СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ТКАНЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2007 года по МПК C12Q1/02 G01N33/15 A61K35/66 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к способам определения биологической активности тканевых препаратов, и может быть рекомендовано к применению при определении биологической активности тканевых препаратов.

Уровень техники

Известен способ определения биологической активности тканевых препаратов (экстрактов, взвесей) по скорости заживления одинаковых дефектов кожи, заключающийся в нанесении на внутреннюю поверхность ушных раковин лабораторных животных (кролики, морские свинки) ран одинаковых размеров. При этом животным опытной группы подкожно вводят тканевой препарат, об активности которого судят по скорости заживления ран, по сравнению с контролем (см. Калашник И.А. Стимулирующая терапия в ветеринарии. - 2-е изд., перераб. и доп. - К.: Урожай, 1990, - c.74).

Недостатки данного способа:

- необходимо наличие лабораторных животных;

- травмированные животные должны содержаться в отдельных клетках, в специально отведенном для этого помещении, с соблюдением принципа аналогов (т.е. животные должны быть одной породы, одного возраста и с приблизительно одинаковой живой массой);

- оценка активности исследуемого препарата недостаточно объективна, так как скорость заживления раны зависит не только от проводимых терапевтических мероприятий (введение препарата), но и от неспецифической резистентности самого организма.

Известен способ определения биологической активности тканевых препаратов по В.М. Ковбасенко (1972), основанный на использовании собственной люминесценции тканей и органов, заключающийся в приготовлении водных вытяжек (1:100) из консервированных и неконсервированных тканей, с последующим измерением их люминесценции на приборе флуорометре ЭФ-ЗМ и определением активности препарата по специальной расчетной формуле (см. Калашник И.А. Стимулирующая терапия в ветеринарии. - 2-е изд., перераб. и доп. - К.: Урожай, 1990, - с.75).

Недостатки данного способа:

- с помощью этого способа измеряют активность только сухих тканевых препаратов;

- для определения биологической активности препаратов необходим прибор лабораторный флуорометр ЭФ-ЗМ;

- полученные данные нельзя считать объективными, так как нельзя говорить об активности препарата, исходя лишь из его флуоресцирующих свойств;

- учет активности ведется только по одному показателю.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятым авторами за прототип является способ определения биологической активности тканевых препаратов по К.Бакырджиеву. Сущность данного способа заключается в следующем. Вначале собирается прибор, состоящий из двух градуированных пробирок по 30 мл каждая и 1 колбы емкостью 100 мл. Пробирки закрывают резиновыми пробками с выведенными наружу стеклянными трубками, концы которых опущены в колбу емкостью 100 мл.

Затем приготавливают 2%-ный раствор глюкозы на дистиллированной воде и взвесь дрожжей 1:20, на дистиллированной воде. В опытную пробирку помещают 1 мл эмульсии тканевого препарата, 1 мл взвеси дрожжей и 28 мл 2%-го раствора глюкозы. Пробирку встряхивают до полного смешивания компонентов. В контрольную пробирку вместо эмульсии тканевого препарата помещают 1 мл физиологического раствора, остальные компоненты остаются те же и берутся в тех же количествах. Пробирку также встряхивают. Затем пробирки закрывают резиновыми пробками с отведенными наружу трубками, закрепляют на штативе и выдерживают при комнатной температуре (18-20°С) в течение 24-72 часов. Отсчет времени начинают с момента «заряжения» аппарата. В основу работы прибора заложен принцип сбраживания дрожжевой клеткой молекулы глюкозы, которая при спиртовой ферментации разлагается на этиловый спирт и двуокись углерода. Выделение углекислого газа начинается обычно через 4 часа с момента постановки опыта. Двуокись углерода собирается в верхнем слое пробирки, вследствие чего часть жидкости через отводную трубку выталкивается наружу. Скорость реакции зависит от температуры окружающей среды (чем выше температура, тем быстрее проходит реакция). Об активности тканевого препарата судят по количеству выделившейся из пробирки жидкости (см. К.Бакырджиев. Журнал «Ветеринария», №5, 1964, с.111-112). Однако следует отметить, что данный способ определения биологической активности имеет следующие недостатки:

- предполагает наличие «свежих» пекарских дрожжей (если дрожжи будут несвежими, то реакция либо не начнется, либо будет протекать очень медленно);

- учет реакции проводится каждые 12 часов в течение 24-72 часов (в зависимости от температуры окружающей среды);

- данные недостаточно точны также потому, что температура окружающей среды колеблется в пределах 4-5°С, а это значит, что скорость реакции неодинакова в каждом случае;

- об активности препарата судят только по одному показателю - скорости бродильного процесса;

- дрожжи разводят дистиллированной водой, что приводит к гибели многих дрожжевых клеток.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей данного изобретения является разработка способа определения биологической активности тканевых препаратов (БАТП), позволяющего сотрудникам ветеринарных лабораторий определять БАТП за сравнительно небольшое время (80-90 минут) и получать результаты с высокой степенью точности.

ТЕХНИЧЕСКИЙ РЕЗУЛЬТАТ, который может быть получен с помощью предлагаемого изобретения, сводится к сокращению времени постановки опыта, уменьшению затрат на проведение опыта, к точности получаемых результатов биологической активности тканевых препаратов, так как измеряется объем выделившегося СО₂ и ведется подсчет дрожжевых клеток в камере Горяева.

Технический результат достигается с помощью способа определения биологической активности тканевых препаратов, включающего подготовку взвеси дрожжей и 2%-го раствора глюкозы на дистиллированной воде с последующим отбором в опытную и контрольную пробирки объемом 30 мл, герметичным их закрытием резиновыми пробками с выведенными наружу изогнутыми стеклянными трубками, концы которых опущены в колбу емкостью 100 мл, причем в опытную пробирку производят отбор 1 мл тканевого препарата, 1 мл взвеси дрожжей и 28 мл 2%-го раствора глюкозы, а в контрольную пробирку помещают те же компоненты, заменяя тканевый препарат 1 мл стерильного физиологического раствора, причем взвесь дрожжей готовят на стерильном физиологическом растворе, используя при этом сухую культуру дрожжей Saccharomyces cerevisiae, затем пробирки вместе с колбой размещают в термостате при температуре 33-35°С, а время экспозиции составляет 60-90 минут, при этом двуокись углерода, выделяющаяся в опытной и контрольной пробирках, оказывает давление на слой жидкости, которая через выведенную наружу трубку выталкивается в колбу объемом 100 мл, причем измерение выделившейся жидкости проводят в опытной и контрольной пробирках 3 раза: через 30, 60 и 90 минут, после чего опытную и контрольную пробирки встряхивают, берут из каждой по 1 капле, помещают в камеру Горяева и под микроскопом проводят подсчет дрожжевых клеток в пяти больших квадратах, причем пробы из опытной и контрольных пробирок берут одновременно и подсчитывают количество дрожжевых клеток и объем образовавшейся двуокиси углерода.

Сущность способа определения БАТП сводится к следующему. Вначале готовят взвесь дрожжей 1:20 на стерильном физиологическом растворе и 2% раствор глюкозы на дистиллированной воде согласно методике К.Бакырджиева. Далее, в градуированную пробирку объемом 30 мл помещают 1 мл тканевого препарата, 1 мл взвеси дрожжей (1:20) и 28 мл 2%-го раствора глюкозы, эта пробирка является опытной. Во вторую пробирку помещают те же компоненты, только вместо тканевого препарата добавляют 1 мл физиологического раствора, эта пробирка является контрольной. После этого пробирки взбалтывают до полного смешивания компонентов и закупоривают пробками с выведенными наружу изогнутыми стеклянными трубками. Из каждой пробирки перед помещением в термостат берут по 1 капле жидкости и помещают в камеру Горяева, подсчитывая количество дрожжевых клеток в пяти больших квадратах камеры. Далее, прибор помещают в термостат. Температура в термостате 33-35°С, время экспозиции - 1,5 часа (90 мин). Двуокись углерода, образующаяся в ходе реакции, в обеих пробирках оказывает давление на слой жидкости, которая через выведенную наружу стеклянную трубку поступает в колбу емкостью 100 мл. Измерения объема выделившейся жидкости проводят три раза: через 30, 60 и 90 минут. Результаты измерений заносят в таблицу. Также по окончании опыта из контрольной и опытной пробирок с реагирующими компонентами после взбалтывания берут 1 каплю раствора и помещают в камеру Горяева и под микроскопом проводят подсчет дрожжевых клеток в 5 больших квадратах камеры, причем пробы берутся из контрольной и опытной пробирок одновременно. Об активности тканевого препарата судят по двум показателям: объему выделившегося углекислого газа и количеству дрожжевых клеток в контрольной и опытных пробирках (до и после окончания опыта).

Осуществление изобретения.

Примеры конкретного осуществления предлагаемого способа определения биологической активности тканевых препаратов.

Пример 1

С целью определения биологической активности препарата берут эмульсию тканевого препарата (с целью постановки опыта нами был взят препарат «АСД -2» - антисептик стимулятор Дорогова, фракция №2 - см. А.В.Дорогов. Применение препарата АСД в ветеринарной практике, «Ветеринария», №11, 1951, с.22-25) и физиологический раствор, который служит контролем. Вначале препарат проверяют на активность на аппарате К.Бакырджиева, оставляя его при комнатной температуре (20-22°С) на 24 часа. Этот опыт служит контролем.

Второй раз препарат проверяют на биологическую активность на аппарате К.Бакырджиева, поместив его в термостат при температуре 26-28°С, на 24 часа, с использованием пекарских дрожжей, дрожжи Saccharomyces cerevisiae, выпускаемых филиалом французской фирмы ООО «Саф-Нева» в Санкт-Петербурге и соответствующих ТУ 9182-001-48975583-2000, отличающихся от обычных пекарских дрожжей простотой применения, дешевизной, активностью и условиями хранения (не требуется холодильной камеры).

Анализ полученных данных показал, что через 24 часа реакция в аппарате К.Бакырджиева все еще продолжалась, но уже можно делать вывод об активности препарата по сравнению с контролем.

Определение биологической активности препарата по предложенному способу оказалось невозможным, так как вся реагирующая жидкость вылилась из колбы, вследствие чего подсчет количества дрожжевых клеток и выделившегося углекислого газа стал невозможен.

Пример 2

Определение биологической активности препарата проводят аналогично примеру 1 (по предложенному способу), но уменьшают время экспозиции прибора в термостате до 12 часов, а температуру повышают до 28-30°С.

Анализ полученных данных показал, что при такой экспозиции прибора в термостате и при такой температуре реакция протекает очень быстро и через 12 часов не поддается учету, так как вся жидкость выталкивается из колбы и выливается за края колбы.

Пример 3

Определение биологической активности препарата проводят аналогично примерам 1, 2, но в третьем опыте температура в термостате составляет 31-33°С, а время экспозиции 120 минут. Результаты записывают каждые 40 минут.

Таблица 1Биологическая активность препаратов при температуре 31-33°С и экспозиции в термостате 120 минутПрепаратыБиологическая активность препаратаКоличество дрожжевых клеток40 мин80 мин120 миндо опытапосле опыта%мл CO₂%мл CO₂%мл CO₂%Контроль (физ. раствор)3,0100,09,0100,010,0100,0600620100,0«АСД-2»4,8160,010,8120,015,5140,9600780,0125,8

Анализ полученных данных показал, что повышение температуры до 31-33°С при уменьшении экспозиции в термостате позволяет судить об активности препарата уже через 120 минут.

Пример 4

В данном случае определение биологической активности препарата проводят аналогично примерам 1, 2, 3, но время экспозиции прибора в термостате уменьшают на 30 минут при температуре 33-35°С. Результаты записывают каждые 30 минут.

Таблица 2Биологическая активность препаратов при температуре 33-35°С и экспозиции в термостате 90 минутПрепаратыБиологическая активность препаратаКоличество дрожжевых клеток30 мин60 мин90 миндо опытапосле опыта%мл CO₂%мл СО₂%мл CO₂%Контроль (физ. раствор)3,0100,06,5100,010,5100,0600624100,0«АСД -2»6,0200,09,5146,213,8131,4600663120,5

Анализ полученных данных показал, что при повышении температуры до 33-35°С скорость реакции повышается, а время экспозиции в термостате сокращается до 90 минут.

Пример 5.

Определение БАТП проводят аналогично примерам 1, 2, 3, 4 но в данном опыте температура в термостате составляет 39-40°С, а экспозиция - 90 минут.

Таблица 3Биологическая активность препаратов при температуре 39-40°С и экспозиции в термостате 90 минутПрепаратыБиологическая активность препаратаКоличество дрожжевых клеток30 мин60 мин90 миндо опытапосле опыта%мл CO₂%мл CO₂%мл CO₂%Контроль (физ. раствор)4,0100,09,0100,013,0100,0600500100,0«АСД-2»7,9197,511,2124,416,5127,0600563112,6

Анализ полученных данных показал, что при повышении температуры до 39°С скорость реакции повышается, но через 90 минут в поле зрения микроскопа обнаруживают сморщившиеся дрожжевые клетки и фрагменты погибших клеток.

Таким образом, основываясь на приведенных примерах, можно сделать вывод о том, что оптимальными параметрами постановки опыта является температура 33-35°С и экспозиция 90 минут. При этом испытуемый препарат в полном мере проявляет биологическую активность по скорости бродильного процесса, стимуляции деления дрожжевой клетки, а также по сравнению с контролем.

Использование предложенного способа определения биологической активности тканевых препаратов в медицине и ветеринарии позволяет с высокой степенью точности определять активность тканевых препаратов животного и растительного происхождения и производить учет их активности по двум показателям, после чего можно делать вывод о целесообразности введения того или иного препарата в живой организм.

Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:

- сокращается время постановки опыта;

- уменьшаются материальные затраты на проведение опыта;

- используются сухие дрожжи, Saccharomyces cerevisiae, которые в отличие от обычных пекарских не требуют специальных условий хранения и обладают повышенной активностью;

- с целью оптимизации временных затрат проводится стандартизация дрожжевой взвеси, то есть подсчитывается количество дрожжевых клеток до опыта с помощью камеры Горяева и выводится среднее число, в данном случае - 600;

- температура в ходе опыта остается постоянной (33-35°С), так как прибор помещается в термостат суховоздушного типа, имеющийся практически в любой лаборатории;

- реакция начинается через 3-5 минут после помещения прибора в термостат, что существенно превышает скорость реакции по К.Бакырджиеву;

- учет реакции проводится 3 раза, через 30, 60 и 90 минут, а в конце опыта ведется подсчет дрожжевых клеток, вследствие чего об активности препарата судят по двум показателям: объему выделившегося углекислого газа и количеству дрожжевых клеток.

Таким образом, по окончании опыта можно рассматривать влияние тканевого препарата не только на скорость бродильного процесса, но и на скорость деления дрожжевых клеток.

Изобретение относится к ветеринарии. Для определения биологической активности тканевых препаратов готовят взвесь дрожжей 1:20 на физиологическом растворе и 2% раствор глюкозы на дистиллированной воде. Отбирают в опытную пробирку 1 мл тканевого препарата, 1 мл взвеси дрожжей и 28 мл раствора глюкозы. В контрольную пробирку помещают те же компоненты, заменяя тканевый препарат 1 мл стерильного физиологического раствора. Закрывают пробирки герметичными пробками с выведенными наружу стеклянными трубками, концы которых опущены в колбу. Из каждой пробирки перед помещением в термостат берут по 1 капле жидкости и помещают в камеру Горяева, посчитывая количество дрожжевых клеток в пяти больших квадратах камеры. Далее, прибор помещают в термостат, с температурой 33-35°С, время экспозиции 60-90 мин. По окончании опыта из контрольной и опытной пробирок после взбалтывания берут одновременно по 1 капле раствора и помещают в камеру Горяева и проводят подсчет дрожжевых клеток в 5 больших квадратах камеры. Об активности тканевого препарата судят по двум показателям: объему выделившегося углекислого газа и количеству дрожжевых клеток в контрольной и опытных пробирках (до и после окончания опыта). Способ позволяет сократить время постановки опыта, уменьшить затраты на проведение опыта и получить точные результаты биологической активности тканевых препаратов. 3 табл.

Способ определения биологической активности тканевых препаратов, включающий подготовку взвеси дрожжей и 2%-ного раствора глюкозы на дистиллированной воде с последующим отбором в опытную и контрольную пробирки объемом 30 мл, герметичным их закрытием резиновыми пробками с выведенными наружу изогнутыми стеклянными трубками, концы которых опущены в колбу емкостью 100 мл, причем в опытную пробирку производят отбор 1 мл тканевого препарата, 1 мл взвеси дрожжей и 28 мл 2%-ного раствора глюкозы, а в контрольную пробирку помещают те же компоненты, заменяя тканевый препарат 1 мл стерильного физиологического раствора, отличающийся тем, что взвесь дрожжей готовят на стерильном физиологическом растворе, используя при этом сухую культуру дрожжей Saccharomyces cerevisiae, затем пробирки вместе с колбой размещают в термостате при температуре 33-35°С, а время экспозиции составляет 60-90 мин, при этом двуокись углерода, выделяющаяся в опытной и контрольной пробирках, оказывает давление на слой жидкости, которая через выведенную наружу трубку выталкивается в колбу объемом 100 мл, причем измерение выделившейся жидкости проводят в опытной и контрольной пробирках 3 раза, через 30, 60 и 90 мин, после чего опытную и контрольную пробирки встряхивают, берут из каждой по 1 капле, помещают в камеру Горяева и под микроскопом проводят подсчет дрожжевых клеток в пяти больших квадратах, причем пробы из опытной и контрольных пробирок берут одновременно и подсчитывают количество дрожжевых клеток и объем образовавшейся двуокиси углерода.