Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L., продуцирующий моноклональные антитела к нуклеокапсидному белку коронавируса крупного рогатого скота Советский патент 1991 года по МПК C12N5/18 C12P21/08 

гена с неполным адъювантом Фрейнда Последнюю иммунизацию проводят 50 мкг антигена в 0,15 М фосфатно -буферном растворе, рН 7,2, и через 3 дня клёт ки селезенки используют для гибриди - 5ации. Гибридизацию проводят добавле - нием к смеси 4 106 миеломных клеток 28 Ч О6 спленоцитов 1 мл раствора, Содержащего 45% ПЭГг-4000, 10% илсульфоксида и 45% среды RPMI-1640 Ьливающий агент вносят в течение 15 с, затем медленно перемешивают клетки в течение 60 с и в течение 15 с добавляют 10 мл среды RPMI-1640r Затем оставляют для инкубации на 10 мино После этого клетки осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин. Осадок клеток суспендируют в среде RPMI-1640 с бавлением 10% по объему эмбриональной сыворотки теленка и высевают в луночные планшеты по 100 мкл на лунку. На второй день после слияния добавляют селективную среду с гипоксанти ном, аминоптерином и тимидином (ГАТ) Через 1СЫ4 дней из лунок, где выросли клоны клеток, отбирают культу ральную жидкость для тестирования на активность, т.е на продукцию ан тителс Продукцию специфических антител, синтезируемых гибридными клетка - ми, определяют методом иммунофер - ментного анализа (ИФА) с использоваг- нием кроличьих антител к иммуногло- булинам мышей, конъюгированных с перо сидазой хрена и коронавирусного антш- гена, очищенного в градиенте плотнос - ти сахарозы Гибридные клетки, про - цуцирующие МонАТ, клонируют два раза методом лимитирующих разведений с.После второго клонирования 100% субклонов продуцируют антитела к тестируемому антигену Штамм клеток секретирует антитела в культуральную среду или асцитную жидкостьо

Ытамм гибридных клеток 3GgDs нится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером BCKK(II) 375Dt

Штамм характеризуется следующими свойствами.

Морфологические признаки Культура состоит из слабоприкрепляющихся к субстрату округлых клеток размером с исходную миеломную клетку„ Ядро занимает большую часть клетки. ЦитЬо - ппазма имеет вид тонкого ободка„

,. Q

0

5

Культуральные свойства Среда культивирования: Среда RPMI-1640 с добавлением следующих компонентов: 10% по объему эмбриональной сыворот- ки теленка; 20 мл/л 200 мМ L-глютаг- мина; 3,375 г/л HEPES; 0,5 мл/л 0,1 М 2-меркаптоэтанола; пирувата натрия; 100 ЕД/мл пеницил лина, 10 мкг/мп стрептомицина; 3,7 г/л бикарбоната натрия. Клетки культивируют при 37°С в атмосфере с 5% С0Ј Характер роста - стацйо - нарная суспензия о Посевная концент рация клеток 2-10ь клеток в 1 мл„ Частота пассирования через сутс Щ)и внутрибрюшинной прививке си№- генным мышам штамм гибридомы образует опухоль в асцитной форме на 10-14 день о Доза клеток при привив - ке 2-10 о За 7-14 дней до введения гибридомы необходимо инъецировать животным 2,6,10,14 тетраметилпента декан в дозе 0,5 мл на голову Штамм сохраняет способность продуцировать специфические моноклональные тела в течение 5 пассажей на генных мышах (время наблюдения).

Продуктивность штамма„ На день культивирования гибридомы концентра - ция МонАТ достигает 10 мкг/мл в культуральной среде В очищенной ас5- цитной жидкости концентрация иммуно глобулинов составляет 4 мг/мл

Характеристика полезного продукта МонАТ относятся к иммуноглобулинам подкласса G2b, МонАТ специфически взаимодействуют с нуклеокапсидным белком молекулярной массы 53 КДа„ Специфичность определяют методом чммуноблотинга„

гКонтаминацияо Контаминантов в клетках, включая бактерии, грибы, дрожжи и микоплазму, не обнаружено

Криоконсервация, К осадку гибрид - ных клеток добавляют эмбриональную сыворотку теленка, а затем диметил- сульфоксид до конечной концентрации 10%. Суспензию клеток разливают в стерильные пластиковые ампулы с заг- винчивающимися крышками по 2. 10б ток в объеме 1 мл Ампулы помещают в коробку из пенопласта и оставляют на 1 сут при «-70°С, затем переносят в жидкий азотс

Условия размораживания, Заморо«- женную ампулу быстро помещают в во дяную баню на 37°С„ Как только рас«тают последние кусочки льда, суспензию клеток переносят стерильной пи«- петкой в центрифужную пробирку, cot- держащую 10 мл холодной бессывороточ - ной среды, отмывают один раз и засе«- вают в ячейки 24 -луночной планшеты с питающим слоем перитонеальных макро- фагов Число жизнеспособных клеток после размораживания не менее 70%0

Штамм гибридомы используют следующим образом

Пример 1 о Гибридные клетки помещают в пластиковые матрасы пло - щадью 25 см2 по 5105 клс в 5 мл питательной среды, инкубируют дня при 37°С в атмосфере с 5% С02„ туральную среду собирают, центрифу - гируют 10 мин при 800 g с целью отде ления клеток от надосадочной жидкос - ти - супернатанта, содержащего антитела . При культивировании гибридомы на мышах иммуноглобулины из асцитной жидкости получают осаждением сульфа«- том аммония до 50% насыщения Для этого в асцитную жидкость добавляют равньй объем 0,15 М фосфатно -буфер - ного раствора (ФБР), рН 7,2, Затем добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и оставляют при перемешивании на ночь при 4°С Иммуноглобулины отделяют центрифугированием при 5000 g в течение 30 мин при 4°С Осадок антител ресуспенди- руют в минимальном объеме ФБР о Далее очистку антител проводят на колонке с протеин А-сефарозой СЬт4В Для го на уравновешенную связывающим буфером колонку (1,5 М глицин, 3 М NaCl доводят до рН 8.95М NaOH) вносят по 4 мг/мл осажденных сульфатом аммония препаратов иммуноглобулинов, колонку промывают связывающим буфером и антитела элюируют 0,1 М лимонной кислотой рН 4,00 Элюат нейтрализуют 1 М НС1 буфером, рН 8,1 о Очищенный препарат антител концентрируют ультра- фильтрацией через мембрану рМ 100 Полученные препараты - супернатант и очищенную асцитную жидкость - исполы- ауют как реагенты для изучения специфичности взаимодействия МонАТ с тируемым антигеном с помощью метода ИФА о

Пример 2. На полистирольный 96 -яуночный планшет сорбируют щенный коронавирусный антиген в концентрации 1 мкг в 100 мкл 0,1 М карбонатного буфера, рН 9,5, инкуби руя при 4С в течение ночи. Планшет отмывают 3 раза 0,J5 M ФБР и ,3 раза 0,15 ФБР с 0,1% Твином-20 (ФБР-Тв), затем в ячейки планшета вносят кратные разведения культуральной ды или очищенной асцитной жидкости в количестве 100 мкл и инкубируют в течение 90 мин при 37°Со Планшет от мывают, как описано выше, и вносят в ячейки антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена Через 1 ч инку:- бации при 37°С повторяют процедуру

5 отмывки с целью удаления несвязен - ных продуктов реакции Связавшийся конъюгант, а значит,и антитела про«- тив коронавируса определяют количественно по распаду субстрата

0 в присутствии ортофенилендиамина Учитывают результат по интенсивности окрашивания реакционной смеси в желто-коричневый цвет, считывают на спектрофотометре с вертикальным

5 потоком света при длине волны 492 нм„ Результаты ИФА показывают, что если титр антител в культуральной среде в первый день пересева гибридомы составляет 1:8, то после 3 сут титр

0 повышается до 1:256 Титр антител в очищенной асцитной жидкости равняет«- ся 1:512000 Это свидетельствует о том, что гибридома продуцирует пифические МонАТ с коронавирусом КРС

Пример зуют в варианте количественного определения корона - вирусного антигена Для этого на по«0 листирольный 96-луночный планшет сорбируют очищенные осаждением суль«- фатом аммония МонАТ в концентрации 1 мкг в 100 мкл 0,1 М бикарбонатного буфера рН 9,5, инкубируя при 4°С в

5 течение ночи Планшет отмывают,как описано в примере 2 В ячейки планше - та вносят двукратные разведения с концентрацией 10 мкг/мл коронавирус ного антигена в объеме 100 мкл и йде0 кубируют в течение 90 мин при 37°С Планшет отмывают и в ячейки вносят вторые МонАТ к короновирусам КРС, конъюгированные с пероксидазой на При этом на полистирольной верхности планшеты образуется комп«- лекс: МонАТ - коронавирусный антиген « вторые МонАТ, конъюгированные с пероксидазой хрена„ Через 1 ч И№5

3. МонАТ ЗСБ исполь- сэндвича ИФА для

кубации при 37 С повторяют процедуру

716665328

отмывки с целью удаления несвязан - iпоказывают, что с использованием

них продуктов реакции Образовавший -МонАТ в варианте сэндвича выявляет ей комплекс, а значит, и коронавирус -ся до 10 нг/мл вирусного белка, ный антиген, определяют количествен -но по распаду субстрата Н402 в при -Формула изобретения сутствии ортофенилендиамина УчитывавШтамм гибридных культивируемых

ют- результат по интенсивности окра -клеток животных Musmusculus L.

шивания реакционной смеси в ж ел тог-BCKK(II) 375D, продуцирующий моно

коричневый цвет на спектрофотометре jgклонапьные антитела к нуклеокапсид с вертикальным потоком света приному белку коронавируса крупного ро

длине волны 492 нм Результаты ИФАгатого скота

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для диагностики желудочно-кишечных заболеваний животных, вызываемых коронавирусом. Целью изобретения является получение штамма гибридных клеток, продуцирующего моноклональные антитела /МоН/АТ/ к нуклеокапсидному белку /НП-53/ коронавируса крупного рогатого скота /КРС/. Штамм получают гибридизацией миеломных клеток линии Х - 63 AG 86. 5. 3 со спленоцитами мышей, иммунизированных коронавирусом крупного рогатого скота. Полученный штамм 3 G₆ D₅ секрецирует и МонАТ JG2B, специфически взаимодействующие с белком НП - 53 коронавируса КРС. Штамм депонирован под номером ВСКК /П/ 375 Д и характеризуется типичными для гибридов культуральными свойствами: среда культивирования R PMJ - 1640 с 10-ой% эмбриональной сыворотки теленка, посевная концентрация - 2^.10⁵ клеток в 1 мл, частота пассирования 2 - 3 сут. Продуктивность штамма 10 мкг/мл МонАТ в культуральной среде и 4 мг/мл в асците.