СПОСОБ ЗАЩИТЫ ОТ-ПЦР ОТ КОНТАМИНАЦИИ ПРОДУКТАМИ АМПЛИФИКАЦИИ НА ОСНОВЕ РАЗРУШАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ УРАЦИЛ-ДНК-ГЛИКОЗИЛАЗЫ Российский патент 2007 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области биохимии, в частности к молекулярно-генетическим методам детекции биологических объектов.

Контаминация - попадание из внешней среды в реакционную смесь специфических и неспецифических молекул ДНК, способных служить мишенями в реакции амплификации и давать ложноположительные или ложноотрицательные результаты [1, 2, 3].

Такими мишенями могут быть продукты реакции, попадающие во внешнюю среду на этапе детекции из пробирок, в которых успешно прошла амплификация, либо специфическая ДНК из образцов на этапе пробоподготовки [1, 2, 3].

Урацил-ДНК-гликозилазный метод защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации является действенным инструментом, позволяющим значительно снизить риск ложноположительных реакций [1]. Оптимизированные методики с использованием Tth-полимеразы нашли достойное применение в решении данной проблемы. Температурный режим элонгации Tth ДНК полимеразы (60-72°С) позволяет использовать урацил-ДНК-гликозилазный метод защиты от контаминации в варианте «I пробирка, 1 этап» [1].

Использование же M-MuLV обратной транскриптазы совместно с урацил-ДНК-гликозилазой (из Е. coli) [4, 5] в варианте «1 пробирка, 1 этап» невозможна по причине одинаковой рабочей температуры ферментов (37°С).

Цель изобретения - разработка эффективной методики защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации на основе урацил-ДНК-гликозилазного метода защиты.

Нами разработан способ защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации на основе разрушающего действия урацил-ДНК-гликозилазы (из Е. coli) [4, 5] на урацил-содержащую ДНК в варианте «1 пробирка, 2 этапа» при использовании M-MuLV обратной транскриптазы и Taq ДНК полимеразы путем комбинированного использования dTTP/dUTP.

Принцип способа заключается в том, что на 1 этапе M-MuLV обратная транскриптаза катализирует матричный синтез ДНК на матрице РНК с исключением использования урацил-содержащих ампликонов в качестве матрицы из-за их гидролиза урацил-ДНК-гликозилазой (из Е. coli) при температуре 37°С. В качестве строительных блоков используются dATP, dTTP, dGTP, dCTP. На 2 этапе добавляется в реакционную смесь Taq ДНК полимераза и смесь из дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dUTP, dGTP, dCTP) с заменой dTTP на dUTP в пропорциональной концентрации с общим содержанием во время проведения ПЦР 5 дезоксинуклеозидтрифосфатов -dATP, dTTP, dUTP, dGTP и dCTP, что обеспечивает выход урацил-содержащей ДНК (Схема).

Ближайшим аналогом заявленного способа можно считать способ защиты ОТ-ПЦР, катализируемой обратной транскриптазой M-MuLV и ДНК-полимеразой, от контаминации продуктами амплификации, раскрытый в Instruction manual, DyNAmo^ТМ Capillary SYBR® Green 2-Step qRT-PCR Kit (Distributed by New England Biolabs, Version 1.2, March 2005, www. finnzymes.com) (далее D1). Указанный способ (D1), как и заявленное изобретение, предусматривает:

1) проведение обратной транскриптазной реакции с использованием в качестве дезоксинуклеозидтрифосфатов dATP, dTTP, dGTP и dCTP;

2) обработку реакционной смеси урацил-ДНК-гликозилазой, высвобождающей свободный урацил из урацил-содержащей ДНК при 37°С, перед проведением ПЦР;

3) проведение ПЦР с использованием в качестве

дезоксинуклеозидтрифосфатов dATP, dTTP, dUTP, dGTP и dCTP.

Заявленный способ отличает от указанного предложения (D1) то, что ПЦР и обратнотранскриптазную реакцию проводят в одном реакционном объеме, причем урацил-ДНК-гликозилазу добавляют в реакционную смесь для обратной транскриптазной реакции.

Условия проведения реакции

Для теоретического обоснования разработанного способа нами были проведены практические исследования, направленные на доказательство эффективности выбранного подхода, для чего проводили мультиплексную ОТ-ПЦР для одновременного выявления возбудителей вирусных болезней картофеля в варианте «1 пробирка, 2 этапа» с использованием в качестве ПКО (положительный контрольный образец) положительную на PVY (Potato vims Y)+PVX (Potato vims X) амплифицированную ОТ-ПЦР-пробу в разведении 1:10000 в смеси с ОКО (отрицательный контрольный образец) по протоколу, представленному в таблице.

ОТ-ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик» (Россия).

Детекцию результатов проводили методом горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле в трис-боратном буфере (ТВЕ), рН 8,0, содержащим этидий бромид в концентрации 0,5 мкг/мл, с визуализацией УФ-светом (λ=310 нм).

Размеры амплифицированных фрагментов ДНК в нуклеотидных парах (н.п.) оценивали по подвижности в 2% агарозном геле по сравнению со стандартным маркером размерами 100-1500 н.п.(«СибЭнзим», Новосибирск) (чертеж).

Таблица
"Одна пробирка, два этапа" Обратнотранскриптазная реакцияРеактивыИсходная концентрацияРабочая концентрация1 проба10 пробdH₂O  9,45 мкл94,5 мклСмесь из dATP, dTTP, dGTP, dCTP2 мМ каждого из dNTP0,3 мМ2,25 мкл22,5 мклБуфер ОТ10×1×1,5 мкл15,0 мклM-MuLV Обратная транскриптаза5 ед0,5 ед0,1 мкл1,0 мклУрацил-ДНК-гликозилаза (из E. Coli)5 ед0,5 ед0,1 мкл1,0 мклPPVYCP6P cgtccaaaatgagaatgcc50 мкМ0,5 мкМ0,15 мкл1,5 мклPPVYCP6M tcttgtgtactgatgccac50 мкМ0,5 мкМ0,15 мкл1,5 мклPPVXv1 gacactatggcacaggctgcttgg50 мкМ0,5 мкМ0,15 мкл1,5 мклPPVXc2 ttgggcagcattcatttcagcttc50 мкМ0,5 мкМ0,15 мкл1,5 мклПроба  1,0 мкл Всего  15,0 мкл 37°С - 45 мин.Добавить равный объем (15 мкл) ПЦР смеси ПЦРРеактивыИсходная концентрацияРабочая концентрация1 проба10 пробdH₂O  11,05 мкл110,5 мклСмесь из dATP, dUTP, dGTP, dCTP2 мМ каждого из dNTP0,3 мМ2,25 мкл22,5 мклБуфер Taq ДНК полимераза10×1×1,5 мкл15,0 мклTaq ДНК полимераза5 ед1 ед0,2 мкл2,0 мклВсего  15,0 мкл 

Режим амплификации: 37°С-15 мин. 94°С-4 мин. 94°С - 1 мин, 60°С - 1 мин, 72°С - 1 мин.=40 циклов. 72°С-10 мин.

Заключение

По результатам практических исследований, направленных на теоретическое обоснование разработанного способа защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации на основе разрушающего действия урацил-ДНК-гликозилазы (из E. Coli), нами получен обеспечиваемый заявленным способом технический результат, выраженный в демонстрации предотвращения возможности реамплификации урацил-содержащих ампликонов (чертеж) при использовании заявленного протокола ОТ-ПЦР в варианте «1 пробирка 2 этапа» (таблица) ввиду того, что урацил-содержащая ДНК (контаминант) теряет роль мишени из-за выщепления из нее свободного урацила ферментом урацил-ДНК-гликозилазой (из E. coli) в процессе реакции (Схема).

Источники информации

1. http://www.roche-applied-science.com.

2. Higuchi, R. and Kwok, S. (1989) Nature 339, 237-238.

3. Tomilin, N.V. and Aprelikova, O.N. (1989) Intl. Rev. Cytol. 114, 125-179. 3. Sobek, H. et al. (1996) FEBS Lett. 388, 1^t.

5. Longo, M.C., Beringer, M.S., and Hartle, J.L. (1990) Gene 93. 125-128.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано для детекции биологических объектов. Предложенный способ защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации предусматривает добавление урацил-ДНК-гликозилазы в смесь для обратной транскриптазной реакции и проведение обратной транскриптазной и полимеразной цепной реакции в одном реакционном объеме. Применение изобретения обеспечивает защиту ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации с повышенной эффективностью. 1 ил., 1 табл.

Способ защиты от контаминации обратной транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР), катализируемой обратной транскриптазой M-MuLV и ДНК-полимеразой, предусматривающий проведение обратной транскриптазной реакции с использованием в качестве дезоксинуклеозидтрифосфатов dATP, dTTP, dGTP и dCTP, обработку реакционной смеси перед проведением ПЦР урацил-ДНК-гликозилазой, высвобождающей свободный урацил из урацил-содержащей ДНК при 37°С, и проведение ПЦР с использованием в качестве дезоксинуклеозидтрифосфатов dATP, dTTP, dUTP, dGTP и dCTP, отличающийся тем, что обратную транскриптазную реакцию и полимеразную цепную реакцию проводят в одном реакционном объеме, а обработку реакционной смеси урацил-ДНК-гликозилазой проводят на стадии реакции обратной транскрипции, причем указанный фермент добавляют в смесь для обратной транскриптазной реакции.