СПОСОБ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКОБАКТЕРИЙ КОМПЛЕКСА MAIS (MYCOBACTERIUM AVIUM, M.INTRACELLULARE, M.SCROFULACEUM) И M.TUBERCULOSIS Российский патент 2008 года по МПК C12Q1/68 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, в частности к способу видовой идентификации комплекса MAIS (Mycobacterium avium, M.intracellulare, M.scrofulaceum («MAIS-диф.»)) и их отличия от M.tuberculosis. Для определения вида используют амплификацию фрагмента гена hsp65, который ответственен за синтез белка теплового шока, с последующим анализом полиморфизма профилей рестрикции ампликонов после их разделения в агарозе.

В последние годы возросла частота заболеваний, вызываемых нетуберкулезными (атипичными) микобактериями, клиническое проявление которых сходно с течением туберкулезного процесса. В первую очередь, это связано с широким распространением среди населения болезней с признаками иммунодефицитных состояний разного происхождения, в частности микобактерии комплекса MAIS вызывают хронические легочные инфекции, адениты внутригрудных лимфатических узлов у детей. Кроме того, они часто являются возбудителями системных микобактериальных инфекций у больных СПИДом. В США от 25 до 50% взрослого и до 10% детского населения, инфицированных вирусом первичного иммунодефицита (ВИЧ), заражено M.avium, что приводит к развитию трудно поддающихся лечению микобактериозов, сокращающих жизнь пациентов (Musser J. Antimicrobial agents resistance in mycobacteria: molecular genetic insights // Clinical Microbiology Review. - 1995. - v.8. - p.496-514). В присутствии микобактерий наблюдается повышение уровня ВИЧ в плазме крови в 160 раз. Частота распространения диссеминированной инфекции, вызванной возбудителями комплекса MAIS, пропорциональна длительности и тяжести иммуносупрессии, вызванной ВИЧ инфекцией, и связана со снижением числа CD4 + Т-лимфоцитов (McCarthy M. Active tuberculosis boosts HIV replication//Lancet. - 1996. - v.348. - N. 9024. - p.393). M.tuberculosis в сочетании с ВИЧ встречается также часто, особенно у молодых больных (25-44 года). Смертность ВИЧ-инфицированных, больных туберкулезом, выше, чем смертность таких больных без туберкулеза. Большинство ВИЧ-инфицированных больных с туберкулезом поддаются лечению при использовании обычных схем. Однако введение в практику новых высоко активных антиретровирусных средств отрицательно сказывается на эффективности противотуберкулезных средств (Shiuger Neil W. Issues in the treatment of active tuberculosis in human immunodeficiency virus-infected patiets // Clin. Infec. Diseases. - 1999. - v.28. - p.130-135).

Таким образом, определение вида микобактерии и, особенно, дифференциация М.tuberculosis от других видов имеет большое значение для выбора тактики лечения больного.

Видовая дифференциация важна и потому, что некоторые виды микобактерии имеют природную устойчивость к некоторым лекарственным препаратам. Так, M.bovis, М.marinum, M.avium, M.intracellulare устойчивы к пиразинамиду (Блум Б.Р. Туберкулез. Патогенез, защита, контроль: Пер. с англ. М. Медицина. - 2002. - 676 с.; Scorpio A., Lindholm-Levy P., Heifets L., Gilman R., Sddiqi S., Cynamon M., Zhang Y. Characterization of pncA mutations in pirazinamide-Resistant M.tuberculosis // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - 1997. - v.41. - p.540-543). Некоторые штаммы M.avium и M.intracellulare резистентны к рифампицину (Telenti A., Genetics of drug resistance in tuber-culosis // Tuberculosis. - 1997. - v.18. - p.55-64).

Методы дифференциации микобактерий основаны на их культуральных, биохимических и генетических различиях.

Культуральные тесты определения вида основаны на различиях в способности роста на питательных средах со специальными добавками, либо на том, что для разных видов микобактерий оптимальной является различная температура и они также отличаются разной скоростью роста. Главными недостатками этого метода являются длительность проведения исследования (до 2-3 месяцев), относительно невысокий процент получения достоверных результатов и трудности дифференциации вида нетуберкулезных микобактерий.

Различия в составе метиловых эфиров коротких цепей миколовых кислот клеточной стенки позволяют идентифицировать до 40 видов микобактерий методом газожидкостной хроматографии высокого давления (Heifets L. Mycobacterial infections caused by nontuberculous mycobacterials // J.Respiratory and Critical Care Medicine. - 2004. - v.25, - p.283-297). Этот метод в настоящее время является наиболее информативным и достоверным для отличия туберкулезных и нетуберкулезных микобактерий и видовых различий последних. Недостатками метода являются: высокая стоимость одного исследования, уникальность компьютерных систем идентификации микобактерий, являющихся, как правило, закрытыми системами и не имеющих отечественных аналогов.

В настоящее время, с нашей точки зрения, определение генетических различий является самым быстрым и достоверным методом видовой идентификации микобактерий. Для этих целей используют анализ гипервариабельных участков 16S-23S rRNA методом амплификации интересующих участков генов с последующей гибридизацией с мечеными олигонуклеотидами на мембранных фильтрах (Arunnee S., Hongmanee P., Chuchottaworn С. et al., Differentiation between M.tuberculosis and M.avium by amplification of the 16S-23S Ribosomal DNA spacer // J. Clinical Microbiol. - 1998. - v.36. - p.2399-2403). Для идентификации M.bovis, M. bovis BCG, M.tuberculosis используют амплификацию SenX3-RegX3 последовательностей с последующим анализом Саузерн - блот гибридизацией (Juana M., Vachee A., Supply P., Locht С. Identification of a new DNA region specific for members of M.tuberculosis complex // J. Clinic. Microb. - 1998. - v.36. - p.937-943). Применение метода гибридизации с меченными олигонуклеотидами на мембранных фильтрах дорогостоящий метод и не подходит для диагностических лабораторий с большим потоком анализов.

Изложенное определяет актуальность предложенного изобретения и проведение работы направленной на разработку ускоренного обследования больных с хроническими заболеваниями легких.

Аналогом данного изобретения являются два метода: метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) и метод рестрикционного анализа, в литературе этот подход называют геномным фингерпринтингом (Л.И.Патрушев. Экспрессия генов, М., «Наука». - 2000. - с.465-466.) Метод состоит из нескольких этапов:

1. Исследуемая последовательность ДНК изучаемого гена клонируется методом ПЦР.

2. Полученные ампликоны подвергаются воздействию рестриктаз, которые подбираются с помощью специальных программ, с учетом того, что фрагменты, на которые разрезаются полученные ампликоны, должны выявляться на агарозном геле.

3. Анализ полиморфизма профилей после разделения продуктов рестрикции в агарозном геле.

Положение сайтов рестрикции в анализируемой последовательности нуклеотидов может иметь видоспецифический характер и служить точным генетическим маркером того или иного организма (Патрушев Л.И. 2000).

Прототипом изобретения является работа Rubina P., Kvach J., Mounts Р. Isolation and restriction endonuclease analysis of mycobacterial DNA. // J. General Microbiology. - 1986. - v.132. - p.541-551, которые применяли метод рестрикционного анализа для идентификации вида микобатерий. Предлагаемый метод выделения ДНК отличается длительностью, состоит из многих этапов, включающих обработку протеиназой, фенолом и осаждение ДНК спиртом. Очищенная ДНК, в количестве 3 мкг, обрабатывается рестриктазой Bam H1 и анализируется в 1% агарозном геле. Поскольку рестрикции подвергалась вся нить ДНК, рестрикционная картина ампликонов состоит из большого количества полос и их анализ представляет определенные сложности. Более близким прототипом является работа Brunello F., Ligozzi M., Cristelli E., et al. Identification of 54 mycobacterial species by PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of the hsp65 gene. // J. Clinical Microbiology. - 2001. - v.39. - p.2799-2806. Авторы использовали ген, кодирующий белок теплового шока. Выделение ДНК остается такой же громоздкой процедурой, как и в первом прототипе, но они амплифицировали фрагмент гена, который затем и обрабатывали рестриктазами BstE11 и Hae111, профили рестрикционных карт на электрофореграмме были более четкими и их различие можно определить визуально.

Подобный же ген был взят для идентификации вида микобактерий комплекса MAIS. Wong D., Yip P., Cheung D., Kam K. Simple and rational approach to the identification of M.tuberculosis, M.avium complex species, and other commonly isolated mycobacteria // J. Clinic. Microbiol. - 2001. - v.39. - p.3768-3771. Авторы использовали метод выделения ДНК из образцов температурной экстракцией дистиллированной водой, что не защищает ее от воздействия разрушающих ферментов. Рестрикционная картина (рестриктазы Cfo 1 и Sau 961) ампликонов четкая при разделении в агарозе. При воспроизведении предлагаемого метода мы не получили четкой рестрикционной картины с рестриктазой Sau 961, кроме того, после обработки этой рестриктазой получился совершенно одинаковый профиль рестрикции для М.avium и M.intracellulare. Рестриктаза Cfo1 была недоступна. Поэтому в отработанной нами системе методик для видовой идентификации микобактерий комплекса MAIS и М. tuberculosis некоторые этапы были модифицированы. Изменили этап обработки образцов (прогревание проводится в ТЕ буфере (рН 8,0), что увеличивает сохранность ДНК), ввели другие условия рестрикции (объем ампликонов и время рестрикции) и взята одна рестриктаза Hin 6 I, которая разрезает исследуемые виды микобактерий на разные фрагменты по основаниям gr^cc-yc. В результате была получена четкая картина рестрикционного анализа комплекса MAIS и М.tuberculosis.

На чертеже представлена фотография профилей рестрикции микобактерий комплекса MAIS и М.tuberculosis, выполненная с рестриктазой Hin 6 I. Из чертеже видно, что профиль рестрикции M.tuberculosis состоит из двух явно выраженных полос, M.avium и M.intracellulare так же из двух, но размеры рестрикционных фрагментов явно различаются между собой, М.scrofulaceum из 4 полос.

Изобретение относится к медицине. ДНК выделяют прогреванием микобактерий в течение 12 мин при 95°С в ТЕ-буфере рН 8,0. Полученные ампликоны обрабатывают рестриктазой Hin6I (объем ампликонов для рестрикции составляет 17 мкл и время рестрикции 1 час 10 мин). Продукты рестрикции разделяют в агарозном геле с последующим анализом профилей рестрикции изучаемых видов. Изобретение позволяет увеличивать сохранность ДНК и получать четкую картину рестрикционного анализа. 1 ил.

Способ идентификации вида микобактерий комплекса MAIS (M.avium, M.intracellulare, M-scrofulaceum) и M.tuberculosis, включающий этапы выделения ДНК, рестрикции, разделения продуктов рестрикции в агарозном геле с последующим анализом профилей рестрикции изучаемых видов, отличающийся тем, что ДНК выделяют прогреванием микобактерий 12 мин при 95°C в ТЕ-буфере рН 8,0, полученные ампликоны обрабатывают рестриктазой Hin6I (объем ампликонов для рестрикции составляет 17 мкл и время рестрикции 1 ч 10 мин).