Штамм культивируемых перевиваемых клеток кожно-мышечной ткани эмбриона кролика, используемый для выделения и накопления вирусов Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 

заметны первые колонии эпителиоподоо ных клеток. При съеме клеток смесью растворов трипсина и версена (1:5) от стекла в первую очередь отслаиваются фибробластоподобные клетки. Их удаляют, а к оставшимся на стекле колониям эпителиоподобных клеток добавляют свежую порцию питательной среды состоящей из смеси ГЛАХа и Игла (1: или только из ГЛАХа с добавлением 5-10% сыворотки к.р.с. Через 2-3 сут колонии разрастаются, образуя сплошной монослой. В данной культуре 100% ный монослой эпителиоподобных клеток получен на 15-16 пассажах.

Штамм депонирован под номером ВСК (СХЖ) № 25 и характеризуется следующими признаками.

КультураЛьные признаки

Клетки хорошо растут на смеси сред ГЛАХа и Игла (1:1), Игла в любой модификации, а также на ГЛАХе и отечественной среде ФМГс с добавлением 5-10% сыворотки к.р.с. Посевная доза 5-Ю4- 710 кл/мл. Кратность рассева (1:2)-(1:3). Метод снятия с поверхности культурального сосуда: 0,02%-ный версен и 0,25%-ный трипсин в соотношении 5:1. Частота пассирования - через 2-3 сут.

Консервация клеток.

Криозащнтная среда: ростовая сред 70%, сыворотка к.р.с. 20%, ДМСО 10%. Выживаемость 70-80%. Режим замораживания: эквилибрация при 4°С в течени 1 ч, далее снижение температуры до -60° С со скоростью 1 град/мин, затем клетки помещают в жидкий азот на -196°С.

Морфология клеток.

Культура состоит из полиморфных эпителиоподобных клеток. Встречаются гигантские клетки. Ядра округлые, различной величины. Ядрышки крупные, от 1 до нескольких в ядре. Цитоплазма мелкосетчатая. Кариология линии на уровне 51 пассажа. Кариотип соответствует виду (). Модальный класс 88-89 хромосом. Клетки имеют околотетраплоидный кариотип, отличаются большим разбросом числа хромосом. Имеется 3-4 микрохромосомы и непарная длинная субметацентрическая маркерная хромосома.

Контаминанты.

Бактерии, грибы, микоплазмы и вирусы не обнаружены.

Чувствительность к вирусам.

0

0

5

0

5

0

45

0

5

Линия клеток представляет собой высокопродуктивный субстрат для куль- ривирования вирусов ринопневмонии (три штамма), артериита лошадей, реовирусу 3-го типа, инфекционного ринотрахёита, диареи крупного рогатого скота, парагриппа-3.

Пример 1. Культивирование вируса инфекционного ринотрахёита крупного рогатого скота, штамм ТК-А (ВИЭВ) В-2.

Монослой линии перевиваемых клеток КМЭКр-85 снимают с поверхности матраса следующим образом. Сливают культу- ральную жидкость, в матрас вносят подогретый до 37°С диспергирующий ра- стпор, состоящий из 0,25%-ного раствора трипсина и 0,02%-ного раствора версена (в соотношении 1:5) в количестве 60-80 мл. Указанным раствором обводят несколько раз клеточный пласт и оставляют матрас на 2-3 мин при комнатной температуре. После этого небольшая часть клеток начинает отделяться от стекла, матрас осторожно переворачивают так, что клеточный пласт находится наверху. Основную часть этого раствора сливают. Отслоившиеся клетки ресуспендируют в питательной среде: в 0,5%-ном гидроли- зате пактальбумина с последующим добавлением 5-10% сыворотки к.р.с. Урожай клеток после 3-суточного культивирования с одного матраса составляет 50-60 млн. клеток. Полученные концентрированные суспензии клеток разводят соответствующими питательными средами до концентрации 50-100 тыс .кл/мл и высевают в 1,5 л матрасы. Через сутки ростовую среду сливают, культуру промывают средой без сыворотки и вносят вируссодержащую суспензию из расчета 0,1 вируссодержашая частица на 1 клетку. Затем добавляют поддерживающую среду, отличающуюся от ростовой величиной рН (7,4) и отсутствием сыворотки. Инфицированные культуры инкубируют при 37°С. Через 36 ч наступает выраженное цитопатическое действие вируса, которое проявляется в виде округления клеток.

Для установления титра вируса готовят пробирочный материал. Для этого суспензию клеток КМЭКр-85 в концентрации 150 тыс. кл/мл разливают по пробиркам и через сутки, когда на поверхности пробирок образуется монослой клеток, вносят вирус в различных разведениях. Титр вируса ИРТ в культуре КЮКр-85 составляет 51 lg Т1Щ50/И,

Пример 2. Культивирование вирусов ринопневмонии (три штамма).

Клетки линии КМЭКр-85 культивируют и заражают вирусами ринопневмонии аналогично примеру 1. Титр вирусов в культуре составляет 5-7 lg ТЦД

Пример 3. Культивирование вируса артериита лошадей.

Перевиваемые клетки линии КМЭКр-85 культивируют аналогично примеру 1. Титр вируса составляет 5-7 lg ТЦЦ.

Пример 4. Культивирование вируса парагриппа-2 крупного рогатого скота, аттенуированный штамм.

Клетки линии КМЭКр-85 культивируют и заражают аналогично примеру 1. Титр вируса ПГ-3 в культуре составляет 5-7 lg ТЦД5о/м/(.

Пример 5. Культивирование реовируса 3-го типа.

Перевиваемый клетки линии КМЭКр-85 культивируют и заражают вирусом аналогично примеру 1. Заражают вирусом из расчета 0,001 ТЦД5,КЛ Титр вируса составляет 5-7 lg ТЦП,.

Пример. 6. Культивирование вируса диареи крупного рогатого скота .

Клетки линии КМЭКр-85 культивируют аналогично примеру 1. Заражают вирусом из расчета 0,001 ТЦДм/к/( . Титр вируса диареи составляет 5-7 IgTIiD,/,., Полученный новый штамм неприхотлив к питательным средам, в течение 3-5 пассажей легко адаптируется к новым средам, например, 0,5%-ному раствору ФМГс и гемогидролизату отечественного производства. Вместо эмбриокалькой или телячьей сыворотки для клеток КМЭКр-85 используется более дешевая и доступная сыворотка крупного рогатого скота. Применение клеток КМЭКр-85 в биологической промышленности для культивирования вирусов приводит к уменьшению экономических затрат на питательные среды и сыворотку .

Формула изобретения

Штамм культивируемых перевиваемых клеток кожно-мышечной ткани эмбриона кролика ВСКК (СХЖ) № 25, используемый для выделения и накопления вирусов.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и представляет собой новый штамм перевиваемых клеток кожно-мышечной ткани эмбриона кролика, используемый для культивирования вирусов. Штамм хранится под номером ВСКК(СХЖ) N25. Культура состоит из эпителиоподобных клеток полигональной формы с четко выраженными границами. Ядра округлые, различной величины и формы. Ядрышки крупные, от 1 до нескольких в ядре. Цитоплазма мелкосетчатая. Клетки имеют околотетраплоидный набор хромосом, есть высокоплоидные клетки. Имеются 3-4 микрохромосомы различной формы и непарная длинная субметацентрическая маркерная хромосома. Модальный класс 89 хромосом. При посевной концентрации 50 тыс.клеток на 1 мл среды сплошной монослой образуется на 3 сутки. Индекс пролиферации 2-3. Время удвоения популяции 18 ч. Клетки обладают стабильными ростовыми свойствами, способны расти на различных питательных средах, обладают высокой чувствительностью к вирусам парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита, реовирусу 3-го типа, вирусам ринопневмонии (три штамма), диареи крупного рогатого скота, а