СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ КОПРОПОРФИРИНА III Российский патент 2008 года по МПК A61K31/409 C07D487/22 

Использование: биотехнология, медицина. Сущность изобретения: предлагается новый способ получения копропорфирина III. Для выделения целевого продукта в водорастворимой форме осуществляют сорбцию копропорфирина III из культуральной жидкости на сорбенте КУ - 23/100 с последующей десорбцией с помощью элюэнтной системы, содержащей цитрат натрия и мочевину. Из полученного элюата копропорфирин III выделяется путем осаждения при доведении рН до 3,5±0,1. Из полученного осадка копропорфирин III выделяется путем экстрагирования 5-7%-ным раствором соляной кислоты. Полученный экстракт подвергается хроматографической очистке на силикогеле КСК. Из полученного элюата копропорфирин III осаждается доведением рН до 3,5±0,1. Полученный осадок повторно подвергается экстракции 5-7%-ным раствором соляной кислоты и повторно производится хроматографическая очистка копропорфирина III. Из полученного элюата целевой продукт осаждается и переводится в водорастворимую форму при подщелачивании. Данный способ при подобранной совокупности технологических приемов позволяет получать высокоочищенный препарат водорастворимой соли копропорфирина III с чистотой 90-95%.

Изобретение относится к медицинской и микробиологической промышленности, в частности к технологии получения копропорфирина III.

Техническое решение осуществлено получением копропорфирина III в водорастворимой форме, которая может быть использована в медицине для диагностики и лечения рака более эффективно и с меньшими побочными явлениями, чем известные водонерастворимые формы.

Анализ патентной и научно-технической литературы свидетельствует о том, что традиционные методы очистки копропорфирина III включают стадию этерификации порфиринов и разделение их эфирных производных на оксиде алюминия. Это обусловлено общепринятым мнением, что различные формы порфиринов могут быть эффективно разделены в виде эфирных производных. Таким образом, получают высокоочищенные нерастворимые в воде формы копропорфирина III (пат. США N 4436663, авт. св. СССР №1482946). Способы получения водорастворимых форм согласно обнаруженным источникам, связаны с получением водонерастворимых эфиров порфиринов, их разделением и дальнейшим их преобразованием в водорастворимые формы. Также есть способ получения водорастворимого копропорфирина III путем непосредственного выделения его и перевода в водорастворимое состояние путем подщелачивания. Так, наиболее близким аналогом (прототипом) получения водорастворимой формы копропорфирина III является патент РФ №2078138, согласно которому очистку целевого продукта осуществляют с помощью последовательного переосаждения порфиринов из нативного раствора растворами соляной кислоты с последующей хроматографией на макропористом анионите с десорбцией раствором аммиака, осаждением копропорфирина III из элюата при подкислении и переводом его в водорастворимую форму при подщелачивании. Описанный способ является трудоемким, т.к. используется стадия получения нативного раствора из культуральной жидкости методом центрифугирования. Кроме того, для хроматографической очистки предлагается использование анионита АН - 80, по которому нет данных о том, что этот сорбент разрешен для использования в медицинской промышленности, либо оксид алюминия, который является мелкодисперсным порошком с большим гидродинамическим сопротивлением и поэтому не пригоден для использования в промышленном масштабе.

Предлагаемый способ выделения и очистки копропорфирина III основан на сочетании приемов переосаждения путем доведения рН до 3,5±0,1 с хроматографической очисткой на двух разных сорбентах. Данная технология позволяет получать высокоочищенную водорастворимую форму копропорфирина III непосредственно из культуральной жидкости, минуя стадию отделения нативного раствора от биомассы.

Предлагаемый способ получения водорастворимой формы копропорфирина III осуществляют следующим образом:

рН культуральной жидкости, содержащей целевой продукт, доводится до 2-2,5 путем добавления в нее 35%-ного раствора соляной кислоты из расчета 20 мл на 1 литр культуральной жидкости. Затем проводится сорбция копропорфирина III из культуральной жидкости на макропористый катионит КУ - 23/100 в пульсирующем псевдоожиженном режиме. После промывки сорбента водой осуществляется десорбция копропорфирина III элюэнтной системой, содержащей 1,5% цитрата натрия, 0,5% мочевины и рН равным 6,0±0,1. рН полученного элюата, содержащего копропорфирин III, доводится до 3,5±0,1 для осаждения целевого продукта. Осадок отделяется центрифугированием, после чего производится экстракция копропорфирина III из осадка 5-7%-ным раствором соляной кислоты. Использование соляной кислоты с концентрацией более 7% приводит к эмульгированию суспензии (за счет белковых примесей), плохому ее разделению, загрязнению экстракта. При концентрации кислоты ниже 5% увеличивается расход кислоты и длительность ее воздействия на порфиринсодержащий промежуточный продукт. Полученный экстракт наносится на колонку с силикогелем КСК (можно также использовать силохром с-80 или силохром СХ - 2,5) для отделения балластных веществ. Затем колонка промывается 5%-ным раствором соляной кислоты. Из полученного элюата копропорфирин III осаждается путем доведения рН до 3,5±0,1, осадок отделяется центрифугированием. Далее производится экстракция порфирина 5-7%-ным раствором соляной кислоты и его повторная хроматографическая очистка на силикогеле также, как описано выше. рН полученного элюата доводится до 3,5±0,1 для осаждения копропорфирина III. Полученный осадок отделяется с помощью центрифуги и промывается дистиллированной водой с рН равным 3,5±0,1 (рН доводится соляной кислотой) для удаления минеральных солей. Затем промытый осадок копропорфирина III переводится в водорастворимую форму путем растворения его в водном растворе гидроксида калия. Содержание гидроксида калия в этом растворе должно быть равным эквивалентному количеству карбоксильных групп полученного препарата копропорфирина III. Затем раствор высушивают при температуре 80°С. Чистота полученного таким образом препарата составляет 90-95%.

Осуществимость предлагаемого способа иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. На выделение и очистку целевого продукта поступило 5450 мл культуральной жидкости с концентрацией копропорфирина III 209 мг/л. К этой культуральной жидкости был добавлен 35%-ный раствор соляной кислоты объемом 110 мл. рН культуральной жидкости стал равен 2,3. Затем эта культуральная жидкость была пропущена через колонку с катионитом КУ - 23/100 в пульсирующем, псевдоожиженном режиме. Потом эта колонка была промыта водой объемом 8 литров. После этого проведен процесс десорбции элюэнтной системой, представляющей собой водный раствор цитрата натрия - 1,5%, мочевины - 0,5% и рН равным 6,05. Объем элюата составил 6820 мл. Содержание копропорфирина III в нем составило 134,1 мг/л. Затем рН элюата был доведен до 3,45, при этом выпал осадок, содержащий целевой продукт. Осадок был выделен с помощью центрифугирования, объем маточника составил примерно 6820 мл, содержащий копропорфирин III в количестве 0,78 мг/л - это потери целевого продукта на данной стадии. Далее из выделенного осадка проведена экстракция копропорфирина III 5%-ным раствором соляной кислоты. Объем экстракта был равен 6190 мл, содержание копропорфирина III в котором составило 146,2 мг/л. Полученный экстракт был подвергнут первой хроматографической очистке на силикогеле КСК. Объем элюата составил 21400 мл с содержанием копропорфирина III - 40,1 мг/л. Затем рН элюата был доведен до 3,5 а выпавший осадок с копропорфирином III был выделен путем центрифугирования. Объем маточника составил 21400 мл, в котором содержание целевого продукта было равно 0,41 мг/л. Копропорфирин III, содержащийся в маточнике, является потерей на данной стадии. Из полученного осадка, содержащего копропорфирин III, была произведена экстракция целевого продукта, 5%-ным раствором соляной кислоты. Объем экстракта составил 630 мл с содержанием копропорфирина III в количестве 1335,8 мг/л. Полученный экстракт был подвергнут второй хроматографической очистке на силикогеле КСК. Объем элюата был равен 3485 мл с концентрацией копропорфирина III равной 237,4 мг/л. рН полученного элюата был доведен до 3,55 с помощью аммиачной воды с концентрацией 25%. Копропорфирин III выпал в осадок, который был выделен с помощью центрифуги. Объем маточника составил 3485 мл. Содержание целевого продукта в маточнике было равно 1,054 мг/л - это потери копропорфирина III на данной стадии. Полученный осадок для удаления минеральных солей был промыт дистиллированной водой с рН, доведенным соляной кислотой до 3,5. Промытый осадок переведен в калиевую соль путем его растворения в растворе гидроксида калия и доведения устойчивого рН раствора до 7,8. Раствор был высушен при 80°С. Масса препарата копропорфирина III тетракалиевой соли после сушки составил 1004,8 мг с влажностью 10,5% или без учета воды: 899,3 мг с содержанием целевого продукта 902,0 мкг/мг (90,2%).

Пример 2. На выделение и очистку целевого продукта поступило 5930 мл культуральной жидкости с концентрацией копропорфирина III 251 мг/л. К этой культуральной жидкости был добавлен 35%-ный раствор соляной кислоты объемом 120 мл. рН культуральной жидкости стал равен 2,1. Затем эта культуральная жидкость была пропущена через колонку с катионитом КУ - 23/100 в пульсирующем, псевдоожиженном режиме. После этого эта колонка была промыта водой объемом 9 литров. Потом проведен процесс десорбции элюэнтной системой, представляющей собой водный раствор цитрата натрия - 1,5%, мочевины - 0,5% и рН равным 6,1. Объем элюата составил 7230 мл. Содержание копропорфирина III в нем составило 175,8 мг/л. Затем рН элюата был доведен до 3,5, при этом выпал осадок, содержащий целевой продукт. Осадок был выделен с помощью центрифугирования, объем маточника составил примерно 7230 мл, содержащий копропорфирина III в количестве 0,63 мг/л - это потери целевого продукта на данной стадии. Далее из выделенного осадка проведена экстракция копропорфирина III 5%-ным раствором соляной кислоты. Объем экстракта составил 6740 мл, содержание копропорфирина III в котором равно 146,2 мг/л. Полученный экстракт был подвергнут первой хроматографической очистке на силикогеле КСК. Объем элюата составил 25100 мл с содержанием копропорфирина III - 48,3 мг/л. Затем рН элюата был доведен до 3,5, а выпавший осадок с копропорфирином III был выделен путем центрифугирования. Объем маточника составил примерно 25100 мл, в котором содержание копропорфирина III равно 0,65 мг/л. Целевой продукт, содержащийся в маточнике, является потерей на данной стадии. Из полученного осадка, содержащего копропорфирин III, была произведена экстракция целевого продукта 5%-ным раствором соляной кислоты. Объем экстракта составил 780 мл с содержанием копропорфирина III в количестве 1524,1 мг/л. Полученный экстракт был подвергнут второй хроматографической очистке на силикогеле КСК. В результате этого был получен элюат объемом 6790 мл и концентрацией копропорфирина III, равной 171,4 мг/л. рН полученного элюата был доведен до 3,5 с помощью аммиачной воды с концентрацией 25%. Копропорфирин III выпал в осадок, который был выделен с помощью центрифуги. Объем маточника составил 6790 мл. Содержание целевого продукта в маточнике было равно 1,45 мг/л - это потери копропорфирина III на данной стадии. Полученный осадок для удаления минеральных солей был промыт дистиллированной водой с рН, доведенным соляной кислотой до 3,5. Промытый осадок копропорфирина III переведен в калиевую соль путем его растворения в растворе гидроксида калия и доведения устойчивого рН раствора до 7,8. Раствор был высушен при 80°С. Масса высушенного препарата копропорфирина III тетракалиевой соли составил 1379,6 мг с влажностью 12,4% или без учета влаги: 1208,5 мг с содержанием целевого продукта 943,6 мкг/г (94,2%).

Пример 3. На выделение и очистку целевого продукта поступило 5340 мл культуральной жидкости с концентрацией копропорфирина III 236 мг/л. К этой культуральной жидкости было добавлен 35%-ный раствор соляной кислоты объемом 110 мл. Ее рН стал равен 2,0. Затем эта культуральная жидкость была пропущена через колонку с катионитом КУ - 23/100 в пульсирующем, псевдоожиженном режиме. Потом эта колонка была промыта водой объемом 8,5 литров. После этого проведен процесс десорбции элюэнтной системой, представляющей собой водный раствор цитрата натрия - 1,5%, мочевины - 0,5% и рН равным 6,1. Объем элюата составил 7050 мл. Содержание копропорфирина III в нем составило 155,8 мг/л. Затем рН элюата был доведен до 3,5, при этом выпал осадок, содержащий целевой продукт. Осадок был выделен с помощью центрифугирования, объем маточника составил примерно 7050 мл, содержащий копропорфирин III в количестве 1,05 мг/л - это потери целевого продукта на данной стадии. Далее из выделенного осадка проведена экстракция копропорфирина III 5%-ным раствором соляной кислоты. Объем экстракта был равен 6830 мл, содержание копропорфирина III в котором составило 158,9 мг/л. Полученный экстракт был подвергнут первой хроматографической очистке на силикогеле КСК. Объем элюата составил 22600 мл с содержанием копропорфирина III - 45,9 мг/л. Затем рН элюата был доведен до 3,5, а выпавший осадок с копропорфирином III был выделен путем центрифугирования. Объем маточника составил 22600 мл, в котором содержание целевого продукта было равно 0,83 мг/л. Копропорфирин III, содержащийся в маточнике, является потерей на данной стадии. Из полученного осадка, содержащего копропорфирин III, была произведена экстракция целевого продукта, 5%-ным раствором соляной кислоты. Объем экстракта составил 700 мл с содержанием копропорфирина III в количестве 1445,3 мг/л. Полученный экстракт был подвергнут второй хроматографической очистке на силикогеле КСК. Объем элюата был равен 4740 мл с концентрацией копропорфирина III равной 210,3 мг/л. рН полученного элюата был доведен до 3,5 с помощью аммиачной воды с концентрацией 25%. Копропорфирин III выпал в осадок, который был выделен с помощью центрифуги. Объем маточника составил 4740 мл. Содержание копропорфирина III в маточнике было равно 0,97 мг/л - это потери целевого продукта на данной стадии. Полученный осадок для удаления минеральных солей был промыт дистиллированной водой с рН, доведенным соляной кислотой до 3,5. Промытый осадок переведен в калиевую соль путем его растворения в растворе гидроксида калия и доведения устойчивого рН раствора до 7,6. Раствор был высушен при 80°С. Масса препарата копропорфирина III тетракалиевой соли после сушки составил 1196,0 мг с влажностью 11,9% или без учета воды: 1053,7 мг с содержанием целевого продукта 911,1 мкг/мг (91,1%).

Источники информации

1. Патент США 4436663, 1984.

2. Патент Российской Федерации №2078138, 1993.

3. Авторское свидетельство №1482946, 1978.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается производства копропорфирина III. Для осуществления способа нефильтрованную культуральную жидкость подкисляют до рН 2-2,5, осуществляют сорбцию на катионите марки КУ-23/100 в пульсирующем псевдоожиженном режиме с последующей десорбцией с помощью элюэнтной системы с рН 6,0±0,1, содержащей 1,5% цитрата натрия и 0,5% мочевины. Из полученного элюата осаждают копропорфирин III, доводя рН до 3,5±0,1. Полученный осадок экстрагируют раствором соляной кислоты, экстракт подвергают хроматографической очистке на молекулярном сорбенте, производят осаждение целевого продукта из элюата, после чего проводят повторную экстракцию и хроматографическую очистку, осаждают целевой продукт из элюата и переводят его в калиевую соль. Разработанная технология выделения и очистки копропорфирина III позволяет получить водорастворимую форму препарата без использования стадии фильтрации культуральной жидкости.

Способ выделения и очистки копропорфирина III из культуральной жидкости, включающий проведение сорбции на макропористом сорбенте и экстракцию 5-7%-ным раствором соляной кислоты, отличающийся тем, что нефильтрованную культуральную жидкость подкисляют до рН 2-2,5, осуществляют сорбцию на катионите марки КУ-23/100 в пульсирующем псевдоожиженном режиме с последующей десорбцией с помощью элюэнтной системы с рН 6,0±0,1, содержащей 1,5% цитрата натрия и 0,5% мочевины, из полученного элюата осаждают копропорфирин III, доводя рН до 3,5±0,1, полученный осадок экстрагируют раствором соляной кислоты, экстракт подвергают хроматографической очистке на молекулярном сорбенте, производят осаждение целевого продукта из элюата, после чего проводят повторную экстракцию и хроматографическую очистку, осаждают целевой продукт из элюата и переводят его в калиевую соль.