Способ получения рибонуклеазы Н из ЕSснеRIснIасоLI Советский патент 1989 года по МПК C12N9/22 

1

Ш) 4329716/28-13

(22) 17.11.87

(46) 23.07.89. Бкш. № 27

(71)Научно-производственное объединение Биолар

(72)Н.В.Чичкова, В.Э.Пейсениекс и И.К.Залите

(-53) 577.15 (088.8)

(56)Darlix I.L, Eur.I. Biochem., 1975, 51, 369-376.

Berkower L., Leis I., Hurwits I. I.Biol. Chem. 1973, 248, 5914-5921.

Itoh. Т., Towizawa I. Nucl. Acids. Res., 1982, 10, 5949-5965. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБОНУКЛЕАЗЫ Н ИЗ ESCHERICHIA COLI

(57)Изобретение относится к биохимии и молекулярной биологии для специфической фрагментации РНК и рибонуклео- протеидных компонентов, для получения рекомбинатных вирусных РНК и репликации плазменных ДНК в присутствии РНК-полимеразы и ДНК-полимеразы J. Целью изобретения является повьшение выхода целевого продукта и упрощение процесса. Способ получения РНК-азы Н включает разрушение биомассы, осветление низкосортным центрифугированием, освобождение от внутриклеточных компонентов ультрацентрифугированием, грубое фракционирование клеточного экстракта осаждением сульфатом аммония и очистку хроматографией на ци- бакрон-синий-агарозе и аминогексилагарозе при рН 7,6-7,9 и ионной силе OJ) М КС1. Полученный препарат свободен от примесей посторонних нуклеаз и пригоден для использования в молекулярно-биологических исследованиях. Выход целевого продукта повышается по сравнению с известным способом в 25 раз, достигая 750 тыс. ед/кг биомассы. 2 табл.

о «

Изобретение относится к биохимии и молекулярной биологии для специфической фрагментации РНК и рибонуклеопротеидных компонентов, для получения рекомбинатных вирусных РНК и репликации плазмидных ДНК в присутствии РНК-полимеразы и ДНК-полимеразы 1. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта и упрощение процесса. Способ получения РНК-азы Н включает разрушение биомассы, осветление низкоскоростным центрифугированием, освобождение от внутриклеточных компонентов ультрацентрифугированием, грубое фракционирование клеточного экстракта осаждением сульфатом аммония и очистку хроматографией на цибакрон-синий-агарозе и аминогексилагарозе при рН 7,6-7,9 и ионной силе 0,045-0,055 М КС1. Полученный препарат свободен от примесей посторонних нуклеаз и пригоден для использования в молекулярно-биологических исследованиях. Выход целевого продукта повышается по сравнению с известным способом в 25 раз, достигая 750 тыс. ед/кг биомассы. 2 табл.

Изобретение относится к биохимии и молекулярной биологии, в частности к получению бактериальных нуклеаз..

Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта - РНК- азы Н.

Экстракт биомассы подвергают ультрацентрифугированию и надсадок после фракционирования осаждением сульфатом аммония Очищают от балластных белков хроматографией на цибакрон-синий-ага- розе и аминогексилагарозе при рН 7,6-7,9 и ионной силе 0,045-0,055 М КС1.

В общем виде схема получения выглядит следукшщм образом: разрушение клеток, осветление - буфер А; ультрацентрифугирование - буфер А; фракционирование суль5)атом аммония - буфер А; хроматография на цибакрон-синий- агарозе - буфер Б; концентрирование на фосфоцеллюлозе - буфер Б; хроматография на аминогексилагарозе - буфер Б; концентрирование на фосфоцеллюлозе - буфер В, где А - 0,05 М трис-HCl рН 7,5, 0,01 М MgCl, 0,25 М КС1, 0,1 мМ:ДТТ, 0,1 1 ЭДТА, 5% глицерина; Б - 0,02 М трис-НС рН 7,9,

4 ( СЛ СО 3149

0,1 мМ ДТТ, 0,1 мМ ЭДТА, 0,05 М КС1, 51 глицерина.

Схема вь деления позволяет заметно сократить по сравнению с известным способом затраты времени и реактивов и увеличить выход целевого продукта в 25 раз. Сокращение времени достигается за счет ультрацентрифугирования, уменьшения числа и упрощения хромато- графических стадий. Увеличение выхода обеспечивается использованием биоспецифических сорбентов, ранее не использовавшихся для вьщеления РНКазы Но Хроматография на цибакрон-синий- агарозе при рН 7,6-7,9 позволяет в одну стадию освободиться от большой части балластных клеточных белков и добиться сильного обогащения целевым продуктом практически без потерь последнего. Хроматография на амино- гексилагарозе при ионной силе 0,04;5- 0,055 М НС1 и рН 7,6-7,9 обеспечивает окончательную очистку от примесных нуклеаз. Число хроматографических стадий снижается с пяти до двух, количество используемых буферных растворов - с 6 до 2.

Выход целевого продукта, пригодного для использования в молекуляр- ной биологии, увеличивается с 30,5 до 750 тыс, ед/кг биомассы.

Пример 1. 1,0 кг замороженных клеток Е. coli МРЕ 600 суспендируют в ровном объеме буфера А и раз- рушают в дезинтеграторе Мантона-Гау- лина 15М-8ТА при давлении 500-600 атм суспензию разбавляют буферным раствором до 15 л, добавляют 0,2 мг ДНКазы (свободной от рибонуклеаз) ипереме- шивают 30 мин.

Клеточные осколки удаляют центрифугированием на центрифуге в роторе gSA 30 мин при 12000 об/мин.

Рибосомы удаляют ультрацентрифуги рованием на центрифуге Beckman 15- 50 в зональном роторе Ti-155 ч при 28000 об/мин.

К супернатанту (1500 мл) добавля- ют сухой аммоний сернокислый из расчета 22 г на каждые 100 мл суперна- танта. При этом добавляют сухой (трис)-оксиметиламинометан, поддерживая рН 7,8. Образовавшийся осадок удаляют центрифугированием на центри фуге в роторе gS3 30 мин, при 7000 об/мин. К прозрачному супернатанту добавляют еще 14 г аммония сернокислого на каждые 100 мл раст,.

вора. Осадок собирают центрифугированием на центрифуге и растворяют в минимальном объеме буфера В, -Раствор диализуют против буфера В, Выпавший осадок удаляют центрифугированием на центрифуге в роторе gSA 30 мин при 12000 об/мин.

Осветленный раствор наносят на колонку с цибакрон-синий-агароза (уравновешенный буфером В, объем колонки 400 мл, диаметр 2,6 см, длина 75,5 см) со скоростью 100 мл/ч. Колонку промывают 1 л буфера В, после чего подключают градиент концентрации КС1 (0,05-0,7 М) в буфере В. Во фракциях градиента проверяют активность рибонуклеазы Н и фракции с максимальной активностью фермента объединяют и концентрируют на колонке с фосфоцеллюлозой (объем 10 мл). Концентрированный фермент с фосфоцеллю- лозы элюируют в буфере В, содержащем 1М хлористый калий, и диализуют против буфера В.

Отдиализированный материал нанося на колонку с аминогексилагарозой (уравновешенной в буфере В, объем колонки 500 мл, диаметр 2,6 см длина 94,5 см) со скоростью 200 мл/ч Колонку промывают буфером В. Во фракциях элюата проверяют активность рибонуклеазы Н и побочных рибонуклеазо Фракции, содержащие ферменты без по бочных активностей, объединяют и консервируют добавлением глицерина до конечной концентрации 50%.

Выход 750 тыс. ед., удельная ак- -.тивность 400 тыс. ед/мг белка. Препарат проверяют на следовые примеси ферментных активностей дезоксирибо- нуклеаз, рибонуклеаз, рибонуклеазы III. Перечисленные ферментативные активности отсутствуют.

За единицу активности принимают ся количество фермента, катализирующе образование 1 мкмоль кислотораство- римых нуклеотидов за 20 мин при 37 С с использованием в качестве субстрата (С 14) поли (гА), поли (dt).

Влияние изменений рН на выход целевого продукта в предельных (примеры 2 и 3) и запредельных (примеры 4 и 5) значениях показано в табл.1; изменение выходов РНКазы Н в зависимости от ионной силы на стадии очистки на аминогексилагарозе - в табл.2.

Формула изобретения

Способ получения рибонуклеазы Н из Escherichia coli, включающий дезинтеграцию биомассы, получение экстракта отделением клеточного дебриса низкоскоростным центрифугированием, фракционирование экстракта сульфатом аммония, очистку хроматографией и концентрирование на фосфоцеллдо- лозе, отличающийся тем.

что, с целью повышения выхода целевого продукта и упрощение процесса, экстракт подвергают ультрацентрифугированию, фракцион1трутот надосадок сульфатом аммония, диализуют против стартового буфера для цибакрон-синий- агарозы с последующей хроматографи- ческой очисткой на цибакрон-синий- агарозе и аминогексилагарозе при рН 7,6-7,9 и ионной силе 0,045-0,055 М хлористого калия.

Таблица