ГЕННО-ИНЖЕНЕРНАЯ КОНСТРУКЦИЯ VEGF-ИБМЕД (VEGF-IBMED) Российский патент 2007 года по МПК A61K48/00 C12N15/85 A61P9/14 

Изобретение относится к лекарственным средствам, содержащим генетический материал.

VEGF, также известный как фактор проницаемости сосудов (VPF), образуется сосудистыми клетками гладких миоцитов. Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF, ФРЭС) является митогенным белковым фактором, главным образом - для клеток эндотелия кровеносных сосудов. VEGF имеет значительное структурное сходство с фактором роста тромбоцитов, однако в отличие от факторов роста тромбоцитов, фибробластов и др. VEGF имеет высокую специфичность именно к клеткам эндотелия.

На основе анализа транскриптов этих клеток при помощи PCR кДНК и последующего клонирования были выявлены 3 вида кДНК VEGF: 189, 165 и 121 аминокислот. При использовании RT-PCR в раковых клетках был выявлен VEGF, содержащий 145 аминокислот, с нехваткой экзона 7.

VEGF является прототипным геном/белком группы факторов роста, в которую входит несколько схожих генов/белков. Ген VEGF содержит 8 экзонов. Различные формы VEGF являются результатом альтернативного сплайсинга, форма 165 аминокислот лишена экзона 6, а форма 121 аминокислота - экзонов 6 и 7.

VEGF, гомодимерный гликопротеин с молекулярной массой 45000, является единственным митогеном, особенно воздействующим на эндотелиальные клетки. Он может служить основным регулятором in vivo опухолевого ангиогенеза. Было выявлено, что его экспрессия стимулируется гипоксией и что его рецептор, Flk1, эспрессирует исключительно на поверхности эндотелиальных клеток.

VEGF и плацентарный фактор роста представляют собой семейство регуляторных пептидов, способных контролировать образование кровеносных сосудов и их проницаемость, взаимодействуя с 2 рецепторами, являющимися эндотелиальными тирозинкиназами, FLT1 и KDR/FLK1. Третьим представителем этого семейства может быть лиганд рецептора FLT4, участвующий в развитии лимфатических сосудов.

VEGF является возможным регулирующим фактором, усиливающим транспорт глюкозы через стенки сосудов. Во время гипогликемии VEGF, а не какой-либо другой протеиновый фактор связан с сохраненной нейрокогнитивной функцией, что было доказано тестами на состояние памяти.

VEGF может стимулировать растяжение, образование сосудистой сетки и разветвление непролиферирующих эндотелиальных клеток, лишенных кислорода и питательных веществ. В связи с тем что эндотелиальные клетки находятся в хронических гипоксических условиях, предполагается, что VEGF приводит к образованию новых кровеносных сосудов.

Необходимость использования генно-инженерной конструкции VEGF-ИБМед связана с тем, что при многих заболеваниях человека, прежде всего - при ишемическом поражении артерий нижних конечностей, формирование de novo элементов сосудистой сети способно восстановить кровоснабжение пораженных тканей и вызвать стабильный положительный эффект.

Принцип действия генно-инженерной конструкции VEGF-ИБМед основан на том, что препарат вводится в венозный кровоток больного, за этим следует спонтанная трансфекция клеток эндотелия и экспрессия гена VEGF. Экспрессия, то есть синтез РНК VEGF, определяется наличием сильного эукариотического промотора - немедленного раннего промотора CMV. Далее РНК подвергается процессингу и на ней происходит синтез белка VEGF, который проявляет свою нормальную биологическую активность как фактор роста сосудов.

Такие работы широко проводятся во всем мире. Одна из последних опубликованных работ, H.-J.Kirn и соавт., приведена как пример клинического использования плазмиды, содержащей VEGF. (Exp Mol Med. 2004 Aug 31; 36(4):336-44, Vascular endothelial growth factor-induced angiogenic gene therapy in patients with peripheral artery disease, Kim HJ, Jang SY, Park JI, Byun J, Kim DI, Do YS, Kim JM, Kim S, Kim BM, Kim WB, Kim DK.)

Существенно, что до сегодняшнего дня не зарегистрировано серьезных отрицательных или побочных эффектов плазмид, содержащих VEGF, или осложнений после их применения. Работа Baumgartner и соавт. приведена как описание единственного описанного варианта осложнений при терапии с использованием плазмиды, содержащей VEGF - временное увеличение проницаемости сосудов, вызывающее небольшой отек. (Circulation. 1998; 97:1114-1123, Constitutive Expression ofphVEGF₁₆₅ After Intramuscular Gene Transfer Promotes Collateral Vessel Development in Patients With Critical Limb Ischemia, Iris Baumgartner, MD; Ann Pieczek, RN; Orit Manor, PhD; Richard Blair, MD; Marianne Kearney, BS; Kenneth Walsh, PhD;; Jeffrey M. Isner, MD).

Задачей настоящего изобретения является создание эффективной и безопасной генно-инженерной конструкции VEGF-ИБМед.

Для решения поставленной задачи предложена генно-инженерная конструкция VEGF-ИБМед.

Генно-инженерная конструкция VEGF-ИБМед, представляющая собой экспрессионную векторную плазмиду, в которой клонирована вставка ДНК, кодирующая фактор роста эндотелия сосудов в трех его формах, содержит:

- Суммарную кольцевую ДНК длиной 4559/4427/4631 нуклеотидных пар.

- Основные элементы конструкции VEGF-ИБМед.

- Конструкция pCMV-VEGF сплайсинг-вариант 165-4559 bp

- Конструкция pCMV-VEGF сплайсинг-вариант 121-4427 bp

- Конструкция pCMV-VEGF сплайсинг-вариант 189-4631 bp

- Человеческая VEGF - кДНК, клонирована в векторной плазмиде pEGFP-N2 с удаленным геном GPF по сайтам рестрикции EcoRI/SmaI.

- Регуляторные элементы трансляции конструкции:

- Инициация - nt 649

- Терминация - nt 1221 (А165).

- Селективный маркер для размножения плазмиды в бактериальном хозяине

- E.coli штамм XL1 Blue MRF' - Kn (при 25 мкг/мл).

- Регуляторные элементы для экспрессия в эукариотических клетках:

- CMV немедленный ранний промотор,

- SV40 концевой интрон,

- poly(А)-сигнал.

Конструкция VEGF-ИБМед представляет собой экспрессионную векторную плазмиду, в которой клонирована вставка ДНК, кодирующая фактор роста эндотелия сосудов в различных его формах.

Для конструкции использован оригинальный эукариотический челночный экспрессионный вектор, основанный на плазмиде pUC-19. Вектор содержит участок промотор/энхансер CMV и участок сплайсинга/полиаденилирования SV40. Прототипом данной векторной плазмиды является плазмида pBKCMV. Вставка представляет собой кДНК для VEGF человека (фактор роста эндотелия сосудов человека, 189, 165 и 121 аминокислота).

Изоформы 165, 121 и 189 аминокислот получили в результате альтернативного сплайсинга гена васкулярно-эндотелиального фактора роста человека. Данный сплайсинг-вариант генерирован с помощью ОТ-ПЦР с использованием в качестве матрицы поли-A+РНК человека и проверен секвенированием по обеим цепям продукта. Обнаружены 2 замены в третьем нуклеотиде триплетов, не изменяющие аминокислотую последовательность. Полученные кДНК клонированы в векторную плазмиду на основе pEGFP-N2 с удаленным геном GPF.

Эффективность (биологическая активность) конструкции проверена методом транзиторных трансфекций с использованием липидных комплексов Унифектин М на клетках линии НЕК293 чепловека. Уровень секреции оценен методом денатурирующего фореза с последующим переносом на мембрану и детекцией белка моноклональными антителами к VEGF (R&D). В качестве контроля использовался рекомбинантный белок rVEGF (Sigma). Эффективность трансфекций обеспечивала 1 мкг/мл/10⁶ клеток.

Функциональная активность была проверена эксперименте in vivo. Для этого транзиторно трансфицированные клетки были помещены в матригель, а матригель был имплантирован мыши. В качестве контроля были использованы клетки, трансфицированные пустым вектором. В экспериментальной группе в матригеле наблюдалось активное прорастание капиляров животного. Контрольный матригель васкуляризован не был.

В настоящее время в мире используется ряд подобных конструкций, где в качестве вставки использована кДНК VEGF-165, а в качестве вектора -различные плазмиды или аденовирус птичьего происхождения (см. приведенные выше ссылки Kim и соавт., Baumgartner и соавт.). По сравнению с существующими аналогами, генно-инженерная конструкция VEGF-ИБМед обладает двумя основными преимуществами.

Во-первых, для ее создания использован плазмидный, а не вирусный вектор. Этот факт в высшей степени важен, поскольку для наращивания генно-инженерных конструкций в вирусных векторах необходимо использовать либо культуру клеток птичьего происхождения, либо птичьи, как правило - куриные, яйца. Оба эти варианта имеют важные недостатки. Использование техники клеточных культур очень дорого, практически оно не позволяет достичь приемлемой цены при выпуске конечного продукта на рынок. Культивирование на куриных эмбрионах существенно дешевле, но в этом случае возникает опасность либо попадания в препарат собственных эндогенных птичьих вирусов, либо рекомбинации конструкции с этими эндогенными птичьими вирусами. В обоих случаях возможно искажение свойств конечного препарата, причем весьма реальной является опасность появления свойств, опасных для человека.

Во-вторых, эффективность генно-инженерной конструкции VEGF-ИБМед выше, чем у многих ее аналогов, поскольку в ней использован немедленный ранний CMV промотор, который является самым сильным из известных в настоящее время природных эукариотических промоторов.

Таким образом, конструкция VEGF-ИБМед имеет важные преимущества как с точки зрения безопасности, так и с точки зрения экономичности ее использования.

Структура конструкции VEGF-ИБМед принципиально отличается нуклеотидной последовательностью в промоторной области вектора от всех существующих аналогов.

Нуклеотидная последовательность сплайсинг-варианта 165-4559 bp.

1 TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC ATTAGTTCAT AGCCCATATA TGGAGTTCCG

61 CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCTGACCG CCCAACGACC CCCGCCCATT

121 GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT AACGCCAATA GGGACTTTCC ATTGACGTCA

181 ATGGGTGGAG TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT ATCATATGCC

241 AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT ATGCCCAGTA

301 CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC GTATTAGTCA TCGCTATTAC

361 CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA TGGGCGTGGA TAGCGGTTTG ACTCACGGGG

421 ATTTCCAAGT CTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTG TTTTGGCACC AAAATCAACG

481 GGACTTTCCA AAATGTCGTA ACAACTCCGC CCCATTGACG CAAATGGGCG GTAGGCGTGT

541 ACGGTGGGAG GTCTATATAA GCAGAGCTGG TTTAGTGAAC CGTCAGATCC GCTAGCGCTA

601 CCGGACTCAG ATCTCGAGCT CAAGCTTCGA ATTCgggcct ccgaaaccat gaactttctg

661 ctgtcttggg tgcattggag ccttgccttg ctgctctacc tccaccatgc caagtggtcc

721 caggctgcac ccatggcaga aggaggaggg cagaatcatc acgaagtggt gaagttcatg

781 gatgtctatc agcgcacgta ctgccatcca atcgagaccc tggtggacat cttccaggag

841 taccctgatg agatcgagta catcttcaag ccatcctgtg tgcccctgat gcgatgcggg

901 ggctgctgca atgacgaggg cctggagtgt gtgcccactg aggagtccaa catcaccatg

961 cagattatgc ggatcaaacc tcaccaaggc cagcacatag gagagatgag cttcctacag

1021 cacaacaaat gtgaatgcag accaaagaaa gatagagcaa gacaagaaaa tccctgtggg

1081 ccttgctcag agcggagaaa gcatttgttt gtacaagatc cgcagacgtg taaatgttcc

1141 tgcaaaaaca cagactcgcg ttgcaaggcg aggcagcttg agttaaacga acgtacttgc

1201 agatgtgaca agccgaggcg gtgaCCCGGC CGCGACTCTA GATCATAATC AGCCATACCA

1261 CATTTGTAGA GGTTTTACTT GCTTTAAAAA ACCTCCCACA CCTCCCCCTG AACCTGAAAC

1321 ATAAAATGAA TGCAATTGTT GTTGTTAACT TGTTTATTGC AGCTTATAAT GGTTACAAAT

1381 AAAGCAATAG CATCACAAAT TTCACAAATA AAGCATTTTT TTCACTGCAT TCTAGTTGTG

1441 GTTTGTCCAA ACTCATCAAT GTATCTTAAG GCGTAAATTG TAAGCGTTAA TATTTTGTTA

1501 AAATTCGCGT TAAATTTTTG TTAAATCAGC TCATTTTTTA ACCAATAGGC CGAAATCGGC

1561 AAAATCCCTT ATAAATCAAA AGAATAGACC GAGATAGGGT TGAGTGTTGT TCCAGTTTGG

1621 AACAAGAGTC CACTATTAAA GAACGTGGAC TCCAACGTCA AAGGGCGAAA AACCGTCTAT

1681 CAGGGCGATG GCCCACTACG TGAACCATCA CCCTAATCAA GTTTTTTGGG GTCGAGGTGC

1741 CGTAAAGCAC TAAATCGGAA CCCTAAAGGG AGCCCCCGAT TTAGAGCTTG ACGGGGAAAG

1801 CCGGCGAACG TGGCGAGAAA GGAAGGGAAG AAAGCGAAAG GAGCGGGCGC TAGGGCGCTG

1861 GCAAGTGTAG CGGTCACGCT GCGCGTAACC ACCACACCCG CCGCGCTTAA TGCGCCGCTA

1921 CAGGGCGCGT CAGGTGGCAC TTTTCGGGGA AATGTGCGCG GAACCCCTAT TTGTTTATTT

1981 TTCTAAATAC ATTCAAATAT GTATCCGCTC ATGAGACAAT AACCCTGATA AATGCTTCAA

2041 TAATATTGAA AAAGGAAGAG TCCTGAGGCG GAAAGAACCA GCTGTGGAAT GTGTGTCAGT

2101 TAGGGTGTGG AAAGTCCCCA GGCTCCCCAG CAGGCAGAAG TATGCAAAGC ATGCATCTCA

2161 ATTAGTCAGC AACCAGGTGT GGAAAGTCCC CAGGCTCCCC AGCAGGCAGA AGTATGCAAA

2221 GCATGCATCT CAATTAGTCA GCAACCATAG TCCCGCCCCT AACTCCGCCC ATCCCGCCCC

2281 TAACTCCGCC CAGTTCCGCC CATTCTCCGC CCCATGGCTG ACTAATTTTT TTTATTTATG

2341 CAGAGGCCGA GGCCGCCTCG GCCTCTGAGC TATTCCAGAA GTAGTGAGGA GGCTTTTTTG

2401 GAGGCCTAGG CTTTTGCAAA GATCGATCAA GAGACAGGAT GAGGATCGTT TCGCATGATT

2461 GAACAAGATG GATTGCACGC AGGTTCTCCG GCCGCTTGGG TGGAGAGGCT ATTCGGCTAT

2521 GACTGGGCAC AACAGACAAT CGGCTGCTCT GATGCCGCCG TGTTCCGGCT GTCAGCGCAG

2581 GGGCGCCCGG TTCTTTTTGT CAAGACCGAC CTGTCCGGTG CCCTGAATGA ACTGCAAGAC

2641 GAGGCAGCGC GGCTATCGTG GCTGGCCACG ACGGGCGTTC CTTGCGCAGC TGTGCTCGAC

2701 GTTGTCACTG AAGCGGGAAG GGACTGGCTG CTATTGGGCG AAGTGCCGGG GCAGGATCTC

2761 CTGTCATCTC ACCTTGCTCC TGCCGAGAAA GTATCCATCA TGGCTGATGC AATGCGGCGG

2821 CTGCATACGC TTGATCCGGC TACCTGCCCA TTCGACCACC AAGCGAAACA TCGCATCGAG

2881 CGAGCACGTA CTCGGATGGA AGCCGGTCTT GTCGATCAGG ATGATCTGGA CGAAGAGCAT

2941 CAGGGGCTCG CGCCAGCCGA ACTGTTCGCC AGGCTCAAGG CGAGCATGCC CGACGGCGAG

3001 GATCTCGTCG TGACCCATGG CGATGCCTGC TTGCCGAATA TCATGGTGGA AAATGGCCGC

3061 TTTTCTGGAT TCATCGACTG TGGCCGGCTG GGTGTGGCGG ACCGCTATCA GGACATAGCG

3121 TTGGCTACCC GTGATATTGC TGAAGAGCTT GGCGGCGAAT GGGCTGACCG CTTCCTCGTG

3181 CTTTACGGTA TCGCCGCTCC CGATTCGCAG CGCATCGCCT TCTATCGCCT TCTTGACGAG

3241 TTCTTCTGAG CGGGACTCTG GGGTTCGAAA TGACCGACCA AGCGACGCCC AACCTGCCAT

3301 CACGAGATTT CGATTCCACC GCCGCCTTCT ATGAAAGGTT GGGCTTCGGA ATCGTTTTCC

3361 GGGACGCCGG CTGGATGATC CTCCAGCGCG GGGATCTCAT GCTGGAGTTC TTCGCCCACC

3421 CTAGGGGGAG GCTAACTGAA ACACGGAAGG AGACAATACC GGAAGGAACC CGCGCTATGA

3481 CGGCAATAAA AAGACAGAAT AAAACGCACG GTGTTGGGTC GTTTGTTCAT AAACGCGGGG

3541 TTCGGTCCCA GGGCTGGCAC TCTGTCGATA CCCCACCGAG ACCCCATTGG GGCCAATACG

3601 CCCGCGTTTC TTCCTTTTCC CCACCCCACC CCCCAAGTTC GGGTGAAGGC CCAGGGCTCG

3661 CAGCCAACGT CGGGGCGGCA GGCCCTGCCA TAGCCTCAGG TTACTCATAT ATACTTTAGA

3721 TTGATTTAAA ACTTCATTTT TAATTTAAAA GGATCTAGGT GAAGATCCTT TTTGATAATC

3781 TCATGACCAA AATCCCTTAA CGTGAGTTTT CGTTCCACTG AGCGTCAGAC CCCGTAGAAA

3841 AGATCAAAGG ATCTTCTTGA GATCCTTTTT TTCTGCGCGT AATCTGCTGC TTGCAAACAA

3901 AAAAACCACC GCTACCAGCG GTGGTTTGTT TGCCGGATCA AGAGCTACCA ACTCTTTTTC

3961 CGAAGGTAAC TGGCTTCAGC AGAGCGCAGA TACCAAATAC TGTCCTTCTA GTGTAGCCGT

4021 AGTTAGGCCA CCACTTCAAG AACTCTGTAG CACCGCCTAC ATACCTCGCT CTGCTAATCC

4081 TGTTACCAGT GGCTGCTGCC AGTGGCGATA AGTCGTGTCT TACCGGGTTG GACTCAAGAC

4141 GATAGTTACC GGATAAGGCG CAGCGGTCGG GCTGAACGGG GGGTTCGTGC ACACAGCCCA

4201 GCTTGGAGCG AACGACCTAC ACCGAACTGA GATACCTACA GCGTGAGCTA TGAGAAAGCG

4261 CCACGCTTCC CGAAGGGAGA AAGGCGGACA GGTATCCGGT AAGCGGCAGG GTCGGAACAG

4321 GAGAGCGCAC GAGGGAGCTT CCAGGGGGAA ACGCCTGGTA TCTTTATAGT CCTGTCGGGT

4381 TTCGCCACCT CTGACTTGAG CGTCGATTTT TGTGATGCTC GTCAGGGGGG CGGAGCCTAT

4441 GGAAAAACGC CAGCAACGCG GCCTTTTTAC GGTTCCTGGC CTTTTGCTGG CCTTTTGCTC

4501 ACATGTTCTT TCCTGCGTTA TCCCCTGATT CTGTGGATAA CCGTATTACC GCCATGCAT

Векторная последовательность (заглавные буквы) в трех сплайсинг-вариантах одинакова, поэтому ниже приведены последовательности только вставок (строчные буквы) для вариантов 121 и 189, начиная с инициирующего ATG-кодона (выделен жирным шрифтом).

Нуклеотидная последовательность вставки сплайсинг-варианта 121-4427 bp.

1 atgaactttc tgctgtcttg ggtgcattgg agccttgcct tgctgctcta cctccaccat

61 gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggaggag ggcagaatca tcacgaagtg

121 gtgaagttca tggatgtcta tcagcgcagc tactgccatc caatcgagac cctggtggac

181 atcttccagg agtaccctga tgagatcgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg

241 atgcgatgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc

301 aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat aggagagatg

361 agcttcctac agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa

421 aaatgtgaca agccgaggcg gtga

Нуклеотидная последовательность вставки сплайсинг-варианта 189 - 4631 bp.

1 atgaactttc tgctgtcttg ggtgcattgg agccttgcct tgctgctcta cctccaccat

61 gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggaggag ggcagaatca tcacgaagtg

121 gtgaagttca tggatgtcta tcagcgcacg tactgccatc caatcgagac cctggtggac

181 atcttccagg agtaccctga tgagatcgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg

241 atgcgatgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc

301 aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat aggagagatg

361 agcttcctac agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa

421 aaaaaatcag ttcgaggaaa gggaaagggg caaaaacgaa agcgcaagaa atcccggtat

481 aagtcctgga gcgttccctg tgggccttgc tcagagcgga gaaagcattt gtttgtacaa

541 gatccgcaga cgtgtaaatg ttcctgcaaa aacacagact cgcgttgcaa ggcgaggcag

601 cttgagttaa acgaacgtac ttgcagatgt gacaagccga ggcggtga

Изобретение относится к лекарственным средствам, содержащим генетический материал. Предложена генно-инженерная конструкция VEGF-ИБМед, представляющая собой экспрессионную векторную плазмиду, в которой клонирована вставка ДНК, кодирующая фактор роста эндотелия сосудов в трех его формах. Генно-инженерная конструкция названа VEGF-ИБМед. Изобретение обеспечивает повышение эффективности, а также безопасности за счет использования плазмидного вектора.

Генно-инженерная конструкция VEGF-ИБМед, представляющая собой экспрессионную векторную плазмиду, в которой клонирована вставка ДНК, кодирующая фактор роста эндотелия сосудов в трех его формах, отличающаяся тем, что она содержит суммарную кольцевую ДНК длиной 4559/4427/4559 нуклеотидных пар; основные элементы конструкции VEGF-ИБМед.:

конструкция pCMV-VEGF сплайсинг-вариант 165-4559 bp

конструкция pCMV-VEGF сплайсинг-вариант 121-4427 bp

конструкция pCMV-VEGF сплайсинг-вариант 189-4631 bp,

при этом человеческая VEGF- к ДНК, клонирована в векторной плазмиде pEGFP-N2 с удаленным геном GPF по сайтам рестрикции EcoRI/SmaI; регуляторные элементы трансляции конструкции:

инициация - nt 649

терминация - nt 1221 (А 165); селективный маркер для размножения плазмиды в бактериальном хозяине - E.coli штамм XL1 Blue MRF′ - Kn (при 25 мкг/мл); регуляторные элементы для экспрессии в эукариотических клетках;

CMV немедленный ранний промотор,

SV40 концевой нитрон,

poly(А)-сигнал.