СПОСОБ ОЦЕНКИ ТОКСИЧНОСТИ ФТОРИДА НАТРИЯ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/48 C12N5/06 

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакотерапии, и может быть использовано для лечения и профилактики в практической медицине и для научных исследований.

Фторид натрия является препаратом, включенным в Государственный реестр лекарственных средств [1], его токсичность и дозировки проверены на фазе доклинических и клинических испытаний (in vivo), проведено стандартное определение согласно утвержденной документации, недостатком такого подхода является необходимость проведения клинических испытаний, что небезопасно для человека. Известен потенциометрический метод (потенциометрия) определения концентрации вещества в растворе [8] - основан на измерении электродвижущей силы (ЭДС) и электродных потенциалов как функции концентрации анализируемого раствора, недостатком которого являются сложность и высокая стоимость аппаратуры и невозможность определения токсичности исследуемого вещества на биологическом объекте. Известно, что испытание на токсичность проводят на здоровых лабораторных животных [2], недостатком данного подхода является сложность и длительность выполнения такой технологии.

Прототипом заявленного изобретения является «Способ диагностики костного флюороза» - для выявления хронической фтористой интоксикации [4], включающий рентгенологическое обследование костей с выявлением остеопороза, а также выполнение трепанобиопсии из гребня подвздошной кости, после чего проводят гистологическое исследование трепаната и при выявлении признаков спонгиогизации компактной костной ткани и рентгенологического диффузного остеопороза диагностируют костный флюороз. Положительное в данном способе - диагностика костного флюороза, недостаток - в сложности методики и невозможности оценить токсичность фторида натрия.

Задача настоящего изобретения: повышение точности и упрощения способа определения токсичности фторида натрия.

Согласно изобретению поставленная задача достигается тем, что оценка токсичности фторида натрия проводится с использованием биологических объектов, где используется метод культивирования ткани, при котором 0,025 мл раствора фторида натрия соответствующей концентрации вносится в 1 мл питательной среды 199 с 15% бычьей сывороткой и антибиотиками, используемой для культивирования клеток почек, а оценку токсичности проводят по особенностям роста культуры тканей почек (in vitro), с помощью светооптического микроскопа при малом увеличении (×120), и по подсчету растущих колоний, эпителиоподобных клеток с некоторым присутствием фибробластоподобных клеток, оценивают степень токсичности, и ингибирование роста клеточных колоний, где свыше 75% свидетельствует о выраженном токсическом действии фторида натрия, а ингибирование роста от 63% до 74% характеризует низкую степень токсичности, ингибирование роста меньше 62% говорит об очень низкой токсичности данного вещества.

Предлагаемый способ выполняется следующим образом.

Для определения токсичности используется ткань гистологического препарата животного (in vitro), что значительно проще, дешевле и, вместе с тем, информативнее, так как позволяет судить об изменениях на клеточном уровне. В наших исследованиях токсическая оценка используемой на животных дозы фтора 0,1 мг/кг [3], эквивалентной суточной потребности человека, проводилась в культуре клеток ткани почек мыши in vitro. Методика культивирования клеток проводилась согласно правилам работы с культурами, описанными и принятыми Д.Полом (1963). Все исследования осуществлялись в стерильных условиях. Для эксперимента были взяты конвенциональные мыши - самцы весом 18 граммов (две штуки). Для получения достоверных результатов опыт проводился дважды. Под эфирным наркозом, декапитации, частичном обескровливании, в стерильных условиях извлекали почки, которые затем измельчали ножницами в растворе Хенкса с 200 ЕД пенициллина и стрептомицина. Для культивирования использовали перфорированную подложку из миллипоровых фильтров и полиамидную пленку [5, 6]. На подложку из миллипоровых фильтров наносили по 45 микрофрагментов ткани, а на полиамидную - 68 микрофрагментов. Культивирование микрофрагментов ткани проводили в пробирках в 1 мл среды. Для культивирования была взята среда 199 с 15% бычьей сывороткой и антибиотиками. В каждую пробирку на 1 мл среды вносили 0,025 мл раствора фторида натрия соответствующей концентрации. Было проведено четыре серии опытов с разными разведениями фторида натрия, в контрольную пробу вместо раствора фторида натрия добавляли адекватное количество дистиллированной воды. После завершения культивирования (через 9 дней) культуры окрашивали гематоксилин-эозином. Площадь зоны роста (подсчет растущих колоний) производили с помощью светооптического микроскопа при малом увеличении (×120). Анализ структуры клеток ткани почек показал, что наблюдался рост преимущественно эпителиоподобных клеток с некоторым присутствием фибробластоподобных клеток, которые образуют отдельные включения. При культивировании на полиамидной пленке общее количество выросших колоний в контрольной пробе - 29 (из 68 возможных). В первой опытной пробе при внесении в среду фторида натрия в концентрации 0,1% раствора число выросших колоний равнялось 3; при концентрации 0,05% раствора - 17; при концентрации 0,033% раствора - 25; при концентрации 0,017% раствора - 22 колонии. На основании проведенных исследовании было установлено, что растворы фторида натрия в концентрации от 0,02% до 0,0025% вызывают ингибирование роста клеточных колоний соответственно на 95,6% - 75%, что свидетельствует о выраженном токсическом действии фторида натрия. В дозах от 0,00165% до 0,00085% растворов фторида натрия ингибирование роста было минимальным, составив от 63% до 74%, что характеризует низкую степень токсичности. Используемая в опытах доза фторида натрия, равная 0,00012% раствора, в культуре была в 8 раз меньше последнего разведения (ингибирование роста составило меньше 62%), что говорит об очень низкой токсичности данного вещества. Оценка токсичности фторида натрия в культуре ткани почек мыши in vitro является одним из возможных тестов для заключения о возможности с достаточной степенью точности оценить токсичность исследуемого вещества. Предлагаемый способ не требует дорогостоящей аппаратуры, может быть применен в любых условиях, безвреден для обслуживающего персонала.

Пример конкретного выполнения 1. Исследовалась проба воды №1 с наличием неизвестного количества фторида натрия. Культивирование микрофрагментов ткани проводили в пробирках в 1 мл среды. Для культивирования была взята среда 199 с 15% бычьей сывороткой и антибиотиками. В пробирку на 1 мл среды вносили 0,025 мл исследуемой воды. После завершения культивирования (через 9 дней) культуры окрашивали гематоксилин-эозином. Площадь зоны роста (подсчет растущих колоний) производили с помощью светооптического микроскопа при малом увеличении (×120). При подсчете растущих колоний выявлено ингибирование роста клеточных колоний на 95%-75%, что свидетельствует о выраженном токсическом действии фторида натрия. Заключение: данную воду применять в пищу нельзя.

Пример конкретного выполнения 2. Исследовалась проба воды №2 с наличием неизвестного количества фторида натрия. Культивирование микрофрагментов ткани проводили в пробирках в 1 мл среды. Для культивирования была взята среда 199 с 15% бычьей сывороткой и антибиотиками. В пробирку на 1 мл среды вносили 0,025 мл исследуемой воды. После завершения культивирования (через 9 дней) культуры окрашивали гематоксилин-эозином. Площадь зоны роста (подсчет растущих колоний) производили с помощью светооптического микроскопа при малом увеличении (×120). При подсчете растущих колоний выявлено ингибирование роста клеточных колоний на 63-74%, что характеризует низкую степень токсичности. Заключение: данную воду применять в пищу нельзя или применять с разведением в два раза с повторным анализом.

Пример конкретного выполнения 3. Исследовалась проба воды №3 с наличием неизвестного количества фторида натрия. Культивирование микрофрагментов ткани проводили в пробирках в 1 мл среды. Для культивирования была взята среда 199 с 15% бычьей сывороткой и антибиотиками. В пробирку на 1 мл среды вносили 0,025 мл исследуемой воды. После завершения культивирования (через 9 дней) культуры окрашивали гематоксилин-эозином. Площадь зоны роста (подсчет растущих колоний) производили с помощью светооптического микроскопа при малом увеличении (×120). При подсчете растущих колоний выявлено ингибирование роста клеточных колоний меньше 62%, что говорит об очень низкой токсичности данного вещества. Заключение: данную воду применять в пищу можно.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Государственный реестр лекарственных средств, 2004, с.1019-1020.

2. Государственная фармакопея, XI, 1987.

3. Овруцкий Г.Д. Фтор и иммунобиологическая реактивность организма / Г.Д.Овруцкий, Х.С.Хамитов. - М., 1976. - 112 с.

4. Патент на изобретение РФ №2143226, А61В 10/00.

5. Авторское свидетельство СССР №1018711. - МКИ А61В 10/00.

6. Патент на изобретение РФ №1785530, МКИ А61В 10/00.

7. Пол Д. Культура клеток и тканей / Пол Д. - М., 1963. - 256 с.

8. Харитонов Ю.Я. Аналитическая химия (аналитика). Кн.2. Количественный анализ. Физико-химические (инструментальные) методы анализа / Ю.А.Харитонов. - М.: Высш. шк., 2001, с.211).

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакотерапии, и может быть использовано для лечения и профилактики в практической медицине и для научных исследований. Изобретение представляет собой способ, включающий оценку токсичности фторида натрия с использованием биологических объектов, где используется метод культивирования ткани, при котором 0,025 мл раствора фторида натрия соответствующей концентрации вносится в 1 мл питательной среды 199 с 15% бычьей сывороткой и антибиотиками, используемой для культивирования клеток почек, а оценку токсичности проводят по особенностям роста культуры тканей почек (in vitro), с помощью светооптического микроскопа при малом увеличении (×120), и по подсчету растущих колоний, эпителиоподобных клеток с некоторым присутствием фибробластоподобных клеток, оценивают степень токсичности, и ингибирование роста клеточных колоний, где свыше 75% свидетельствует о выраженном токсическом действии фторида натрия, а ингибирование роста от 63% до 74% характеризует низкую степень токсичности, ингибирование роста меньше 62% говорит об очень низкой токсичности данного вещества.

Способ оценки токсичности фторида натрия с использованием биологических объектов, отличающийся тем, что используют метод культивирования ткани, при котором 0,025 мл раствора фторида натрия соответствующей концентрации вносится в 1 мл питательной среды 199 с 15% бычьей сывороткой и антибиотиками, используемой для культивирования клеток почек, а оценку токсичности проводят по особенностям роста культуры тканей почек (in vitro), с помощью светооптического микроскопа при малом увеличении (×120), и по подсчету растущих колоний, эпителиоподобных клеток с некоторым присутствием фибробластоподобных клеток, оценивают степень токсичности, и ингибирование роста клеточных колоний, где свыше 75% свидетельствует о выраженном токсическом действии фторида натрия, а ингибирование роста от 63% до 74% характеризует низкую степень токсичности, ингибирование роста меньше 62% говорит об очень низкой токсичности данного вещества.