Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L., продуцирующий моноклональные антитела к нуклеокапсидному белку коронавируса крупного рогатого скота Советский патент 1991 года по МПК C12N5/18 C12P21/08 

Описание патента на изобретение SU1666532A1

гена с неполным адъювантом Фрейнда Последнюю иммунизацию проводят 50 мкг антигена в 0,15 М фосфатно -буферном растворе, рН 7,2, и через 3 дня клёт ки селезенки используют для гибриди - 5ации. Гибридизацию проводят добавле - нием к смеси 4 106 миеломных клеток 28 Ч О6 спленоцитов 1 мл раствора, Содержащего 45% ПЭГг-4000, 10% илсульфоксида и 45% среды RPMI-1640 Ьливающий агент вносят в течение 15 с, затем медленно перемешивают клетки в течение 60 с и в течение 15 с добавляют 10 мл среды RPMI-1640r Затем оставляют для инкубации на 10 мино После этого клетки осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин. Осадок клеток суспендируют в среде RPMI-1640 с бавлением 10% по объему эмбриональной сыворотки теленка и высевают в луночные планшеты по 100 мкл на лунку. На второй день после слияния добавляют селективную среду с гипоксанти ном, аминоптерином и тимидином (ГАТ) Через 1СЫ4 дней из лунок, где выросли клоны клеток, отбирают культу ральную жидкость для тестирования на активность, т.е на продукцию ан тителс Продукцию специфических антител, синтезируемых гибридными клетка - ми, определяют методом иммунофер - ментного анализа (ИФА) с использоваг- нием кроличьих антител к иммуногло- булинам мышей, конъюгированных с перо сидазой хрена и коронавирусного антш- гена, очищенного в градиенте плотнос - ти сахарозы Гибридные клетки, про - цуцирующие МонАТ, клонируют два раза методом лимитирующих разведений с.После второго клонирования 100% субклонов продуцируют антитела к тестируемому антигену Штамм клеток секретирует антитела в культуральную среду или асцитную жидкостьо

Ытамм гибридных клеток 3GgDs нится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером BCKK(II) 375Dt

Штамм характеризуется следующими свойствами.

Морфологические признаки Культура состоит из слабоприкрепляющихся к субстрату округлых клеток размером с исходную миеломную клетку„ Ядро занимает большую часть клетки. ЦитЬо - ппазма имеет вид тонкого ободка„

,. Q

0

5

Культуральные свойства Среда культивирования: Среда RPMI-1640 с добавлением следующих компонентов: 10% по объему эмбриональной сыворот- ки теленка; 20 мл/л 200 мМ L-глютаг- мина; 3,375 г/л HEPES; 0,5 мл/л 0,1 М 2-меркаптоэтанола; пирувата натрия; 100 ЕД/мл пеницил лина, 10 мкг/мп стрептомицина; 3,7 г/л бикарбоната натрия. Клетки культивируют при 37°С в атмосфере с 5% С0Ј Характер роста - стацйо - нарная суспензия о Посевная концент рация клеток 2-10ь клеток в 1 мл„ Частота пассирования через сутс Щ)и внутрибрюшинной прививке си№- генным мышам штамм гибридомы образует опухоль в асцитной форме на 10-14 день о Доза клеток при привив - ке 2-10 о За 7-14 дней до введения гибридомы необходимо инъецировать животным 2,6,10,14 тетраметилпента декан в дозе 0,5 мл на голову Штамм сохраняет способность продуцировать специфические моноклональные тела в течение 5 пассажей на генных мышах (время наблюдения).

Продуктивность штамма„ На день культивирования гибридомы концентра - ция МонАТ достигает 10 мкг/мл в культуральной среде В очищенной ас5- цитной жидкости концентрация иммуно глобулинов составляет 4 мг/мл

Характеристика полезного продукта МонАТ относятся к иммуноглобулинам подкласса G2b, МонАТ специфически взаимодействуют с нуклеокапсидным белком молекулярной массы 53 КДа„ Специфичность определяют методом чммуноблотинга„

гКонтаминацияо Контаминантов в клетках, включая бактерии, грибы, дрожжи и микоплазму, не обнаружено

Криоконсервация, К осадку гибрид - ных клеток добавляют эмбриональную сыворотку теленка, а затем диметил- сульфоксид до конечной концентрации 10%. Суспензию клеток разливают в стерильные пластиковые ампулы с заг- винчивающимися крышками по 2. 10б ток в объеме 1 мл Ампулы помещают в коробку из пенопласта и оставляют на 1 сут при «-70°С, затем переносят в жидкий азотс

Условия размораживания, Заморо«- женную ампулу быстро помещают в во дяную баню на 37°С„ Как только рас«тают последние кусочки льда, суспензию клеток переносят стерильной пи«- петкой в центрифужную пробирку, cot- держащую 10 мл холодной бессывороточ - ной среды, отмывают один раз и засе«- вают в ячейки 24 -луночной планшеты с питающим слоем перитонеальных макро- фагов Число жизнеспособных клеток после размораживания не менее 70%0

Штамм гибридомы используют следующим образом

Пример 1 о Гибридные клетки помещают в пластиковые матрасы пло - щадью 25 см2 по 5105 клс в 5 мл питательной среды, инкубируют дня при 37°С в атмосфере с 5% С02„ туральную среду собирают, центрифу - гируют 10 мин при 800 g с целью отде ления клеток от надосадочной жидкос - ти - супернатанта, содержащего антитела . При культивировании гибридомы на мышах иммуноглобулины из асцитной жидкости получают осаждением сульфа«- том аммония до 50% насыщения Для этого в асцитную жидкость добавляют равньй объем 0,15 М фосфатно -буфер - ного раствора (ФБР), рН 7,2, Затем добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и оставляют при перемешивании на ночь при 4°С Иммуноглобулины отделяют центрифугированием при 5000 g в течение 30 мин при 4°С Осадок антител ресуспенди- руют в минимальном объеме ФБР о Далее очистку антител проводят на колонке с протеин А-сефарозой СЬт4В Для го на уравновешенную связывающим буфером колонку (1,5 М глицин, 3 М NaCl доводят до рН 8.95М NaOH) вносят по 4 мг/мл осажденных сульфатом аммония препаратов иммуноглобулинов, колонку промывают связывающим буфером и антитела элюируют 0,1 М лимонной кислотой рН 4,00 Элюат нейтрализуют 1 М НС1 буфером, рН 8,1 о Очищенный препарат антител концентрируют ультра- фильтрацией через мембрану рМ 100 Полученные препараты - супернатант и очищенную асцитную жидкость - исполы- ауют как реагенты для изучения специфичности взаимодействия МонАТ с тируемым антигеном с помощью метода ИФА о

Пример 2. На полистирольный 96 -яуночный планшет сорбируют щенный коронавирусный антиген в концентрации 1 мкг в 100 мкл 0,1 М карбонатного буфера, рН 9,5, инкуби руя при 4С в течение ночи. Планшет отмывают 3 раза 0,J5 M ФБР и ,3 раза 0,15 ФБР с 0,1% Твином-20 (ФБР-Тв), затем в ячейки планшета вносят кратные разведения культуральной ды или очищенной асцитной жидкости в количестве 100 мкл и инкубируют в течение 90 мин при 37°Со Планшет от мывают, как описано выше, и вносят в ячейки антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена Через 1 ч инку:- бации при 37°С повторяют процедуру

5 отмывки с целью удаления несвязен - ных продуктов реакции Связавшийся конъюгант, а значит,и антитела про«- тив коронавируса определяют количественно по распаду субстрата

0 в присутствии ортофенилендиамина Учитывают результат по интенсивности окрашивания реакционной смеси в желто-коричневый цвет, считывают на спектрофотометре с вертикальным

5 потоком света при длине волны 492 нм„ Результаты ИФА показывают, что если титр антител в культуральной среде в первый день пересева гибридомы составляет 1:8, то после 3 сут титр

0 повышается до 1:256 Титр антител в очищенной асцитной жидкости равняет«- ся 1:512000 Это свидетельствует о том, что гибридома продуцирует пифические МонАТ с коронавирусом КРС

Пример зуют в варианте количественного определения корона - вирусного антигена Для этого на по«0 листирольный 96-луночный планшет сорбируют очищенные осаждением суль«- фатом аммония МонАТ в концентрации 1 мкг в 100 мкл 0,1 М бикарбонатного буфера рН 9,5, инкубируя при 4°С в

5 течение ночи Планшет отмывают,как описано в примере 2 В ячейки планше - та вносят двукратные разведения с концентрацией 10 мкг/мл коронавирус ного антигена в объеме 100 мкл и йде0 кубируют в течение 90 мин при 37°С Планшет отмывают и в ячейки вносят вторые МонАТ к короновирусам КРС, конъюгированные с пероксидазой на При этом на полистирольной верхности планшеты образуется комп«- лекс: МонАТ - коронавирусный антиген « вторые МонАТ, конъюгированные с пероксидазой хрена„ Через 1 ч И№5

3. МонАТ ЗСБ исполь- сэндвича ИФА для

кубации при 37 С повторяют процедуру

716665328

отмывки с целью удаления несвязан - iпоказывают, что с использованием

них продуктов реакции Образовавший -МонАТ в варианте сэндвича выявляет ей комплекс, а значит, и коронавирус -ся до 10 нг/мл вирусного белка, ный антиген, определяют количествен -но по распаду субстрата Н402 в при -Формула изобретения сутствии ортофенилендиамина УчитывавШтамм гибридных культивируемых

ют- результат по интенсивности окра -клеток животных Musmusculus L.

шивания реакционной смеси в ж ел тог-BCKK(II) 375D, продуцирующий моно

коричневый цвет на спектрофотометре jgклонапьные антитела к нуклеокапсид с вертикальным потоком света приному белку коронавируса крупного ро

длине волны 492 нм Результаты ИФАгатого скота

Похожие патенты SU1666532A1

название год авторы номер документа
Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L., продуцирующий моноклональные антитела к поверхностному белку коронавируса крупного рогатого скота 1989
  • Муканов Касым Касенович
  • Несмеянов Владимир Андреевич
  • Гоголев Михаил Михайлович
  • Соколова Надежда Львовна
  • Надточей Григорий Андреевич
  • Булашев Айтбай Кабыкешович
  • Байтубаев Тутсун Габдуллаевич
SU1661231A1
Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L., продуцирующий моноклональные антитела к бактериям рода BRUceLLa 1988
  • Булашев Айтбай Кабыкешович
  • Несмеянов Владимир Андреевич
  • Дмитриев Анатолий Федорович
  • Муканов Касым Касенович
  • Байтубаев Турсун Габдулаевич
  • Ромахов Вадим Александрович
  • Касьянов Алексей Николаевич
SU1604849A1
Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L. - продуцент моноклональных антител к бактериям рода BRUceLLa 1988
  • Булашев Айтбай Кабыкешович
  • Несмеянов Владимир Андреевич
  • Дмитриев Анатолий Федорович
  • Муканов Касым Касенович
  • Байтубаев Турсун Габдулаевич
  • Ромахов Вадим Александрович
  • Касьянов Алексей Николаевич
SU1604848A1
Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L.-продуцент моноклональных антител к К99 адгезивному антигену ЕSснеRIснIа coLI 1990
  • Муканов Касым Касенович
  • Мукантаев Канатбек Найзабекович
  • Сырманов Тугельбай Оразбаевич
  • Кенжебулатов Болат Нургабулович
  • Шегидевич Эдуард Алиевич
  • Соколова Нина Аркадьевна
SU1773938A1
Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый для получения моноклональных антител к поверхностному антигену возбудителя туляремии голарктической расы 1988
  • Новохатский Александр Сергеевич
  • Козловский Виктор Николаевич
  • Черепахина Ирина Яковлевна
  • Алексеева Людмила Павловна
  • Соколов Валерий Григорьевич
SU1541253A1
Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый для получения моноклональных антител к термостабильному О-антигену холерного вибриона серовара Огава 1988
  • Бурлакова Ольга Спартаковна
  • Алексеева Людмила Павловна
  • Новохатский Александр Сергеевич
  • Бичуль Константин Георгиевич
SU1541254A1
ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ Mus. musculus L - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К О-АНТИГЕНУ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ О1 СЕРОГРУППЫ 2010
  • Алексеева Людмила Павловна
  • Евдокимова Вероника Вячеславовна
  • Фатеева Оксана Фёдоровна
RU2425874C1
Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS - продуцент моноклональных антител к фактору некроза опухоли @ человека 1988
  • Беркова Надежда Петровна
  • Коробко Вячеслав Григорьевич
  • Шамборант Ольга Георгиевна
  • Добрынин Владимир Николаевич
  • Чувпило Сергей Альбертович
SU1585329A1
Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L - продуцент моноклонального антитела к щелочной фосфатазе тюленя 1989
  • Сахаров Иван Юрьевич
  • Мечетнер Евгений Борисович
  • Степанова Ирина Евгеньевна
SU1744112A1
Штамм гибридных клеток животных MUS MUScULIS, используемый для получения моноклональных антител к гемагглютинину вируса кори 1987
  • Анджапаридзе Отар Георгиевич
  • Нагиева Фирая Галиевна
  • Мальцева Неля Николаевна
  • Ведунова Светлана Леонардовна
  • Звонарев Анатолий Юрьевич
  • Краснова Нина Ивановна
  • Никулина Вера Григорьевна
  • Баркова Елена Петровна
  • Эткинд Галина Владимировна
  • Кузнецова Елена Ивановна
  • Ходоровская Елена Глебовна
SU1518369A1

Реферат патента 1991 года Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L., продуцирующий моноклональные антитела к нуклеокапсидному белку коронавируса крупного рогатого скота

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для диагностики желудочно-кишечных заболеваний животных, вызываемых коронавирусом. Целью изобретения является получение штамма гибридных клеток, продуцирующего моноклональные антитела /МоН/АТ/ к нуклеокапсидному белку /НП-53/ коронавируса крупного рогатого скота /КРС/. Штамм получают гибридизацией миеломных клеток линии Х - 63 AG 86. 5. 3 со спленоцитами мышей, иммунизированных коронавирусом крупного рогатого скота. Полученный штамм 3 G6 D5 секрецирует и МонАТ JG2B, специфически взаимодействующие с белком НП - 53 коронавируса КРС. Штамм депонирован под номером ВСКК /П/ 375 Д и характеризуется типичными для гибридов культуральными свойствами: среда культивирования R PMJ - 1640 с 10-ой% эмбриональной сыворотки теленка, посевная концентрация - 2.105 клеток в 1 мл, частота пассирования 2 - 3 сут. Продуктивность штамма 10 мкг/мл МонАТ в культуральной среде и 4 мг/мл в асците.

Формула изобретения SU 1 666 532 A1

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 1991 года SU1666532A1

Derect D0 et al
- I; Gen
Virology, 1987, v
Способ получения смеси хлоргидратов опийных алкалоидов (пантопона) из опийных вытяжек с любым содержанием морфия 1921
  • Гундобин П.И.
SU68A1

SU 1 666 532 A1

Авторы

Муканов Касым Касенович

Несмеянов Владимир Андреевич

Гоголев Михаил Михайлович

Соколова Надежда Львовна

Надточей Григорий Андреевич

Булашев Айтбай Кабыкешович

Байтубаев Турсын Габдуллаевич

Даты

1991-07-30Публикация

1989-05-16Подача