C12N5/18 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к гибридомной технологии, и может быть использовано для идентификации злокачественных клеток.

Целью изобретения является получение штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела (Мон-АТ) к диф- ференцировочному антигену/3-лимфоцита человека, экспрессированному на различных стадиях дифференцировки (3 -клеток.

Штамм гибридных клеток получают следующим образом.

Мышей линии Balb/c иммунизируют внутрибрюшинно клетками селезенки больного волосатоклеточным лейкозом, дозы 1,6-12х107 клеток 3 раза с интервалом 30 дней и внутривенно по 10-106 клеток через 4 недели после внутрибрюшинной иммунизации. Через 4 дня после внутривенного введения клеток проводят соматическую гибридизацию клеток селезенки мыши - самки линии BAIB/c, предварительно осажденных в растворе Percoll (d 1,055), с клетками мышиной миеломы 653. А.

Для получения раствора Percoll (d 1,065) используют(й 1,13)(Parmacia), 18 мл который смешивают с 2 мл Юх-PBS и 19 мл Ix - PBS. В дальнейшем 2x10 клеток селезенки мыши ресуспендируют в 4 мл приготовленного раствора Percoll (d 1,065). Наслоив на полученную суспензию клеток селезенки 1 мл среды RPM1-1640. клетки центрифугируют 19 мин при 400g (t 20°С). Полученный осадок клеток отмывают 3 раза в теплой среде ДМЕМ. 6х107 отмытых клеток селезенки гибридизуют с 4х108 клетск

XI О

со

N

со

миеломы 653. А с помощью 50%-ного поли- этиленгликоля м.м. 1500 (Loba Chemla). Клетки разливают в 96-луночные пластиковые плоскодонные планшеты (Llmbro). Для культивирования гибридных клеток на первых этапах используют среду ДМЕМ с 15% лошадиной сыворотки (Serva). После слияния в культуры клеток в течение 2-х недель добавляют НАТ-среду,конечная концентрация ипоксантина 10 М, аминоптерина 4x10 М, тимидина 1,6x10 М, а затем в течение 1 недели НТ-среду. После селекции гибридов в HAT и НТ-средах рост клонов гибридом выявляют в 270 из 672 лунок.

Скрининг специфической антительной активности проводят методом иммунофлуо- ресценции в непрямом варианте на моно-. слое живых клеток больного волосатоклеточным лейкозом. Клетки прикрепляют на предметные стекла, обработанные раствором поли- L-лизином (100 д) мл, м.м. 40000-80000).

При иммунофлуоресцентном анализе супернатантов гибридом специфическая антительная активность обнаруживается в 152 лунках, а при клонировании способность синтезировать антитела сохраняется 21 клон, Клонирование методом лимитирующих разведении проводят два раза с использованием перитонеальных макрофагов мышей BAIB/c в качестве фидера. После реклонирования и пассирования In vitro отбирают 1 клон гибридомы. клетки которого активно продуцируют антитела к поверхностному антигену клеток селезенки больного волосатоклеточным лейкозом. Штамм дипо- нирован под номером ВСКК (П) 240 в ин-те цитологии АН СССР, и получил название ИПО-24.

Штамм гибридных клеток характеризуется следующими свойствами.

Культуральные свойства и условия культивирования.

Культивирование In vitro в больших объемах проводят в 50 мл пластиковых и стеклянных флаконах и матрасах в среде ДМЕМ или RPM1-1640 с 10% донорской телячьей сыворотки (Serva), Штамм проходит более 40 пассажей In vitro, посевная доза 100 тыс. клеток на 1 мл, клетки пассируют раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:7. Оптимум температуры 37°С, оптимум рН от 6,8 до 7,5. При росте на пластике клетки образуют монослой, к стеклу клетки прикрепляются слабо и в стеклянных флаконах растут в суспензии. Культивирование в организме животных.

Для выращивания асцита мышам линии BAIB/C за 7-30 дней до инъекции вводят внутрибрюшинно по О.П 2.6. 10.14

раэтилпентадекана или вазелинового масла. Клетки инъецируют внутрибрюшинно по 10 клеток в 5 мл среды Игла. Асцит формируется через 12-14 дней в количестве 45 мл.

Биосинтез полезного продукта. Секреция Мон-АТ, обозначаемого ИПО- 24, на 3-4 день культивирования составляет 10-15 мкг в 1 мл культуральной среды и 5-10

0 мг в 1 мл асцитической жидкости. Продукция Мон-АТ сохраняется как минимум до 45 пассажей In vitro и до 4-х пассажей в асцит- ной форме.

Криоконсервирование. Для длительно5 го хранения клеток штамма клетки замораживают в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 10% ДМСО. Режим замораживания: 4°/мин до +4°С, затем 1°/мин до - 70°С. После замораживания

0 клетки переносят в жидкий азот. Размораживание на водяной бане при 37°С. Жизнеспособность клеток после размораживания 70-80% по окрашиванию трипановым синим.

5 Морфологические свойстве.

При морфологическом исследовании клетки гибридомы преимущественно среднего размера бластные клетки со средним ядерно - цитоплазматическим отношением,

0 с довольно нежной структурой ядерного хроматина, ободком базофильтной цитоплазмы, не содержащей зернистости. Ядро округлое или бобовидное. При цитохимиче- ском исследовании в клетках гибридомы вы5 явлена умеренная активность ферментов кислой фосфатазы и неспецифической - на- филацетатэстеразы. Контаминация. При длительном наблюдении в посевах

0 на питательные среды бактерии и грибы в культуре не обнаружены.

Характеристика полезного продукта. В результате изучения специфичности МКАТ-ИПО-24 установлено, что определяе5 мый ими антиген обнаруживается на поверхностных мембранах/3 -клеточных линий CABIL, Dandi, Rajl и отсутствует на Т-клеточ- ных линиях различной степени зрелости НИТ, 1301, СЕМ, МТ4. Н9. MOIT-4.

0 МКАТ ИПО - 24 также не взаимодействуют с линиями клеток нелимфоидной природы MEWo, A - 431 и линией клеток, полученной от больного миеломной болезнью - RPMI-8826. Штамм секретирует Мон5 AT класса FgG2b.

П р и м е р 1. Клетки гибридомы ИПО - 24 в концентрации 2х104/мл культивируют при 37°С в 50 мл пластиковом флаконе в среде RPMI-1640(Glbco. Великобритания) с 10% инактивированной прогреванием при

56°С в течение 40 минут сыворотки крови крупного рогатого скота и 100 мкг/мл гента- мицина (Pharma-chlm, Болгария).

На третьи сутки после смены среды из флакона отбирают 3 мл культуральной сре- ды, центрифугируют ее при 8хЮ3 об/мин в течение 10 мин. В полученный супернатант добавляют 15 М NaNa и используют в реакции непрямой иммунофлуоресценции.

Разрезают полоску Parafllm M (American Can Company, США) размером 15x45 мм. Делают пробойником 4 отверстия диаметром 5 мм. Положив полоску на стекло, расплавляют парафильм М на электрической плитке. В лунки заливают раствор поли-Ьлизина (100 мкг/мл) (Sigma, США) в среде 0,5% гидролизат лактальбумина в растворе Хенкса (Гларх), Инкубируют 60 мин при 37°С во влажной камере. Затем стекла промывают средой ГЛАРХ и исполь- зуют для нанесения суспензии клеток - мишеней.

В качестве клеток - мишеней используют культуру В-клеток человека Rajl. Клетки, культивируемые In vitro, отбирают из флако- на. 3-кратно отмывают путем центрифугирования при 1,5х103 об/мин в течение 5 мин и ресуспендируют в ГЛАРХ. доведя концентрацию клеток до 4х10б/мл.

Клетки инкубируют на предметном стекле 45 мин при 37°С во влажной камере. Промывают препарат в 3-х стаканчиках со средой. Наносят по 0,05 мл супернатанта гибридомы ИПО-24 на каждую лунку. Инку- бируют 20 мин при 37°С, отмывают в 3-х стаканчиках со средой. Затем наносят меченую FITC кроличью сыворотку против мышиных иммуноглобулинов в разведении 1:16 по 0,05 мл на лунку. Препарат инкуби- руют 20 мин при 37°С во влажной камере. Затем промывают препарат в трех стаканчиках с ГЛАРХ, высушивают на воздухе, удаляют парэфильм и наносят 50% глицерин в PBS. Покрывают препарат покровным стек- лом и запаивают парафином. Препарат исследуют в люминесцентном микроскопе МЛ-2 при увеличении х 900. Для возбуждения люминесценции синефиолетовыми лучами используют светофильтр, предохраняющий препараты от выцветания Исследуют 400 клеток.

Результаты: свечение в виде ободка зеленого цвета наблюдают на 55.1 % клеток, т.е. 55,1% клеток линии несут поверхностный антиген, выявляемый Мон-АТ ИПО-24.

П р и м в р 2. Из флакона с культурой Т-клеточной линии Н9 ои отбирают 3 мл суспензии, 3-кратно отмывают от культуральной среды путем центрифугирования при 1.5x10 об/мин в ГЛАРХ и ресуспендируют в ГЛАРХ.

В лунки на предметное стекло, подготовленное для реакции иммунофлуоресценции также, как и в примере 1. наносят клетки линии Н9 в концентрации 4хЮ5/мл. Препарат инкубируют 45 мин при 37°С во влажной камере.

Промывают препарат в 3-х стаканчиках с ГЛАРХ. Наносят по 0,05 мл супернатанта гибридомы ИПО-24. Супернатант получают так же, как и в примере 1. Инкубируют 20 мин при 37°С во влажной камере, отмывают в трех стаканчиках в с ГЛАРХ.

Наносят меченую FITC кроличью сыворотку против Ig мыши в разведении 1:16 по 0,05 мл на лунку. Препарат инкубируют 20 мин при 37°С во влажной камере, а затем отмывают в трех стаканчиках с ГЛАРХ и высушивают на воздухе. Удаляют пара- фильм, наносят 50%-ный глицерин на PBS, покрывают препарат покровным стеклом и запаивают парафином. Исследуют препарат при увеличении х 900 в люминесцентном микроскопе.

Результаты: свечение в виде зеленого ободка наблюдают на 10% клеток, т.е. клетки линии Н9 не несут поверхностный антиген, выявляемый Мон-АТ ИПО-24. Формула изобретения Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. ВСКК (П) 240 D-продуцент моноклональных антител к дифференцировочному антигену/ -лимфоцитов человека.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к гибридомной технологии и может быть использовано для идентификации злокачественных клеток. Целью изобре- тения является получение штамма гибридных клеток, продуцирующих моно- клональные антитела (Мон-АТ) к дифферен- цировочному антигену /J-лимфоцитов человека, экспрессированному на различных стадиях дифференцировки/ -клеток. Штамм получен при соматической гибридизации клеток мышиной миеломы 653.А и клеток селезенки мыши линии BALB/c, иммунизированной клетками селезенки больного волосатоклеточным лейкозом. Клетки штамма, сектерированные Мон-АТ. принадлежат к классу lgG2s и обозначены ИПО-24. Культуральные свойства штамма типичны для гибридов, секреция Мон-АТ составляет 10-15 мкг/мл в культуральной жидкости и 5-10 мг/мл в асцитической жидкости. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) 240Д. Мон-АТ специфичны к дифференци- ровочному антигену / -лимфоцитов человека.