Способ получения ДНК-полимеразы- @ из ядер печени крыс Советский патент 1986 года по МПК A61K38/43 

Изобретение относится к медицине, в частности к биохимическим способам очистки белков.

Цель изобретения - упрощение способа и стабилизация ползгчаемого, препарата за счет сокращения количества этапов и присутствии соли высокой концентрации.

Способ осуществляется следующим образом.

Получают хроматин из печени крыс. Экстракт хроматина используется для извлечения целевого продукта. Очищают целевой продукт от примеси нуклеиновых кислот путем хроматографии на колонне с ДЕАЕ сефадексом А-25 в 0,3 М NaCl. Очищают от примесных белков: фракционируют белки сульфатом аммония; .очищают целевой продукт от белков путем гель-Фильтрации на сефадексе G-75; очищают целевой продукт от примесей нуклеаз с помощью обработки элюата гидроксилапатитом.

П Р и м е р. Ткань печени крыс любой породы, пола и возраста (60 г) измельчают ножницами и гомогенизируют в стандартном лабораторном (отечественном) гомогенизаторе при 8000 q в 560 мл среды, состава:

руют при 6000q 10 мин. Супернатант отбрасывают. Осадок представляет собой хроматин, который ресуспендируют и гомогенизируют 10 раз в гомогени5 заторе Даунса в 100 мл буфера состава: 10 тМ трис-НС1, рН 8,0.

Хроматин в течение 30 мин экстрагируют в соотношении 1:5 по объему в среде состава: 0,3 М НС1, 10 М

10 трис-HCl, рН 8,0 в гомогенизаторе Даунса. Затем центрифугируют при eOOOq 10 мин. Осадок отбрасывают. Супернатант используют для дальнейшей очистки целевого продукта из матина.-Колонку объемом 50 мл с отношением диаметра к высоте 1:4 уравновешивают средой состава: 0,4 М NaCl, ЮгаМ трис-HCl, рН 8,0. Экстрат хрома20 тина пропускают через колонку. При этом отбрасывают элюирующий буфер, составляющий свободный объем колонки и равный 1/3 объема набивки. После этого собирают объем злюата, рав25 ный объему нанесенного препарата. К препарату, полученному после хроматографии на сефадексе ДЕАЕ А-25, добавляют при смешивании за 30 мин сульфат аммония до 50%-ного насьш1ения.

0,25 М сахароза, 5 шМ трис-HCl,рН7,8; 30 Перемешивают 30 мин, после чего цент35

40

1 тМ ЭДТА и 3 тМ MgCl,после чего фильтруют через 8 слоев марли. Получают 600 мл гомогената. Гомоге- нат центрифугируют при 2000 q 15 мин Супернатант отбрасывают. Осадок ядер один раз промывают в 200 мл той же среды. Отмывка состоит в следующем. Осадок ресуспендируют и гомогенизируют 10 раз в слабо притертом гомогенизаторе Даунса (стекЛо/стекло). Затем центрифугируют при 2000 q 5 мин Промывную среду отбрасывают. Осадок ресуспендируют тем же способом в 50 мл среды для гомогенизации.

К ресуспендированным в среде для гомогенизации ядрам прибавляют при Постоянном перемешивании стеклянной палочкой равный объем 1%-ного раствора тритона Х-100 в той же среде и осторсвкно (чтобы не разрушались ядра) 50 перемешивают в течение 1 мин. Затем центрифугируют при 6000 q 10 мин и Супернатант отбрасывают.

Осадок ресуспендируют в 100 мл среды состава: 1%-ный тритон Х-100, ЮшМ трис-HCl, рН 8,0; 2тМ ЭДТА и гомогенизируют 15 раз в гомогенизаторе Даунса, после чего центрифугирифугируют 10 мин при 6000 q и осадок отбрасывают. К супернатанту прибавляют сульфат аммония до концентрации 80% насьш1ения и оставляют до утра. Затем центрифугируют при 6000q 30 мин. Осадок растворяют в 20 мл буфера состава: 1 М NaCl, 10%-ный глицерин, lOmM трис-HCl, рН 8,0. Супернатант фильтруют на вакуумном отсосе через миллипоровый фильтр Сынпор-2. Осадок с фильтра объединяют с осадком после центрифугирования.

Колонку объемом 1000 мл (отношение диаметра к высоте 1:300-) уравновешивают буфером состава: 1 М NaCl, 10%-ный глицерин, lOmM трис-HCl, j)H 8,0. Полученный осадок наносят на колонку и элюируют со скоростью 50-30 мл/ч. Отбрасьюают первые 45% элюата (% от общего объема колонки) и собирают последующие 15% элюата. Стадию вьтолняют без определения ферментативной активности. Элюат диа- 55 лизируют от NaCl к буферу состава: 20idi KHjP04, 10%-ный глицерин, рН7,5.

К отдиализовакному элюату в стакане добавляют 10-15 мл гидроксилапа45

руют при 6000q 10 мин. Супернатант отбрасывают. Осадок представляет собой хроматин, который ресуспендируют и гомогенизируют 10 раз в гомогенизаторе Даунса в 100 мл буфера состава: 10 тМ трис-НС1, рН 8,0.

Хроматин в течение 30 мин экстрагируют в соотношении 1:5 по объему в среде состава: 0,3 М НС1, 10 М

трис-HCl, рН 8,0 в гомогенизаторе Даунса. Затем центрифугируют при eOOOq 10 мин. Осадок отбрасывают. Супернатант используют для дальнейшей очистки целевого продукта из хроматина.-Колонку объемом 50 мл с отношением диаметра к высоте 1:4 уравновешивают средой состава: 0,4 М NaCl, ЮгаМ трис-HCl, рН 8,0. Экстрат хроматина пропускают через колонку. При этом отбрасывают элюирующий буфер, составляющий свободный объем колонки и равный 1/3 объема набивки. После этого собирают объем злюата, равный объему нанесенного препарата. К препарату, полученному после хроматографии на сефадексе ДЕАЕ А-25, добавляют при смешивании за 30 мин сульфат аммония до 50%-ного насьш1ения.

Перемешивают 30 мин, после чего цент

рифугируют 10 мин при 6000 q и осадок отбрасывают. К супернатанту прибавляют сульфат аммония до концентрации 80% насьш1ения и оставляют до утра. Затем центрифугируют при 6000q 30 мин. Осадок растворяют в 20 мл буфера состава: 1 М NaCl, 10%-ный глицерин, lOmM трис-HCl, рН 8,0. Супернатант фильтруют на вакуумном отсосе через миллипоровый фильтр Сынпор-2. Осадок с фильтра объединяют с осадком после центрифугирования.

Колонку объемом 1000 мл (отношение диаметра к высоте 1:300-) уравновешивают буфером состава: 1 М NaCl, 10%-ный глицерин, lOmM трис-HCl, j)H 8,0. Полученный осадок наносят на колонку и элюируют со скоростью 50-30 мл/ч. Отбрасьюают первые 45% элюата (% от общего объема колонки) и собирают последующие 15% элюата. Стадию вьтолняют без определения ферментативной активности. Элюат диа- лизируют от NaCl к буферу состава: 20idi KHjP04, 10%-ный глицерин, рН7,5.

К отдиализовакному элюату в стакане добавляют 10-15 мл гидроксилапа

тита и в .течение 30 мин перемешивают Затем центрифугируют при 6000 q 5 мин Супернатант отбрасывают. Осадок ре- суспендируют в 25 мл буфера состава: 70тМ , 10%-ный глицерин,рН 7,5 10.мин перемешивают и центрифугируют при 6000 q 5 мин. Супернатант отбрасывают. Осадок отмывают таким же образом, тем же буфером еще два раза. При этом р-полимераза не смьюается с гидроксилапатита. Осадок после третьей отмывки ресуспейдирзпот в 20 мл буфера состава: ЗООшМ KHjPO, 10%-ный глицерин, рН 7,5; перемешивают 30 мин, центрифугируют при 6000 q 5 мин. Супернатант представляет собой препарат р-полимеразы.

Фермент хранят в 50%-ном глицерине, 0,1 М NaCl, 0,05mM трис-HCl, йН 8,0 при 20 С. Препарат сохраняет свою активность в течение 6 мес.Условия хранения значительно проще (тем- пература 20 С, отсутствуют растворы, загрязняющие препарат).

В таблице представлены результа- ты очистки целевого продукта на разГомогенат печени 600

Экстракт хроматина

в 0,3 М NaCl 90

Сульфат аммония 50-80%-ного на- сьщеняя20

26 15600 0,0075 117

90 1,1

2,5 50 0,375

Составитель М.Позняк Редактор Е. Папц Техред И.Попович Корректор Л. Пштипенко

Заказ 2722/6 Тираж 660 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

личнь1х стадиях. Из сопоставления значений первой и последней стадий видно, что активность возрастает с 0,0075 до 50,0 ед.на 1 мг белка. Выход целевого продукта по общей ферментативной активности составляет 80%.

За 1 единицу активности фермента принимают количество фермента, катализирующего вкл1рченив в ДНК 1 нТ моль общего НТФ за t ч при 37 С в оптимальных условиях инкубации.

В известном способе достигается очистка целевого продукта в 800 раз по сравнению с ядрами из гомогената печени.

Упрощение способа происходит за счет сокращения количества этапов (известный способ - 10, предлагае- - 7), времени выделения конечного продукта в результате отсутствия длительных этапов диализа и многочасового высокоскоростного центрифугирования.

90 1,1