ТЕСТ-НАБОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ И ПЕРВИЧНОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 2006 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, касается производства диагностических препаратов и может быть использовано при индивидуальном подборе лекарственных препаратов для лечения туберкулеза.

В практических лабораториях России для определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза в основном используют среду Левенштейна-Йенсена лабораторного приготовления с добавлением противотуберкулезных препаратов, рекомендованную к применению Приказом МЗ РФ №109 (Приложение 11. Инструкция по унифицированным методам микробиологических исследований при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза) [1]. Однако использование этой среды позволяет получить данные о лекарственной чувствительности возбудителя лишь через 3-5 недель. Кроме этого среды лабораторного приготовления являются нестандартными, что приводит к получению недостоверных результатов.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является набор для определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза «Mycobiogramme» производства французской фирмы «BioMerieux» [2], состоящий из пробирок со средой Левенштейна-Йенсена следующего состава, г/л:

калия дигидрофосфат1,50 гмагния сульфат0,15 гмагния цитрат0,38 гL-аспарагин2,25 гглицерин7,50 млкрахмал картофельный18,75 гмалахитовый зеленый0,25 гяичная масса625 млдистиллированная вода375 мл

с добавлением противотуберкулезных препаратов в концентрациях, мкг/мл:

изониазид0,1изониазид1,0рифампицин20,0рифампицин40,0стрептомицин4,0стрептомицин10,0этамбутол2,0этамбутол3,0ПАСК (парааминосалициловая кислота)0,5ПАСК1,0пиразинамид200,0

Определение лекарственной чувствительности микобактерий с использованием набора-прототипа проводят визуально по наличию видимого роста. Этот процесс длительный и занимает от 14 до 28 дней, что значительно осложняет своевременную корреляцию проводимого больному этиотропного лечения. Помимо этого набор - дорогостоящий и недоступен большинству практических лабораторий России.

Задачей настоящего изобретения является создание тест-набора для ускоренного определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза с их одновременной первичной идентификацией по появлению красной окраски.

Поставленная задача решается тем, что разработан тест-набор для определения лекарственной чувствительности и первичной идентификации микобактерий туберкулеза на основе среды Левенштейна-Йенсена с добавлением противотуберкулезных препаратов, отличающийся тем, что набор состоит из 8 флаконов со средой Левенштейна-Йенсена, дополнительно содержащей нитрат натрия или нитрат калия в концентрации 0,6-1,2 г/л, а крахмал - в растворимой форме в концентрации 15,0-20,0 г/л, при этом четыре флакона, предназначенные для определения лекарственной чувствительности, дополнительно содержат противотуберкулезные препараты, первый флакон - изониазид в концентрации 1 мкг/мл, второй флакон - рифампицин в концентрации 40 мкг/мл, третий - стрептомицин в концентрации 10 мкг/мл, четвертый - этамбутол в концентрации 2 мкг/мл, два флакона, предназначенные для первичной идентификации микобактерий туберкулеза, один из которых дополнительно содержит салицилат натрия в концентрации 1000 мкг/мл, а другой - 2-тиофенкарбоксигидразид в концентрации 2 мкг/мл, два флакона являются контрольными, и дополнительно набор содержит один флакон с реактивом Грисса для регистрации результатов по появлению красной окраски.

Предлагаемый тест-набор по сравнению с прототипом характеризуется короткими сроками 2-7 суток определения лекарственной чувствительности микобактерий по появлению красной окраски, возможностью в эти же сроки провести идентификацию микобактерий. Это достигается за счет

1) введения в среду Левенштейна-Йенсена крахмала в растворимой форме, что улучшает ростовые свойства среды, повышает скорость роста микобактерий, сокращает сроки учета результатов и не влияет на критические концентрации противотуберкулезных препаратов (табл.1, 2),

2) введения в среду нитрата натрия или калия, а в состав тест-набора реактива Грисса, что позволяет провести учет результатов по появлению красной окраски, не дожидаясь видимого роста микобактерий на среде.

3) использования в составе тест-набора одного флакона с салицилатом натрия и одного флакона с 2-тиофенкарбоксигидразидом, совокупность которых позволяет провести первичную идентификацию анализируемой культуры микобактерий (табл.3).

Таблица 1
Влияние используемой формы крахмала на скорость роста M.tuberculosisМикобактерииВремя культивирования при 37°С (сут.)Контрольный флакон (Среда Левенштейна-Йенсена с нитратом натрия или калия)крахмал в растворимой формекрахмал картофельный (из прототипа)М.tuberculosis 17Красная окраскаОкраски нетМ.tuberculosis 27Красная окраскаРозовая окраскаМ.tuberculosis 37Розовая окраскаОкраски нетM.tuberculosis 46Красная окраскаРозовая окраскаM.tuberculosis 55Розовая окраскаОкраски нетM.tuberculosis 65Розовая окраскаОкраски нетM.tuberculosis 76Красная окраскаОкраски нетM.tuberculosis 86Красная окраскаОкраски нетM.tuberculosis 94Розовая окраскаОкраски нетКрасная окраска - характеризует интенсивный рост культуры
Розовая окраска - характеризует слабый рост культуры
Окраски нет - отсутствие роста культуры

Таблица 2
Влияние формы крахмала на результаты определения лекарственной чувствительности M.tuberculosisИсследуемый изолятСрок наблюденияКрахмалКонтрольКонтрольИзониазидРифампицинСтрептомицинЭтам-бутолНатрия салицилатТКГМ.tuberculosis H37Ra7Раств. форма++-----+7Карт.++---+-+М.tuberculosis Академия7Раств. форма++-----+7Карт.+++-+--+М.tuberculosis 1387Раств. форма++--+--+7Карт.++--++-+М.tuberculosis 87Раств. форма+++----+7Карт.++++---+M.tuberculosis 1187Раств. форма++-+---+7Карт.++++-+-+* + - наличие красной окраски во флаконах
- - отсутствие красной окраски во флаконах

Пример 1.

Приготовление питательной среды. Навески ниже перечисленных ингредиентов питательной среды:

калия дигидрофосфат1,50 гнатриянитрат1,00 гмагния сульфат0,15 гмагния цитрат0,38 гL-аспарагин2,25 гглицерин7,50 млкрахмал в растворимой форме18,75 гмалахитовый зеленый0,25 г

растворяют в указанной последовательности в 375 мл дистиллированной воды при подогревании, не доводя до кипения, и стерилизуют в автоклаве 20 мин при температуре 121°С.

После охлаждения к основе питательной среды добавляют 625 мл яичной массы, фильтруют.

Пример 2.

Питательную среду готовят, как описано в примере 1, но ингредиенты, отличающие среду от среды Левенштейна-Йенсена: калия нитрат и крахмал в растворимой форме, используют в следующих концентрациях:

калия нитрат1,2 гкрахмал растворимый20,0 г

Пример 3.

Питательную среду готовят, как описано в примере 1, но натрия нитрат и крахмал в растворимой форме, используют в следующих концентрациях:

калия нитрат0,6 гкрахмал растворимый15,0 г

Пример 4.

Приготовленную питательную среду в соответствии с примерами 1, 2, 3 разливают поровну в восемь стерильных колб.

В шесть колб вносят при перемешивании один из следующих препаратов:

изониазид - 0,125 мг,

рифампицин - 5 мг,

стрептомицин - 1,25 мг,

этамбутол - 0,25 мг,

натрия салицилат - 125 мг,

2-тиофенкарбоксигидразид (ТКГ) - 0,25 мг

для получения конечных концентраций изониазида - 1 мкг/мл, рифампицина - 40 мкг/мл, стрептомицина - 10 мкг/мл, этамбутола - 2 мкг/мл салицилата натрия - 1000 мкг/мл, ТКГ - 2 мкг/мл. Затем содержимое всех восьми колб разливают в стерильные флаконы и проводят термокоагуляцию.

Тест-набор комплектуют в соответствии с составом:

Питательная среда (контроль)- 2 флакона,Питательная среда с 1 мкг/мл изониазида- 1 флакон,Питательная среда с 40 мкг/мл рифампицина- 1 флакон,Питательная среда с 10 мкг/мл стрептомицина- 1 флакон,Питательная среда с 2 мкг/мл этамбутола- 1 флакон,Питательная среда с 1000 мкг/мл салицилата натрия- 1 флакон,Питательная среда с 2 мкг/мл ТКГ- 1 флакон,Реактив Грисса- 1 флакон.

Хранение тест-набора осуществляют в темном месте при температуре 2-8°С не более 5 месяцев.

Пример 5.

Определение лекарственной чувствительности культур микобактерий проводят параллельно на предлагаемом тест-наборе и на наборе-прототипе. На тест-наборе дополнительно осуществляют первичную идентификацию микобактерий туберкулеза. Определение лекарственной чувствительности и первичную идентификацию микобактерий туберкулеза осуществляют методом, основанным на способности микобактерий туберкулеза восстанавливать нитраты в нитриты. Нитраты легко определяются с помощью реактива Грисса, который вызывает появление красной окраски. Определение лекарственной чувствительности микобактерий с использованием набора-прототипа осуществляют методом пропорций по наличию видимого роста.

Восемь флаконов с питательными средами предлагаемого тест-набора засевают культурами микобактерий туберкулеза в соответствии с Приказом МЗ РФ №109. Пробирки с питательными средами набора-прототипа засевают в соответствии с инструкцией по применению.

Учет результатов на прототипе проводят через 14-28 суток инкубирования посевов по наличию визуального роста микобактерий, на предлагаемом тест-наборе - через 2-7 суток по изменению окраски путем внесения реактива Грисса в виде водного 7,5% раствора реактива Грисса в количестве 0,5 мл или в сухом виде в количестве нескольких кристалликов в каждый из 8 флаконов тест-набора. Культура считается чувствительной к противотуберкулезному препарату, если во флаконе с данным препаратом не происходит появления красной окраски (при интенсивной окраске в контрольном флаконе). Культура считается устойчивой при появлении красной окраски во флаконе с противотуберкулезным препаратом.

Первичную идентификацию микобактерий туберкулеза проводят по появлению красной окраски во флаконе с ТКГ и отсутствию красной окраски во флаконе с салицилатом натрия. Нетуберкулезные микобактерии, обладающие способностью восстанавливать нитраты в нитриты, вызывают одновременное появление красной окраски во флаконах и с салицилатом натрия, и с ТКГ.

Результаты испытаний трех примеров тест-набора получились идентичными и представлены в таблицах 3,4.

Таблица 3
Определение лекарственной чувствительности и первичная идентификация микобактерийИсследуемый изолятСрок наблюденияКонтрольНатрия салицилатТКГИзониазидРифампицинСтрептомицинЭтам-бутолМ. tuberculosis H37Ra7*+-+----М. tuberculosis 1357+-+++++М. tuberculosis6+-++---

Исследуемый изолятСрок наблюденияКонтрольНатрия салицилатТКГИзониазидРифампицинСтрептомицинЭтам-бутол138        М. kansasii 4137++++-++М. fortuitum 122++++++++ - наличие изменения окраски во флаконах
- - отсутствие изменения окраски во флаконах

Данные, представленные в таблицах, позволяют охарактеризовать исследуемые культуры, как штамм М. tuberculosis H37Ra, чувствительный к четырем лекарственным препаратам; клинический изолят М. tuberculosis 135, устойчивый к изониазиду, рифампицину, стрептомицину, этамбутолу; клинический изолят М. tuberculosis 138, устойчивый к изониазиду, а также М. kansasii 413, устойчивый к изониазиду, стрептомицину, этамбутолу и М. fortuitum 12, устойчивый ко всем четырем противотуберкулезным препаратам, что полностью совпадает с результатами, полученными на наборе-прототипе.

Таблица 4
Сроки определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулезаИсследуемый материалСроки окончания наблюдения (сутки)Совпадение результатов (%) по чувствительноститест-наборпрототипМ tuberculosis 129728100М. tuberculosis 131628100М. tuberculosis 106728100M. tuberculosis 112528100M. tuberculosis 107521100

Исследуемый материалСроки окончания наблюдения (сутки)Совпадение результатов (%) по чувствительноститест-наборпрототипМ. tuberculosis 104728100М. tuberculosis 156628100M. tuberculosis 161728100M. tuberculosis 130728100M. tuberculosis 147728100M. fortuitum 12214100M. tuberculosis H37Ra721100M. tuberculosis 135521100M. tuberculosis 138528100

Из приведенных данных видно, что использование предлагаемого тест-набора приводит к сокращению сроков определения лекарственной чувствительности микобактерий до 2-7 суток по отношению к 14-28 суткам на наборе-прототипе при 100% совпадении результатов. Кроме определения лекарственной чувствительности предлагаемый тест-набор позволяет провести дополнительно первичную идентификацию микобактерий туберкулеза.

Предлагаемый тест-набор нетрудоемок и удобен в использовании, не требует дополнительного оборудования и специальной подготовки персонала, и что немаловажно, дешев, а по срокам определения лекарственной чувствительности приближается к автоматизированным системам типа ВАСТЕС.

Разработана технология и организовано производство промышленного изготовления тест-набора в удобной упаковке для транспортировки и последующей работы. Промышленное производство с осуществлением входного контроля сырья и контроля конечного продукта позволяет производить стандартные недорогие тест-наборы. Проведены клинические испытания тест-набора в пяти регионах страны при исследовании около 1000 клинических изолятов микобактерий туберкулеза, получены положительные результаты. Оформлен пакет научно-технической документации на производство тест-набора, который находится на утверждении в Фармакопейном комитете.

Использование во фтизиобактериологических лабораториях предлагаемого тест-набора промышленного изготовления позволит ускорить определение лекарственной чувствительности микобактерий, увеличить надежность получаемых результатов, а также даст возможность получать сравниваемые данные по регионам для точной оценки эпидемической ситуации в стране. А удобная форма выпуска в герметично закрытых флаконах и достаточный срок хранения позволяет доставлять и использовать тест-наборы в самых отдаленных регионах страны.

Источники информации

1. О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации. Приказ МЗ РФ №109 от 21.03.03 г.

2. Culture Media Manual, bio Merieux, 1994 Edition.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологии и может быть использовано при индивидуальном подборе лекарственных препаратов для лечения туберкулеза. Тест-набор на основе среды Левенштейна-Йенсена состоит из 8 флаконов. Четыре флакона из которых дополнительно содержат противотуберкулезные препараты, первый флакон - изониазид, второй флакон - рифампицин, третий - стрептомицин, четвертый - этамбутол. Следующие два флакона, один из которых дополнительно содержит салицилат натрия, а другой - тиофенкарбоксигидразид. Другие два флакона являются контрольными. Набор дополнительно содержит один флакон с реактивом Грисса. Изобретение позволяет ускорить определение лекарственной чувствительности и проводить одновременно их идентификацию. 4 табл.

Тест-набор для определения лекарственной чувствительности и первичной идентификации микобактерий туберкулеза на основе среды Левенштейна-Йенсена с добавлением противотуберкулезных препаратов, отличающийся тем, что набор состоит из 8 флаконов со средой Левенштейна-Йенсена, дополнительно содержащей нитрат натрия или нитрат калия в концентрации 0,6-1,2 г/л, а крахмал - в растворимой форме в концентрации 15,0-20,0 г/л, при этом четыре флакона, предназначенные для определения лекарственной чувствительности, дополнительно содержат противотуберкулезные препараты, первый флакон - изониазид в концентрации 1 мкг/мл, второй флакон - рифампицин в концентрации 40 мкг/мл, третий - стрептомицин в концентрации 10 мкг/мл, четвертый - этамбутол в концентрации 2 мкг/мл, два флакона, предназначенные для первичной идентификации микобактерий туберкулеза, один из которых дополнительно содержит салицилат натрия в концентрации 1000 мкг/мл, а другой - 2-тиофенкарбоксигидразид в концентрации 2 мкг/мл, два флакона являются контрольными, и дополнительно набор содержит один флакон с реактивом Грисса для регистрации результатов по появлению красной окраски.