Штамм бактерий VIвRIо сноLеRае еLтоR Серовара OGaWa КМ 1446/рС0107-2, используемый для получения холерного экзотоксина Советский патент 1990 года по МПК C12N15/00 C12N15/00 C12R1/63 

1чд

Од

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении холерного экзотоксина.

Цель изобретения - повьппение выхода целейого продукта.

Штамм КМ 1446 получен путем конъ- югативного введения в клетки извест- ного токсигенного ттак1ма V.cholerae eltpr nV79 гибридной плазмиды рС0107, детерминирующий синтез холерного зк- зотоксина.

Штамм хранится в коллекции микроорганизмов ВНИПЧИ Микроб под номером КМ 1446 СО107-2 и характеризуется следующими признаками.

. Культурально-морфологические признаки.

Подвижные слегка изогнутые палочки, спор и капсул не образуют, грам- отрицательные.

На плотных полюценных средах формирует гладкие, круглые серовато-голубоватые полупрозрачные колонии размером 1,0-1,5 мм.

В жидких питательных средах вызывает равномерное помутнение.

Дпя роста на минимальной среде тре бует добавления аденина.

На полноценных плотных средах растет в присутствии 5 мкг/мл тетрациклина и 50 мкг/мл канамицина на щелочном агаре с добавлением 50 мкг/мл полимиксина,

Физиолого-биохимические свойства. Физиологические свойства типичны ДПЯ холерного вибриона.

Отнощение к углеводам: ферментирует до кислоты без газа маннозу, сахарозу, маннит, мальтозу, не ферментирует лактозу и арабинозу. Эритроциты барана не лизирует, агглютинирует куриные эритроциты.

Чувствителен к холерному диагностическому фагу эльтор, 3 и 5 фагам ХДФ.

, Холерньпад сьгаоротками О и Ogava агглютинируется до титра. Патогенные свойства, Вирулентеи для кроликов-сосунков в дозе 0 мкл/мл.

Использование штамма иллюстрируется следующем примером.

П р и м е р. Высущенную культуру V. cholerae из агтулы высевают на агар Хоттиигера рН 7,6, содержащего 5 мкг/мл тетрациклина или 50 мкг/мл канамицина, и посевы инкубируют 18 при t ,

5

0

5

0

5

0

45

50

55

Дли пронерки способнпсти niraNTMa продуцировать экзотоксин колонии

,штамма КМ 1446 переносят методом реплик на чагаки с I%-tTi,iM синказным агаром, содержаппш 1% отмытых в синказ- ном бульоне эритроцитов барана. Контроль - штамм RV79,. Посевы выращивают 18 ч при t , заливают 0,5% синказного агара, содержащего азид натрия, комплемент морской свинки и монорецепторную антитоксическую сыворотку и помещают в термостат при t 37°С. Через 1-2 ч наблюдают зону

.лизиса эритроцитов вокруг макроколоний, продуцирующих экзотоксин.

Для получения экзотоксина и титра- ции его в кожной пробе по Крейгу агаровые культуры V. cholerae eltor KM 1446, RV79 и выСокотоксигенный штамм 569 (положительный контроль) засевают в пробирки со средой, содержащей 30 г/л казаминовых кислот, 5 г/л дрожжевого экстракта, рН 7,6 и выращивают при интенсивной аэрации 16-18 ч при t . Затем культуру центрифугируют при 4000 g 15 мин, к супернатан- ту добавляют мертиолят натрия в конечной концентрации 1:5000. Полученный экзотоксин раститровывают двукратно и вводят внутрикожно двум кроликам в количестве 0,1 мл. Учет проводят через 24 ч. У щтамма КМ 1446 положительная реакция зарегистрирована в разведении 1:800-1:1300, у щтамма RV79 - в цельном супернатанте, у щтамма 569-1:800-1:1300. Количество экзотоксина Определяют иммунофермент ным методом йп, ELISA. Штамм RV79 продуцирует 0,0016 мг токсина/л культ, фильтрата, штамма И1 1446 - 5 мг токсина/л культ, фильтрата.

Пробы экзотоксина испытывают на наличие холерогенного эффекта на крольчатах - сосунках.Экзотоксин,получерный с использованием щтампа КМ 1446, даетположительный холерогённый эффект.

Таким образом, штамм V, cholerae eltor серовара Ogawa KM 1446 рСО107-2 может быть использован для получения хблеркой вакцины холерогеи-аиаток- син, а также для получения моиоспе- цифической сыворот|си. Формула изобретения

Штамм бактерий Vibrio cholerae eltor серовара Ogawa KM 1446/pCOl07-2 (Музей живых культур ВНИПЧИ Микроб), используемый. дя| получения холерного экзотоксина.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении холерного экзотоксина. Цепь изобретения - повьппение вьпсода целевого продукта. Штамм получен путем коньюгативного введения в клетки ток- сигенного штамма Vibrio cholerae el- tor RV79 гибридной плазмиды . Штамм хранится в коллекции ВНЖ1ЧИ Микроб под номером КМ 1446 рС0107-2. При культивировании в аэробных условиях выход экзотоксина 5 мг/л культу- рального фильтрата.