Способ получения рибонуклеазы Советский патент 1986 года по МПК A61K35/60 

00

00 00 4

сл Изобретение относится к химикофармацевтичеекой промышленности и касается производства ферментных препаратов. Известен способ получения рибонуклеазы путем экстрагирования пече ни рыб кисль водным раствором с по ледующим фракционированием экстракта сульфатом аммония обессоливанием и очисткой. Однако известньш способ не обеспечивает высокого выхода рибонук- леазы. Известным способом получают 1,3м рибонуклеазы (по белку), что состав ляет 23% от активности рьфого ферментного препарата. Очистка фермента достигнута в 96 раз. Цель изобретения - згвеличение выхода целевого продукта. Эта цель достигается тем, что способ ползгчения рибонуклеазы осуществляют путем экстрагирования печени рыб кислым водным раствором с последующим фракционированием экстракта сульфатом аммония, обессолива нием и очисткой, в качестве источни ка сырья используют печень минтая и очистку осуществляют на фосфоцеллюлозе и затем дополнительно рехром тографируют на том же сорбенте. Пример. 150 г свежемороженной печени минтая мелко измельчают и экстрагируют кислым водным раство ром (дистиллированная вода или физи ологический раствор, подкисленные серной кислотой до рН 2,5-3,0) (1-3 вес./объем) в скоростном элект рогомогенизаторе, центрифугируют пр 8000 Q в течение 30 мин при . Супернатантсобирают, операцию повт ряют еще раз для полного извлечения .фермента из ткани. К объединенному супернатанту добавляют сульфат аммо ния 30% насыщения при 20°С, перемеш вают дс) полного растворения соли и оставляют на 10-12 часов при 4 С для формирования осадка белка, филь руют через двойной бумажный фильтр при 4°С. Собранный осадок белка рас воряют в минимальном объеме 0,05 М аммоний-ацетатного буфера, 0,002 М ЭДТА, рН 5,3-5,4, обессоливают на колонке сефадекс Г-25, уравновешенной этим же буфером со скоростью 220-240 мл/ч. Обессоленный сырой ферментный пр парат адсорбируют на квлонке с фосф 45 целлюлозой (1,5 45 см), уравновешенной 0,05 М аммоний-ацетатным буфером 0,002 М ЭДТА, рН 5,3-5,4, -промьшают колонку этим же буфером до исчезновения УФ-поглощения в элюате при А - 280 нм и элюируют фермент 0,01 М фосфатньм буфером 0,002 М ЭДТА, рН 7,1. Фракции, содержащие рибонуклеазную активность, объединяют, подкисляют 1%-ной уксусной кислотой до рН 5,5 и адсорбируют на колонке с фосфоцеллюлозой (объем колонки 2 мл), уравновешенной 0,05 М аммоний-аце- , татным буфером, содержащим 0,002 М ЭДТА, рН 5,5. Конечньй целевой продукт элюируют медленной скоростью (6-8 мл/ч), 0,2 М фосфатньм буфером, содержащим 0,002 М ЭДТА, рН 7,1. На этом этапе наряду с дополнительной очисткой происходит концентрирование целевого продукта. Из 150 г печени минтая получают 0,9 мг рибонуклеазы (по белку), выход фермента по активности составляет 43,4%, достигнута 278 - кратная очистка фермента. Исследование рибонуклеазы, получаемой по предлагаемому способу, показало, что: а) оптимум рН 5,5-5,8J б)температурный оптимум 37 С; в)фермент для проявления активности не требует двухвалентных катионов металлов и ЭДТА, двухвалентные 1ионы металлов не ингибируют ферментативную активность; г)рН стабильность: 4,0-8,OJ д)лиофильно высушенный препарат стабилен в течение 3-х месяцев при С. Данные процесса хроматографической очистки кислой рибонуклеаэы из печени минтая от стадии получения сырого ферментного препарата до выходу целевого продукта приведены в таблице. За единицу активности фермента принимали такое количество фермента, которое за 20 мин инкубации при Т 37°С приводит к образованию 1 ОЕ спирторастворимых продуктов гидролиза субстрата. Предложенный способ позволяет увеличить выход рибонуклеазы по активности почти в 2 раза 43,4% по сравнению с выходом фермента, получаемого по известному способу, степень очистки по активности 278,3 раза. Способ непродолжителен во времени, требуется 5-6 дней для получения целевого продукта. Фермент после кислой экстракции из ткани, фракционного высаливания, обессоливания и двухстадийной хроматографической

очистки на фосфоцеллюлозе является электрофоретически гомогенным и не содержит других примесных ферментативных активностей (ДНКазной, фосфотазной фосфодиэстеразной).

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБОНУКЛЕ- АЗЫ путем экстрагирования печени рыб кислым водньм раствором с последующим фракционированием экстракта сульфатом аммония, обессоливанием и очистки, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, в качестве источника сырья используют печень минтая и очистку осуществляют на фосфоцеллю- лозе и затем дополнительно рехромато- графируют на том же сорбенте.

576

3456

2132 4

1500 0,9

10098,8

61,7

533

43,4

278,3

1670