ГЕН VEGFopt ФАКТОРА РОСТА ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2010 года по МПК C12N15/12 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к технологии получения генно-инженерных конструкций для экспрессии трансгенов в клетках млекопитающих in vitro и in vivo с целью их применения в клеточной инженерии и в генной терапии, а именно к модифицированной последовательности гена фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), включаемого в состав векторов в качестве одного из фрагментов.

Фактор роста эндотелия сосудов является основным естественным стимулятором роста сосудов, запускающим этот процесс через усиление проницаемости стенки сосуда, активацию деления и направленного движения эндотелиальных клеток (Cross M.J., Claesson-Welsh L. Trends Pharmacol. Sci., 2001, vol.22, pp.201-207). Помимо этого VEGF активирует выход клеток-предшественников из костного мозга (Hiasa К., Egashira К., Kitamoto S., Ishibashi M., Inoue S., Ni W., Zhao Q., Nagata S., Katoh M., Sata M., Takeshita A. Basic Res. Cardiol., 2004, vol.99, pp.165-172). Показано, что однократная инъекция генетической конструкции с геном VEGF позволяет восстановить кровоснабжение конечности у больного с критической ишемией нижних конечностей до уровня, обычно достигаемого при оперативном лечении (Baumgartner I., Isner J.M. Isr. Med. Assoc. J., 2000, vol.2, pp.27-32), и улучшить перфузию миокарда у больных с тяжелой ишемией миокарда и постинфарктным фиброзом, не подлежащих оперативному лечению (Rosengart Т.К., Lee L.Y., Patel S.R., Sanborrn T.A., Parikh M., Bergman G.W., Hachamovitch R., Szulc M., Kligfield P.D., Okin P.M., Hahn R.T., Devereux R.B., Post M.R., Hackett N.R., Foster Т., Grasso T.M., Lesser M.L., Isom O.W., Crystal R.G. Circulation, 1999, vol.100, pp.468-474; Losordo D.W., Vale P.R., Isner J.M. Am. Heart J., 1999, vol.138, pp.132-141). Перспективы генной терапии в лечении заболеваний, связанных с нарушением кровоснабжения, продемонстрированы как в экспериментальных, так и в клинических исследованиях (Ylä-Herttuala S., Rissanen T.T., Vajanto I., Hartikainen J.J. Am. Coll. Cardiol., 2007, vol.49, pp.1015-1026). Для продуцирования VEGF используют ДНК, содержащую природный ген VEGF165 человека (Choi J.S., Kim K.B., Han W., Kirn D.S., Park J.S., Lee J.J., Lee D.S. Ann Thorac Surg., 2006, Aug; 82(2):679-86).

Технической задачей, решаемой авторами настоящего изобретения, является создание модифицированной последовательности гена VEGF, которая при ее включении в состав эукариотического вектора обеспечивала бы более высокий уровень экспрессии названного белка в клетках, трансфицированных названным вектором.

Технический результат достигался модификацией природной последовательности гена VEGF165, в основе которой лежала вырожденность генетического кода. Последовательность модифицировали таким образом, чтобы триплеты нуклеотидов, кодирующие некоторые из аминокислот белковой последовательности фактора роста эндотелия сосудов, встречались в генах человека наиболее часто. При этом использовали опубликованные в открытых источниках данные по частотам встречаемости кодонов (http://del.mediaglyphs.org/mg/bf/nucs_aa.html).

На фиг.1. показана последовательность нуклеотидов гена VEGFopt (средние строчки) в сравнении с последовательностью нуклеотидов природного гена VEGF165 (верхние строчки). Показана также последовательность аминокислот кодируемого белкового продукта - фактора роста эндотелия сосудов человека (нижние строчки). Подчеркнуты триплеты нуклеотидов, подвергшиеся оптимизации.

На фиг.2 приведена функциональная карта плазмиды pC4W-VEGFopt.

На фиг.3 показан вестерн-блоттинг белков культуральной среды клеток НЕК293, трансфицированных плазмидой pC4W-hVEGF165 (дорожка 2) и плазмидой pC4W-VEGFopt (дорожка 3). На дорожку 1 нанесено 25 нг рекомбинантного VEGF165 человека.

Синтез гена и плазмиды осуществляли с помощью стандартной технологии и оборудования, применяемых для решения подобных задач в генной инженерии (Watson J.D., Gilman M., Witkowski J., Zoller M. - Recombinant DNA, Scientific American Books, New York, 1992).

Дизайн оптимизированной последовательности нуклеотидов, кодирующей фактор роста эндотелия сосудов человека VEGF165, производили следующим образом. Используя частоты встречаемости кодонов, приведенные на вэб-сайте http://del.mediaglyphs.org/mg/bf/nucs_aa.html, среди триплетов нуклеотидов, кодирующих аминокислоты белковой последовательности природного гена VEGF165, выявляли такие, которые встречаются в генах человека наиболее редко. Выявленные редкие триплеты, а также соседние с ними триплеты меняли на триплеты, кодирующие ту же аминокислоту, но при этом встречающиеся в генах человека наиболее часто. В результате благодаря вырожденности генетического кода все аминокислоты природного гена фактора роста эндотелия сосудов человека остались неизмененными. Полученная последовательность нуклеотидов представлена на фиг.1.

кДНК VEGF165 получали методом RT-PCR с использованием в качестве матрицы суммарной РНК из печени человека и клонировали в экспрессионный вектор.

В качестве последнего использовали, в частности, экспрессионный вектор pC4W (ООО "фирма МОНА", РФ) с получением плазмиды pC4W-hVEGF165.

Получение плазмиды, несущей оптимизированный ген VEGFopt, получали методом генно-инженерного конструирования, как описано ниже на примере плазмиды pC4W-VEGFopt.

На первой стадии химически синтезированную пару олигонуклеотидов VEC05 (AGCTTGGCATTCCGGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGG) и VEC06 (GATCCATGGTGGCTTTACCAACAGTACCGGAATGCCA) отжигали, смешивали и клонировали в расщепленный рестриктазами HindIII и BamHI вектор pBluescriptII-SK⁺ с получением промежуточной плазмиды pBSK-KNB.

На второй стадии

- химически синтезированные пары олигонуклеотидов

VEGF1S (GGGCCTGGTGACCCGGCAGACCTACATCATCCAG) и

VEGF2A (GATGTAGGTCTGCCGGGTCACCAGGCCCTGCA),

VEGF3S (GAGCTGGAGAAGCAGCTGAACAGAGCCACCACCA) и

VEGF4A (TGGCTCTGTTCAGCTGCTTCTCCAGCTCCTGGAT) и Bmel8I - XbaI фрагмент плазмиды pcDNA3-hVEGF165 клонировали в плазмиду pBSK-KNB, расщепленную рестриктазами NcoI и XbaI, с получением промежуточной плазмиды pBSK-KVEGF;

- химически синтезированные пары олигонуклеотидов

VEGF11S (GTACCAGGCCGGCTTCAACAAGAGCGGCATCTACACCATC) и

VEGF12A (GTGTAGATGCCGCTCTTGTTGAAGCCGGCCTG),

VEGF13S (TACATCAACAACATGCCCGAGCCCAAGAAGGTGTTCTGCA) и

VEGF14A (GAACACCTTCTTGGGCTCGGGCATGTTGTTGATGTAGATG) клонировали в вектор pBluescriptII-SK⁺, расщепленный рестриктазами PstI и ApaI, с получением промежуточной плазмиды pBSK-VEGF11-14. Встраивание соответствующих последовательностей ДНК подтверждали секвенированием.

На третьей стадии

- химически синтезированную пару олигонуклеотидов

VEGF5S (CATGACCGTGTTCCTGTCCTTTGCCTTCC) и

VEGF6A (AGGCAAAGGACAGGAACACGGT) и HindIII - BstENI фрагмент плазмиды pBSK-KVEGF клонировали в вектор pBluescriptII-SK⁺, расщепленный рестриктазами PstI и HindIII, с получением промежуточной плазмиды pBSK-KVEGF1-6;

- химически синтезированную пару олигонуклеотидов

VEGF15S (AATTCACTGTCCACCTACAAGCTGGAGAAGCAGCTGCTGCA) и

VEGF16A (GCAGCTGCTTCTCCAGCTTGTAGGTGGACAGTG),

VEGF17S (GGGCCTGGTGACCCGGCAGACCTACATCATCCAG) и

VEGF18А (GATGTAGGTCTGCCGGGTCACCAGGCCCTGCA),

VEGF19S (GAGCTGGAGAAGCAGCTGAACAGAGCCACCACCA) и

VEGF20A (TGGCTCTGTTCAGCTGCTTCTCCAGCTCCTGGAT) клонировали в плазмиду pBSK-VEGF11-14, расщепленную рестриктазами PstI и ВаmHI, с получением промежуточной плазмиды pBSK-VEGF11-20. Встраивание соответствующих последовательностей ДНК подтверждали секвенированием.

На четвертой стадии химически синтезированные пары олигонуклеотидов

VEGF7S (GGGCCTGGTGACCCGGCAGACCTACATCATCCAG) и

VEGF8A (GATGTAGGTCTGCCGGGTCACCAGGCCCTGCA),

VEGF9S (GAGCTGGAGAAGCAGCTGAACAGAGCCACCACCA) и

VEGF10A (TGGCTCTGTTCAGCTGCTTCTCCAGCTCCTGGAT) и ApaI - ВаmHI фрагмент плазмиды pBSK-VEGF11-20 клонировали в плазмиду pBSK-KVEGF1-6, расщепленную рестриктазами PstI и ВаmHI, с получением промежуточной плазмиды pBSK-KVEGFopt. Встраивание соответствующих последовательностей ДНК подтверждали рестриктным анализом и секвенированием полученной плазмиды.

На пятой стадии HindIII - BamHI фрагмент плазмиды pBSK-KVEGFopt клонировали в экспрессионный вектор pC4W, расщепленный рестриктазами HindIII и ВаmHI, с получением плазмиды pC4W-VEGFopt (фиг.2), предназначенной для экспрессии гена фактора роста эндотелия сосудов человека в клетках млекопитающих. Правильность встраивания оптимизированного гена VEGFpt и соответствие дизайну его нуклеотидной последовательности подтверждали рестриктным анализом и секвенированием полученной плазмиды. Эффективность заявляемого изобретения иллюстрируется следующим примером.

Пример. Клетки НЕК293, высеянные в лунки 24-луночной плашки (50000 клеток на лунку) в среде DMEM, содержащей 2% эмбриональной телячьей сыворотки, трансфицировали плазмидой pC4W-VEGFopt, несущей оптимизированный ген фактора роста эндотелия сосудов человека (VEGFopt), или контрольной плазмидой pC4W-hVEGF165, несущей природный ген фактора роста эндотелия сосудов человека (VEGF165). Трансфекцию проводили с использованием 1 мкг ДНК и 1 мкл реагента Липофектамин 2000 (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя. Через 24 ч после трансфекции культуральную среду заменяли на свежую. Анализировали накопление VEGF165 в культуральной среде за следующие 48 часов.

Для наблюдения экспрессии VEGF165 после трансфекции клеток использовали метод вестерн-блоттинга. Электрофорез белков в 13%-ном полиакриламидном геле проводили в денатурирующих условиях в присутствии додецилсульфата натрия без добавления бета-меркаптоэтанола. На дорожки геля наносили по 30 мкл культуральной среды.

Перенос белков из геля на PVDF-мембрану (Millipore) осуществляли в полусухих условиях в стандартном буфере. После переноса мембрану проинкубировали в 5%-ном растворе обезжиренного молока в TBS-буфере (Tris buffer saline) с 0,001%-ным Tween 20 (Pierce) в течение ночи при температуре +4°С. Далее проводили инкубацию с мышиными моноклональными антителами против VEGF165 человека фирмы R&D Systems (США), которые разводили в 750 раз в 5%-ном обезжиренном молоке в TBS-буфере с 0,001%-ным Tween 20. Мембрану троекратно отмывали в 5%-ном растворе обезжиренного молока в TBS-буфере с 0,001%-ным Tween 20 в течение 15 минут и инкубировали с меченными пероксидазой крысиными антителами против иммуноглобулинов мыши в 5%-ном обезжиренном молоке с 0,001%-ным Tween 20 при комнатной температуре в течение 60 мин. После этого мембрану обрабатывали набором реактивов двухкомпонентной системы ECL (Pierce), экспонировали с рентгеновской пленкой "Bio Max" (Kodak) и проводили денситометрию. Результаты представлены в таблице и на фиг.3, где показан вестерн-блоттинг белков культуральной среды клеток НЕК293, трансфицированных плазмидой pC4W-hVEGF165 (дорожка 2) и плазмидой pC4W-VEGFopt (дорожка 3) (на дорожку 1 нанесено 25 нг рекомбинантного VEGF165 человека).

Таблица Денситометрический анализ вестерн-блоттинга белков культуральной среды трансфицированных клеток Плазмида Интегрированный сигнал белкового пятна pC4W-hVEGF165 22628 pC4W-VEGFopt 33962 Рекомбинантный VEGF165 человека, 25 нг 40849

Полуколичественный денситометрический анализ показал (см. таблицу), что продукция VEGF165 в случае использования оптимизированного гена VEGFopt в 1,5 раза больше, чем в случае использования природного гена hVEGF165. Сравнение сигнала от клеток, трансфицированных плазмидой pC4W-VEGFopt (фиг.3, дорожка 3), с одной стороны, и сигнала от рекомбинантного VEGF165 человека (дорожка 1), с другой, позволяет заключить, что содержание VEGF165 в культуральной среде трансфицированных клеток составляет 0,7 мкг/мл.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к технологии получения генно-инженерных конструкций с целью их применения в клеточной и генной терапии. Представлен оптимизированный для экспрессии в клетках млекопитающих ген фактора роста эндотелия сосудов человека (VEGF). Изобретение позволяет за счет введения в плазмиду pC4W-VEGFopt гена VEGFopt повысить выход целевого продукта в 1,5 раза по сравнению с технологией использования плазмиды pC4W-hVEGF165, содержащей природный ген. 1 табл., 3 ил.

Оптимизированный для экспрессии в клетках млекопитающих ген фактора роста эндотелия сосудов человека, обладающий последовательностью нуклеотидов, приведенной на фиг.1.