СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОГИПОКСИЧЕСКИМ, ПРОТИВОИНСУЛЬТНЫМ, УЛУЧШАЮЩИМ ПАМЯТЬ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2008 года по МПК A61K31/4412 A61P9/10 A61P25/00 A61P7/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к созданию средства, обладающего противоинсультным, противогипоксическим и улучшающим память действием, предназначенного для лечения острых и хронических нарушений мозгового кровообращения, в том числе ишемических и геморрагических инсультов, нарушений при старении и других состояний и заболеваний, сопровождающихся снижением когнитивных функций и нейродегенерацией.

В настоящее время при инсультах применяются антагонисты кальциевых каналов, но они имеют существенные побочные эффекты и недостатки, одним из которых является наличие сердечно-сосудистых эффектов, приводящих к «обкрадыванию» мозга (Регистр лекарственных средств России. Энциклопедия лекарств. Ред. Г.Л.Вышковский, Вып.14, М., РЛС, 2006).

Ближайшим аналогом заявляемого средства как по химическому строению, так и по действию является препарат мексидол (2-этил-6-метил-3-оксипиридин сукцинат), который применяется для лечения нарушений мозгового кровообращения (Регистр лекарственных средств России. Энциклопедия лекарств. Ред. Г.Л.Вышковский. Вып.14, М., РЛС, 2006).

Однако известные средства имеют следующие недостатки, а именно блокаторы кальциевых каналов: циннаризин (стугерон), нимодипин, флунаризин вызывает сонливость, головную боль, сухость во рту, желудочно-кишечные расстройства, гипотензию, и поэтому они не показаны у больных с гипотонией; кроме того, эти препараты обладают сердечно-сосудистыми эффектами, приводящими к «обкрадыванию» мозга. Мексидол обладает недостаточной противогипоксической активностью и эффективностью при инсультных состояниях.

Целью изобретения является создание средства, обладающего противоинсультным, противогипоксическим и улучшающим память действием.

Поставленная цель достигается применением в качестве средства, обладающего противоинсультным, противогипоксическим и улучшающим память действием, 2,4,6-триметил-3-оксипиридин сукцината формулы

2,4,6-триметил-3-оксипиридин сукцинат описан в патенте РФ №2276138, опубл. 10.06.2006 г., однако как вещество, обладающее противоинсультным, противогипоксическим и улучшающим память действием, оно не изучено.

2,4,6-триметил-3-оксипиридин сукцинат (тримексидин) обладает противоинсультным, противогипоксическим, улучшающим память действием и превосходит по этим видам активности мексидол, имея перед ним значительные преимущества, а именно: тримексидин превосходит мексидол по противогипоксической и антиамнестической активности по всем показателям, оказывает эффект в меньшей дозе, чем мексидол, а при сопоставлении одинаковой дозы обладает более выраженным и глубоким действием. Тримексидин значительно превосходит мексидол по противоинсультному действию, оказывает более выраженное влияние на показатели неврологического дефицита, нарушенную память, мышечный тонус, координацию движений, в значительно большей степени уменьшает смертность после инсульта и обладает большей терапевтической широтой.

Приведенные ниже примеры иллюстрируют эффективность 2,4,6-триметил-3-оксипиридин сукцината (тримексидина) в качестве противоинсультного, противогипоксического, улучшающего обучение и память средства в сравнении с ближайшим аналогом мексидолом.

Пример 1. Противогипоксический эффект тримексидина на модели гипобарической гипоксии в барокамере.

Острую гипобарическую гипоксию моделировали в проточно-вытяжной барокамере в опытах на беспородных белых мышах-самцах массой 24-28 г., согласно известной сертифицированной методике ("Методические указания по изучению противогипоксической активности фармакологических веществ" (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ", Москва, 2005). Давление регистрировали высотометром, скорость подъема - вариометром. Животных "поднимали" со скоростью 20 м/с до площадки "высотой" 11000 м. Для устранения гиперкапнии в камере находилась 30-35% щелочь. Экспозиция составляла 10 минут. Затем в течение 5 минут животных "спускали" до исходных условий. В течение всей экспозиции оценивали состояние и поведение мышей, регистрировали продолжительность жизни животных и процент выживших мышей по отношению к контролю, принятому за 100%.

Для создания идентичных условий гипоксии в камеру одновременно помещали животных опытной (1 мышь) и контрольной (1 мышь) групп, и, таким образом, для каждой дозы препарата была использована своя контрольная группа. В каждой группе было по 10-16 животных.

Статистическую обработку данных проводили с вычислением средних арифметических и их доверительных интервалов при Р<0,05. Для оценки достоверности результатов использовали параметрический критерий статистической обработки данных по методу Стьюдента (t-test)) по компьютерной программе "Biostat".

Тримексидин вводили внутрибрюшинно в дозах 50, 100 и 200 мг/кг за 40 минут до опыта. Мексидол вводили внутрибрюшинно в дозах 100 и 200 мг/кг за 40 минут до опыта. Контрольным группам животных внутрибрюшинно вводили дистиллированную воду в эквивалентном объеме.

Установлено, что в условиях гипобарической гипоксии у 100% контрольных животных уже на высоте 7 тыс.м наблюдаются подергивания телом и сильный тремор. У мышей, получавших тримексидин в дозах 100 и 200 мг/кг, тремор наблюдался только на высоте 10 тыс.м. В течение времени нахождения на высоте 11 тыс.м у контрольных мышей отмечался периодический тремор (11 эпизодов), тогда как у животных, получавших тримексидин, тремор наблюдался однократно (только при подъеме).

После введения мексидола в дозе 200 мг/кг тремор также уменьшался, и на высоте 11 тыс.метров на фоне мексидола наблюдалось только 4 эпизода тремора. В сравнении с мексидолом тримексидин в дозах 100 и 200 мг/кг полностью устранял тремор.

В табл.1 приведены результаты, показывающие, что в условиях гипобарической гипоксии тримексидин в дозах 100 мг/кг и 200 мг/кг достоверно увеличивает продолжительность жизни животных по сравнению с контролем.

В дозе 100 мг/кг он увеличивал продолжительность жизни в 1,5 раза, а в дозе 200 мг/кг - в 2,1 раза по сравнению с контролем. В дозе 50 мг/кг тримексидин также увеличивал (в 1,3 раза) продолжительность жизни мышей в условиях гипоксии, но этот эффект был статистически недостоверен при Р≤0,05.

Мексидол не оказывал достоверного противогипоксического эффекта в дозе 100 мг/кг и уступал по активности тримексидину в дозе 200 мг/кг.

После 10-минутной экспозиции мышей в барокамере на критической высоте 11000 м в контроле погибли все животные (100%). Тримексидин в дозе 50 мг/кг увеличивал количество выживших животных до 25%, однако этот эффект был статистически недостоверен (табл.2). В дозе 100 мг/кг тримексидин достоверно (до 37,5%) увеличивал процент выживших мышей по сравнению с контролем. С увеличением дозы до 200 мг/кг противогипоксический эффект тримексидина усиливался, был достоверен по сравнению с контролем, и процент выживших животных составлял 50% (табл.2).

Мексидол в дозах 100 и 200 мг/кг достоверно уменьшал процент гибели животных при гипоксии, но его эффект был слабее эффекта тримексидина.

Таблица 1Влияние тримексидина на продолжительность жизни мышей на модели гипобарической гипоксииВеществоДоза, мг/кгПродолжительность жизни животных в минКонтрольДистил. вода1,97±0,51Тримексидин502,52±1,17КонтрольДистил. вода2,15±0,77Тримексидин1003,32±0,34*КонтрольДистил. вода1,83±0,61Тримексидин2003,87±0,71*КонтрольДистил. вода1,89±0,81Мексидол1002,32±1,12КонтрольДистил. вода1,63±0,56Мексидол2002,72±0,37** - достоверность отличий от контроля при Р<0,05

Таблица 2Влияние тримексидина на выживаемость мышей на модели гипобарической гипоксииВеществоДозаКоличество выживших животных через 10 минут  Выжившие/ Общее число мышей%КонтрольДистил. вода0/160Тримексидин504/1625КонтрольДистил. вода0/160Тримексидин1006/1637,5*КонтрольДистил. вода0/160Тримексидин2008/1650*КонтрольДистил. вода0/160Мексидол1005/1631,5*КонтрольДистил. вода0/160Мексидол2007/1643,7** - достоверность отличий от контроля при Р≤0,05 (χ²)

Таким образом, тримексидин в дозах 100 и 200 мг/кг обладает выраженным достоверным противогипоксическим эффектом в условиях модели гипобарической гипоксии. Тримексидин улучшает общее состояние животных при подъеме на высоту, увеличивает продолжительность жизни и уменьшает гибель животных в условиях гипобарической гипоксии.

Тримексидин превосходит мексидол по противогипоксической активности в тесте гипобарической гипоксии как по влиянию на общее состояние животных, так и по показателю продолжительности жизни в условиях гипоксии, оказывая эффект в меньших дозах, чем мексидол, а при сопоставлении одинаковой дозы 200 мг/кг - более выраженный и глубокий эффект.

Пример 2. Противогипоксический эффект тримексидина на модели гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме.

Исследования проводили согласно известной сертифицированной методике ("Методические указания по изучению противогипоксической активности фармакологических веществ" (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ", Москва, 2005). Методика эксперимента состояла в том, что мышь помещали в герметично закупоренную стеклянную емкость объемом 200 мл и затем регистрировали продолжительность жизни животного. В каждой группе использовали по 16 животных. Статистическую обработку данных проводили с вычислением средних арифметических и их доверительных интервалов при Р<0,05.

Для оценки достоверности результатов использовали параметрический критерий статистической обработки данных по методу Стьюдента (t-test)) по компьютерной программе "Biostat".

Тримексидин вводили внутрибрюшинно в дозах 50, 100 и 200 мг/кг за 40 минут до опыта. Мексидол вводили внутрибрюшинно в дозах 100 и 200 мг/кг за 40 минут до опыта. Контрольным группам животных вводилась дистиллированная вода в эквивалентном объеме.

Изучение противогипоксических свойств тримексидина на модели гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме показало, что препарат в дозах 100 и 200 мг/кг достоверно (Р<0,05) увеличивает продолжительность жизни животных по сравнению с контрольной группой мышей соответственно в 1,5 и 1,8 раза (табл.3). При уменьшении дозы тримексидина до 50 мг/кг достоверный противогипоксический эффект не наблюдается.

Мексидол в дозе 100 мг/кг не обладает противогипоксическим эффектом, а в дозе 200 мг/кг оказывает противогипоксическое действие, достоверно увеличивая продолжительность жизни в 1,4 раза. Мексидол уступает по активности тримексидину, который в этой дозе увеличивает продолжительность жизни мышей в 1,8 раза.

Таким образом, тримексидин обладает противогипоксической активностью в тесте гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме в дозах 100 и 200 мг/кг, что выражается в способности вещества увеличивать продолжительность жизни животных в условиях гипоксии. Мексидол оказывает меньший эффект в условиях этого теста, поскольку неэффективен в дозе 100 мг/кг и имеет менее выраженный, чем у тримексидина, эффект в дозе 200 мг/кг.

Таблица 3Противогипоксический эффект тримексидина на модели гипоксии с гиперкапнией в гермообъемеВеществоДоза, мг/кгПродолжительность жизни животных в минКонтрольДистил. вода16,1±0,41Тримексидин5018,7±0,86КонтрольДистил. вода13,2±0,7Тримексидин10019,7±1,04*КонтрольДистил. вода14,3±0,6Тримексидин20026,1±0,71*КонтрольДистил. вода17,7±0,8Мексидол20024,7±0,5**- достоверность различий между контролем и опытом при Р<0,05 (t-test)

Пример 3. Противоинсультное действие тримексидина.

Противоинсультное действие тримексидина исследовали в опытах на крысах на модели геморрагического инсульта (интрацеребральная посттравматическая гематома). Моделирование локального кровоизлияния в головном мозге - создание геморрагического инсульта с ишемией мозга (интрацеребральной посттравматической гематомы) проводили по известной методике (Авторское свидетельство №1767518, 1990; Jackowski A., Crockard A., Burnstock G., Ross Russell R., Kristek F. The time course of intracranial pathophysiological changes following experimental subarachnoid haemorrage in the rat., Journal of cerebral blood flow and metabolism, 1990, v.10, p.835-849).

Опыты проводили на белых беспородных крысах-самцах массой 260-280 г. Крысы содержались в условиях вивария при свободном доступе к пище и воде.

С целью создания инсульта у крыс, наркотизированных хлоралгидратом (400 мг/кг, в/м), проводили трепанацию черепа и затем при помощи специального устройства (мандрен - нож) и стереотаксиса осуществляли деструкцию мозговой ткани в области внутренней капсулы с последующим (через 2-3 минуты) введением в место повреждения крови, взятой из-под языка животного (0,02-0,03 мл). Таким способом достигается локальный аутогеморрагический билатеральный инсульт в области внутренней капсулы (диаметр 2 мм, глубина 3 мм) без существенных повреждений вышерасположенных образований мозга и неокортекса.

Во время операции и сразу после нее погибло 40% крыс с инсультом.

У выживших животных с геморрагическим инсультом в последующем регистрировали неврологические, когнитивные и другие нарушения поведения.

Динамику развития нарушений, вызванных интрацеребральной посттравматической гематомой, и влияние тримексидина на поведение крыс оценивали в течение 14 суток после операции с регистрацией поведения и состояния животных на первые, третьи, седьмые и четырнадцатые сутки после операции.

Животные были разделены на несколько групп: 1 - интактные крысы; 2 - ложно оперированные крысы, которых наркотизировали и затем проводили трепанацию черепа, но не осуществляли разрушения мозговой ткани; 3 - животные с геморрагическим инсультом; 4 - животные с геморрагическим инсультом, которым вводили тримексидин; 5 - животные с геморрагическим инсультом, которым вводили мексидол.

Тримексидин вводили животным в дозе 100 мг/кг, внутрибрюшинно через 2 часа после операции и затем еще 3 раза каждые 4 часа (4 инъекции в день после операции). Затем тримексидин вводили ежедневно однократно в течение 7-ми дней. Мексидол в дозе 100 мг/кг внутрибрюшинно вводили по аналогичной схеме.

Контрольным животным вводили внутрибрюшинно физиологический раствор в эквивалентном объеме.

Для оценки нарушения поведения и состояния животных после геморрагического инсульта использовали комплекс методов, традиционно применяемых для этих целей.

Для оценки неврологического статуса использовали метод регистрации показателей неврологического дефицита по шкале оценки инсульта (stroke-index) McGrow в модификации И.В.Ганнушкиной (1996) и методы регистрации мышечного тонуса и координации движений.

Для оценки когнитивных функций использовали метод условного рефлекса пассивного избегания в темной/светлой камере (установка Laffayette Instrument Co, США). В течение 14 дней после операции оценивалась способность тримексидина повышать выживаемость животных.

Статистическую обработку данных проводили с вычислением средних арифметических и их доверительных интервалов при Р<0,05. Для оценки достоверности результатов использовали параметрический критерий статистической обработки данных по методу Стьюдента (t-test) и критерий χ-квадрат (χ²) компьютерной программы "Biostat".

3.1. Влияние тримексидина на показатели неврологического дефицита по шкале Me Grow после гемморрагического инсульта.

Неврологический дефицит у животных после инсульта определяли через сутки после инсульта по шкале Stroke-index McGrow (инсультный индекс) в модификации И.В.Ганнушкиной (Ганнушкина И.В. Функциональная ангиоархитектоника головного мозга, Медицина, Москва, 1997, 224 с.)

Тяжесть состояния оценивалась по сумме соответствующих баллов.

Регистрировали процент животных, у которых отмечалась:

1. Легкая симптоматика до 2,5 баллов по шкале Stroke-index (вялость движений, слабость конечностей, односторонний полуптоз, тремор, манежные движения);

2. Тяжелая симптоматика неврологических нарушений - от 3 до 10 баллов (парезы и параличи конечностей, а также боковое положение) (табл.4).

Таблица 4Неврологические нарушения функций по шкале Me GrowНеврологические симптомыStroke index (инсультный индекс) в баллахВялость, замедленность движений0,5Тремор1Односторонний полуптоз1Двусторонний полуптоз1,5Слабость конечностей1,5Односторонний птоз1,5Двусторонний птоз1,5Манежные движения2Парез 1-4 конечностей2,0-5,0Паралич 1-4 конечностей3,0-6,0Коматозное состояние7Смерть10

Установлено, что у ложнооперированных контрольных крыс без инсульта в первые сутки после операции легкие неврологические нарушения в виде вялости, замедленности движений, слабости конечностей наблюдаются только у 10-20% животных. Тяжелых неврологических нарушений, проявляющихся в виде манежных движений по кругу, парезов и параличей конечностей, у ложнооперированных контрольных крыс отмечено не было.

У крыс, выживших после экспериментального геморрагического инсульта, в первые сутки после операции у всех (100%) животных были отмечены легкие неврологические нарушения и наблюдались отчетливые тяжелые проявления неврологического дефицита: манежные движения по кругу - у 30%, парезы - у 40%, параличи конечностей - у 30%.

Тримексидин после 4-кратного введения в дозе 100 мг/кг достоверно уменьшал возникающие после инсульта проявления неврологического дефицита. Так, легкие нарушения после введения тримексидина регистрировались лишь у 40% животных (в контроле 100%). Наряду с этим тримексидин достоверно уменьшал тяжелые неврологические нарушения - манежные движения и паралич 1-4 конечностей (табл.5).

Мексидол в аналогичной дозе 100 мг/кг уступал по активности тримексидину по способности уменьшать легкие неврологические нарушения, в частности вялость и замедленность движений, а также в меньшей степени уменьшал тяжелые нарушения (манежные движения).

Таблица 5Влияние тримексидина на показатели неврологического дефицита (по шкале McGrow) в первые сутки после инсульта у крыс, выживших после геморрагического инсультаНеврологические симптомыКоличество животных с неврологическими нарушениями, %Контроль
Ложноопериров.Контроль
После инсультаТримексидин
100 мг/кгМексидол
100 мг/кгВялость, замедленность движений20100^40*70Слабость конечностей10100^40*60*Манежные движения030^0*0*Парез 1-4 конечностей040^2020Паралич 1-4 конечностей030^0*0*^ - достоверность отличий от ложнооперированных крыс при Р≤0,05 (χ²)
*- достоверность отличий от инсультных крыс при Р≤0,05 (χ²)

Таким образом, тримексидин вызывает достоверное уменьшение проявлений неврологического дефицита у крыс через сутки после геморрагического инсульта и по активности превосходит мексидол.

3.2. Влияние тримексидина на нарушение координации движений после инсульта.

Неврологический дефицит, выражающийся в нарушении координации движений, оценивали в тесте вращающегося стержня ("Методические указания по изучению активности фармакологических веществ". Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ", Москва, 2005).

Крыс помещали на горизонтальный стержень диаметром 4 см, вращающийся со скоростью 3 оборота в минуту. Неспособность животных под влиянием препарата удерживать равновесие на стержне в течение 2-х минут рассматривалось как проявление нарушения координации движений.

Установлено, что у контрольных крыс после геморрагического инсульта наблюдается выраженное нарушение координации движений. Выраженность этих изменений несколько колеблется в зависимости от срока их регистрации после инсульта. На 1-е сутки после инсульта нарушение координации движений наблюдалось у 50% животных, на 3-й сутки также у 50%, на 7-е - у 55% и на 14-е - у 44% крыс (табл.6).

Тримексидин в дозе 100 мг/кг ослаблял нарушения координации движений у крыс. Выраженные и статистически достоверные результаты были получены на 3, 7 и 14-е сутки после инсульта (табл.6).

Мексидол в дозе 100 мг/кг также уменьшал выраженность нарушений координации движений на седьмые и 14-е сутки после инсульта. Однако на 1-3 сутки после инсульта мексидол не оказывал достоверного эффекта на эти нарушения в сравнении с тримексидином, который улучшал и эти нарушения.

Таким образом, тримексидин обладает способностью восстанавливать нарушенную после инсульта координацию движений и превосходит по этому эффекту мексидол.

Таблица 6Влияние тримексидина на нарушение координации движений после инсультаГруппы животныхКоличество животных, не удержавшихся на вращающемся стержне (3 об/мин) в течение 2-х минут, в абс.ед. и %1-е сутки3-й сутки7-е сутки14-е суткиа.е.%а.е.%а.е.%а.е.%Интактные (без операции)0/1000/1000/1000/100Ложнооперированные2/10201/10101/10101/910Инсульт6/1250^5/1050^5/955^4/944^Инсульт + Тримексидин 100 мг/кг4/10402/1020*0/100*0/100*Инсульт + Мексидол 100 мг/кг5/10504/10402/1020*0/100*а. е. - абсолютные единицы.
^ - достоверность отличий от ложнооперированных крыс при Р≤0,05 (χ²)
* - достоверность отличий от крыс с инсультом при Р≤0,05 (χ²)

3.3. Влияние тримексидина на ослабление мышечного тонуса после инсульта

Для оценки мышечного тонуса использовали тест подтягивания на горизонтальной перекладине ("Методические указания по изучению активности фармакологических веществ". Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ", Москва, 2005).

Крысу подвешивали передними лапами на проволоку, натянутую на высоте 20-30 см от поверхности стола. Интактные крысы с ненарушенным мышечным тонусом быстро подтягиваются и удерживаются на перекладине четырьмя лапами. Невыполнение этого рефлекса животными опытной группы свидетельствует о нарушении мышечного тонуса и неврологическом дефиците.

У крыс после геморрагического инсульта мышечный тонус значительно ослабляется. На 3 сутки после инсульта ослабление мышечного тонуса отмечалось в среднем у 55%, на седьмые - у 44% и на четырнадцатые - у 44% животных.

После курсового введения тримексидина в дозе 100 мг/кг наблюдалось улучшение мышечного тонуса. Достоверное восстановление мышечного тонуса после введения тримексидина отмечалось на 7-е и 14-е сутки после инсульта (табл.7).

Мексидол в дозе 100 мг/кг также обладал способностью восстанавливать мышечный тонус животных после инсульта, но уступал по активности тримексидину, поскольку не оказывал эффекта на 7-й день после инсульта (табл.7).

Таким образом, тримексидин обладает способностью восстанавливать мышечный тонус животных после инсульта и превосходит по активности мексидол.

Таблица 7Влияние тримексидина на мышечный тонус животных после инсультаГруппа животныхКоличество животных, не подтянувшихся на горизонтальной перекладине, в абс. единицах и %1-е сутки3-й сутки7-е сутки14-е суткиа.е.%а.е.%а.е.%а.е.%Интактные (без операции)0/1000/1000/1000/100Ложнооперированные1/10101/10100/1000/90Инсульт5/1050^5/955^4/944^4/944^Инсульт + тримексидин 100 мг/кг4/10404/10401/1010*1/1010*Инсульт + Мексидол 100 мг/кг3/10303/10303/10301/1010*а.е. - абсолютные единицы.
^ - достоверность отличий от ложнооперированных крыс при Р≤0,05 (χ²)
* - достоверность отличий от инсультных крыс при Р≤0,05 (χ²)

3.4. Влияние тримексидина на нарушение когнитивных функций после инсульта.

Исследования проводили согласно методике, описанной в "Методических указаниях по изучению ноотропной активности фармакологических веществ" (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ", Москва, 2005). Эксперимент осуществляли на стандартизированной установке условного рефлекса пассивного избегания (Passive Avoidance фирмы Lafayette Instrument Co, США). Конструктивно установка состоит из платформы, расположенной на расстоянии 1 м от пола, освещенной специальной лампой и соединенной с ней темной камеры с электродным полом. Крысу помещали на освещенную платформу перед входом в темную камеру установки хвостом к входному отверстию.

Для оценки природного норкового навыка убегания крысы в темное место регистрировали латентное время первого захода в темную камеру.

Установлено, что контрольные крысы (интактные и ложнооперированные) при помещении их на освещенную платформу быстро, с коротким латентным периодом переходят в темную камеру. Инсульт не нарушает норковый рефлекс, но увеличивает латентное время его выполнения. Тримексидин и мексидол также не нарушают выполнение норкового рефлекса и латентное время выполнения рефлекса.

С целью обучения условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) крысе в темной камере наносили однократное болевое раздражение электротоком (0,45 мА) до тех пор, пока крыса не выбегала из темного, опасного отсека. Крыса запоминала, что в темную камеру заходить опасно (обучение). Сохранность памятного следа (воспроизведение УРПИ) осуществляли через 24 часа после обучения, а также через 3, 7 и 14 суток после инсульта. С этой целью животное вновь помещали на освещенную платформу и регистрировали в течение 3-х минут латентный период первого захода в темную камеру и время пребывания крысы в темной опасной камере.

Установили, что в контрольных группах интактных и ложнооперированных крыс, получавших в течение всего эксперимента дистиллированную воду, при воспроизведении УРПИ через 24 часа после обучения (получение болевого раздражения в темном отсеке камеры) 90% животных помнили об ударе током и не заходили в темную «опасную» камеру в течение всего времени наблюдения.

У контрольных крыс через 3, 7 и 14 суток после геморрагического инсульта память нарушалась. У этих животных при оценке сохранности памятного следа через сутки после обучения достоверно уменьшилось латентное время захода в темную камеру. Так, на 7-е сутки после инсульта только 25% животных совсем не зашли в темную камеру, т.е. помнили об ударе током, а у 75% крыс память была нарушена, и вследствие этого они заходили в темную опасную камеру.

После курсового введения тримексидина отмечалось восстановление нарушенных инсультом когнитивных функций. Эффект тримексидина на память зависел от срока регистрации сохранности памятного следа и курса введения препарата. Так, на 1-е и 3-й сутки после инсульта улучшение когнитивных функций после введения тримексидина в дозе 100 мг/кг было недостоверным, но на 7 и 14 сутки на фоне применения тримексидина отмечалось достоверное улучшение показателей памяти (табл.8 и 9).

Из представленных данных видно, что под влиянием тримексидина наблюдалось достоверное увеличение как латентного времени захода в темную камеру через 7 и 14 суток после инсульта (табл.8), так и увеличение числа животных, не зашедших в темную опасную камеру через 14 суток после инсульта (табл.9).

Мексидол в дозе 100 мг/кг не оказывал эффекта на когнитивные функции животных через 7 суток после инсульта, но восстанавливал их только через 14 суток после инсульта (табл.8 и 9).

Таблица 8Улучшение нарушенной инсультом памяти (по показателю латентного времени УРПИ) после курсового применения тримексидина.Группы животныхЛатентное время (сек) захода в темную камеру при воспроизведении УРПИ через разное время после инсульта1 сутки3 суток7 суток14 сутокИнтактные123,1±18,7134,5±23,4129,1±28,5139,1±19,3Ложнооперирован.132,3±12,0118,7±20,7120,5±19,2115,7±21,4Инсульт24,1±3.2^21,7±6,1^18,7±4,2^20,7±7,1^Инсульт + тримексидин35,4±14,142,2±21,763,2±16,7*71,2±18,7*Инсульт + Мексидол31,2±11,736,1±11,933,2±21,178,9±14,5*^ - достоверность отличий от ложнооперированных крыс при Р≤0,05 (t-test Стьюдента; χ²)
* - достоверность отличий от крыс с инсультом при Р≤0,05 (t-тест Стьюдента; χ²)

Таким образом, тримексидин, введенный крысам в дозе 100 мг/кг в течение 7 дней, восстанавливает нарушения памяти на модели условного рефлекса пассивного избегания на 7 и 14 дни после создания геморрагического инсульта. Под влиянием тримексидина наблюдается статистически достоверное увеличение (до 40%) числа помнящих негативную ситуацию животных (в контроле с инсультом - 10%) и в 3,4 раза увеличивается по сравнению с инсультными крысами латентное время захода в темную опасную камеру. Тримексидин превосходит мексидол по способности восстанавливать нарушенные после инсульта когнитивные функции.

3.5. Влияние тримексидина на выживаемость крыс с гемморрагическим инсультом

Установлено, что в группе ложнооперированных крыс только одна крыса из десяти погибла на 7-е сутки после ложной операции.

Во время операции создания инсульта и непосредственно (в течение 5-ти часов) после инсульта погибло 20 крыс из 50-ти оперированных животных, т.е. погибло 40% животных.

30 крыс, выживших после инсульта, наблюдали в течение 14 суток. Из них 10-ти крысам в течение 7-ми дней вводили тримексидин в дозе 100 мг/кг, а другим 10 инсультным крысам - мексидол в дозе 100 мг/кг и 10 крысам вводили дистиллированную воду (контроль).

Установлено, что в группе контрольных животных в течение первых суток после инсульта погибло еще 30% инсультных животных, а к 14-му дню процент гибели достиг 60% (табл.10).

Тримексидин в дозе 100 мг/кг внутрибрюшинно ежедневно в течение 7 дней предупреждал гибель крыс с инсультом (табл.10).

На фоне препарата гибель наблюдалась только у 20% крыс, перенесших инсульт (в контроле 60%). Таким образом, тримексидин уменьшал гибель после инсульта в 3 раза по сравнению с нелеченными животными.

После введения мексидола в дозе 100 мг/кг наблюдалась гибель 30% животных, т.е. препарат уменьшал гибель в 2 раза по сравнению с нелеченными контрольными животными.

Таким образом, тримексидин достоверно уменьшает (в 3 раза) гибель животных после инсульта и по этому показателю превосходит мексидол.

Таблица 10Влияние тримексидина на выживаемость животных после инсультаГруппа животныхКоличество погибших животных в течение 14-ти суток после геморрагического инсульта1-е сутки3-й сутки7-е сутки14-е суткиа.е.%а.е.%а.е.%а.е.%Ложнооперирован.0/1000/1000/1001/1010Инсульт3/1030^4/1040^5/1050^6/1060^Инсульт + Тримексидин1/10101/1010*2/1020*2/1020*Инсульт + Мексидол1/10102/10202/1020*3/1030*a. e. - абсолютные единицы.
^ - достоверность отличий от ложнооперированных крыс при Р≤0,05 (χ²)
* - достоверность отличий от крыс с инсультом при Р≤0,05 (χ²)

Таким образом, тримексидин в дозе 100 мг/кг, вводимый крысам по схеме: через 2 часа после инсульта, затем 3 инъекции через каждые 4 часа и затем ежедневно однократно в течение 7-ми дней, вызывает значительное улучшение постинсультных нарушений. Препарат улучшает показатели неврологического дефицита уже через сутки после инсульта, а на 7 и 14 сутки после инсульта повышает мышечный тонус, улучшает координацию движений, восстанавливает нарушенную инсультом память, улучшая воспроизведение условного рефлекса пассивного избегания на 7 и 14 сутки после инсульта, и в 3,4 раза уменьшает гибель животных после инсульта.

Пример 4. Антиамнестическая активность тримексидина.

Исследования проводили на белых беспородных крысах-самцах массой 250-280 г по методу, описанному в "Методических указаниях по изучению ноотропной активности фармакологических веществ" (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ", Москва, 2005).

Исследование проводили на стандартной автоматизированной установке условного рефлекса пассивного избегания (Passive Avoidance, фирмы Lafayette Instrument Co, США). Конструктивно установка состоит из маленькой платформы, расположенной на расстоянии 1 м от пола, освещенной специальной лампой и соединенной с ней темной камеры с электродным полом. Крысу помещали на освещенную платформу перед входом в темную камеру установки хвостом к входному отверстию, и животное, предпочитая темную камеру, быстро переходит в нее.

С целью обучения условному рефлексу пассивного избегания (УРПИ) крыса в темной камере получала однократное болевое раздражение электротоком (0,45 мА) через электродный пол, и животное запоминало, что в темную камеру заходить опасно. Продолжительность раздражения определялась выбеганием животного из темного отсека.

Для получения амнезии использовали максимальный электрошок (50 Гц, 0,2 сек), который проводили через корнеальные электроды непосредственно после обучения. Электрошок вызывает стирание памятного следа.

Тест на воспроизведение УРПИ (на сохранение памятного следа) осуществляли через 24 часа после обучения и электрошока. Животное вновь помещали на освещенную платформу и в течение 2-х минут регистрировали время нахождения животного на освещенной платформе и в опасном темном отсеке (ток на пол при воспроизведении УРПИ не подают).

Тримексидин вводили в дозе 100 мг/кг внутрибрюшинно. В качестве препарата сравнения использовали мексидол в дозе 100 мг/кг внутрибрюшинно. Вещества вводили за 40 минут до обучения. Контрольным группам животных вводили дистиллированную воду в эквивалентном объеме. Каждую дозу вещества изучали на 10 животных.

Установлено, что контрольные обученные животные при воспроизведении УРПИ без действия электрошока предпочитают находиться на светлой платформе. Стирание обучения при помощи электрошока вызывает у животных амнезию, в результате чего животные с коротким латентным периодом заходят в темную камеру и остаются там значительно большую часть времени, чем животные без амнезии (табл.11).

Тримексидин в дозе 100 мг/кг обладал выраженной антиамнестической активностью, что выражалось в том, что время нахождения животных в темной опасной камере уменьшалось, а время, проведенное на безопасной освещенной платформе, значительно увеличивалось по сравнению с показателями контрольных животных с амнезией (табл.11).

По антиамнестической активности тримексидин превосходит мексидол, используемый в аналогичной дозе 100 мг/кг (табл.11).

Таблица 11Антиамнестическое действие тримексидинаГруппы животныхДоза, мг/кгВремя, проведенное крысами при воспроизведении рефлекса, в секундахна освещенной платформев темной камереКонтроль без амнезииДистил. вода87,4±11,232,6±4,8Контроль с амнезиейДистил. вода28,2±6,1^91,8±14,5^Тримексидин10074,2±9,1*45,8±8,7*Мексидол10056,2±13,4*63,8±5,3*^ - достоверность различий между контролем без амнезии и контролем с амнезией при Р<0,05.
*- достоверность различий между контролем с амнезией и эффектами веществ при Р<0,05.

Таким образом, тримексидин обладает выраженной антиамнестической активностью и по своей эффективности превосходит мексидол.

Как следует из представленных данных, тримексидин в дозах 100 и 200 мг/кг (внутрибрюшинно) обладает выраженным достоверным противогипоксическим эффектом в эксперименте на мышах в условиях методик гипобарической гипоксии и гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме. При гипобарической гипоксии тримексидин улучшает общее состояние, увеличивает продолжительность жизни и уменьшает гибель животных, а при гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме увеличивает продолжительность жизни животных. Тримексидин превосходит мексидол по противогипоксической активности по всем показателям, оказывает эффект в меньшей дозе (100 мг/кг), чем мексидол (200 мг/кг), а при сопоставлении одинаковой дозы 200 мг/кг обладает более выраженным и глубоким действием.

Тримексидин (100 мг/кг, внутрибрюшинно, курс 7 дней) на модели геморрагического инсульта (интрацеребральная посттравматическая гематома) вызывает улучшение показателей неврологического статуса, восстанавливает нарушенные инсультом мышечные рефлексы, мышечный тонус, координацию движений, поведение, когнитивные функции, уменьшает гибель животных после инсульта и, таким образом, обладает комплексным противоинсульным действием. По противоинсультному действию тримексидин по всем показателям превосходит мексидол.

Тримексидин в дозе 100 мг/кг обладает выраженной антиамнестической активностью, что выражается в способности устранять амнезию условного рефлекса пассивного избегания у крыс и восстанавливать память, нарушенную проведением максимального электрошока. По антиамнестической активности тримексидин превосходит мексидол, используемый в аналогичной дозе.

Предложено средство, обладающее противоинсультным, противогипоксическим и улучшающим память действием. В качестве такого средства предложен 2,4,6-триметил-3-оксипиридин сукцинат (тримексидин). Средство предназначено для лечения острых и хронических нарушений мозгового кровообращения, в том числе ишемических и геморрагических инсультов, нарушений при других состояний и заболеваний, сопровождающихся снижением когнитивных функций и нейродегенерацией. Показано значительное улучшение показателей неврологического дефицита, повышение мышечного тонуса, улучшение координации движений после инсульта, восстановление нарушенной инсультом памяти и значительное снижение гибели животных после инсульта. Противогипоксическое действие тримексидина превосходит таковое у мексидола. 11 табл.

Применение 2,4,6-триметил-3-оксипиридин сукцината в качестве средства, обладающего противоинсультным, противогипоксическим и улучшающим память действием.