ЭЛЕКТИВНАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 2008 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Предлагаемое изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в медицинской и промышленной микробиологии.

Известна плотная питательная дифференциально-диагностическая среда Серова для выделения возбудителя псевдотуберкулеза, состоящая, г/л: глюкоза - 0,5 г; мочевина - 0,25 г; молибденовокислый аммоний - 0,1 г; сода безводная - 0,1 г; 30% водный раствор сухой желчи - 2,0 мл; конго-рот 1,6% водный раствор - 0,8 мл; генцианвиолета 1% водный раствор 0,1 мл; агар-агар - 2,0 г (Поляк М.С., Сухаревич В.И., Сухаревич М.Э. Питательные среды для медицинской микробиологии. Санкт-Петербург, 2003 г., с.83).

Недостатками данной среды является необходимость предварительного посева исследуемого материала на жидкую питательную среду с последующим подращиванием на холоду, что удлиняет выдачу результатов до нескольких суток.

Наиболее близкой к предполагаемому изобретению является питательная среда - мясопептонный агар для культивирования возбудителя псевдотуберкулеза (Энтеробактерии: Руководство для врачей. - М.: Медицина, 1985. - С.222; Лабинская А.С. Практикум по микробиологическим методам исследования. Медгиз., 1963 г. - С.76-77, 427-428), изготавливаемая следующим образом: к мясной воде прибавляют 1% пептона и 0,5% поваренной соли, кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения добавленных ингредиентов. Приготовленный таким образом бульон фильтруют, устанавливают слабощелочную реакцию (рН 7,2-7,4) и добавляют 0,5-2% агар-агара. После добавления агар-агара жидкость кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения агара. При помутнении среды ее просветляют одним из известных способов. Приготовленный агар фильтруют или декантируют, разливают в пробирки или во флаконы и стерилизуют в автоклаве при 120° в течение 20 мин.

Недостатком данной среды является то, что она не обеспечивает ингибицию роста сопутствующей микрофлоры, в результате выделение чистой культуры псевдотуберкулезного микроба затруднено или невозможно.

Целью предлагаемого изобретения является конструирование питательной среды для ускоренного выделения возбудителя псевдотуберкулеза из материала, контаминированного посторонней микрофлорой.

Поставленная цель достигается тем, что в питательную среду дополнительно включают натрий сернистокислый (стимулятор роста), агар микробиологический, воду водопроводную, натрий трехзамещенный фосфорнокислый (ингибитор роста посторонней микрофлоры), натрий фосфорнокислый двузамещенный (служит источником фосфора, НРО- компонент нуклеиновых кислот, фосфолипидов, нуклеотидов), а в качестве питательной основы используют гидролизат говяжьего мяса. Соотношение ингредиентов в г/л следующее:

Ферментативный гидролизат говяжьего мяса320,0-420,0Натрий хлористый4,0-6,0Натрий сернистокислый3,0-5,0Натрий трехзамещенный фосфорнокислый5,0-7,0Натрий фосфорнокислый двузамещенный3,0-5,0Агар микробиологический10,0-14,0Вода водопроводнаядо 1 л.

По отношению к прототипу заявляемая среда имеет следующие отличительные признаки. Питательная основа содержит ферментативный гидролизат говяжьего мяса - его основные характеристики: рН среды - 7,2±0,1; общий азот - 902 мг %; аминный азот - 600 мг %; процент расщепления - 74%; натрий хлористый - 0,086%; пептон - 1,2 мг %; Са - 4,2 мг %; Mg - 5,16 мг %; Fe - 1150γ; фосфор общий - 96,8 мг %; фосфор неорганический - 56,4 мг %; сухой остаток - 1,0±1,5%; редуцирующие вещества - 364 мг %.

Питательная основа содержит стимулятор роста - натрий сернистокислый. Добавляемый в предлагаемую твердую питательную среду натрий трехзамещенный фосфорнокислый (ингибитор) подавляет рост посторонней микрофлоры, а натрий фосфорнокислый двузамещенный (служит источником фосфора, НРО - компонент нуклеиновых кислот, фосфолипидов, нуклеотидов).

Сочетанное применение указанных компонентов обеспечивает получение чистой культуры возбудителя псевдотуберкулеза при его минимальной концентрации в исследуемых пробах.

Приготовление питательной среды

Приготовление ферментативного гидролизата из говяжьего мяса: в реактор наливают водопроводную воду из расчета имеющегося мяса (на 1 кг мяса 1,5 л воды). Мясо без жира и сухожилий режут на кусочки размером 2,5×2,5 см. Варят 15 мин, затем вынимают, охлаждают и пропускают через мясорубку. Бульон, остывший до 50°С, подщелачивают Na₂СО₃ из расчета 3,0 г соды на 1 л взятой в реактор воды. Добавляют поджелудочную железу из расчета 80,0-100,0 г поджелудочной железы на 1 л воды в зависимости от активности поджелудочной железы. Активность должна быть не менее 5 тыс единиц по Фульд-Гроссу. Добавляют хлороформ 2% к общему объему жидкости. Переваривание идет при 37°С. Первые сутки гидролизат мешают механической мешалкой через каждые 15 мин по 5 мин. В дальнейшем переводят на автоматическую мешалку, которая включается через каждые 2 ч на 5 мин. Ежедневно определяют аминный азот в гидролизате. С прекращением нарастания аминного азота, что бывает на 7-9 сутки, мешалку отключают, подогревание прекращают. Дают отстояться в течение 2 суток, затем жидкость отфильтровывают по бутылям с добавлением 2% хлороформа, запробковывают и хранят при температуре 4-6°С.

На основе ферментативного гидролизата говяжьего мяса готовят питательную среду для выделения возбудителя псевдотуберкулеза. Все ингредиенты в заданных количествах вносят в нагретый ферментативный гидролизат при непрерывном помешивании до полного растворения ее компонентов, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, затем устанавливают рН 7,2±0,1 с помощью 20% раствора натрия гидроокиси, разливают в бутылки белого стекла емкостью 0,5 л по 400±10 мл, стерилизуют при 1,1 атм в течение 30 мин.

Для исследования используют смывы почвы и фуража, приготовленные следующим образом. Навески в количестве 50 г смешивают с фосфатно-буферным раствором рН 7,2-7,8 в соотношении 1:10, полученную суспензию центрифугируют или отстаивают, для посева используют 0,2 мл надосадочной жидкости, которую равномерно распределяют шпателем по поверхности агаровых пластин предлагаемой среды.

Посевы инкубируют при 37°С. Рост возбудителя псевдотуберкулеза обнаруживают уже через 24-48 часов. Для идентификации отбирают круглые, слегка выпуклые колонии с характерными признаками - неровный край, приподнятый центр, не менее 1,0 мм в диаметре.

Среда обеспечивает высокую скорость роста возбудителя псевдотуберкулеза, на ней уже через 24-48 ч инкубации при температуре 37°С можно наблюдать рост возбудителя псевдотуберкуза.

Возможность практического использования предлагаемой питательной среды подтверждается примерами экспериментальных исследований.

ПРИМЕР 1. Исследуемый материал (смывы почвы или фуража) в объеме 0,2 мл равномерно распределяют на поверхности пластин элективной питательной среды, содержащий, г/л: агар микробиологический - 10,0; ферментативный гидролизат говяжьего мяса - 320,0; натрий хлористый - 4,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный - 3,0; натрий сернистокислый - 3,0; натрий трехзамещенный фосфорнокислый - 5,0; вода водопроводная - остальное. Посевы инкубируют при 37°С. Через 24-48 часов от начала исследования обнаруживают возбудитель псевдотуберкулеза.

ПРИМЕР 2. Исследуемый материал (смывы почвы или фуража) в объеме 0,2 мл равномерно распределяют на поверхности пластин элективной питательной среды, содержащей, г/л: агар микробиологический - 12,0; ферментативный гидролизат говяжьего мяса - 370,0; натрий хлористый - 5,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный - 4,0; натрий сернистокислый - 4,0; натрий трехзамещенный фосфорнокислый - 6,0; вода водопроводная - остальное. Посевы инкубируют при 37°С. Через 24-48 часов от начала исследования обнаруживают возбудитель псевдотуберкулеза.

ПРИМЕР 3.

Исследуемый материал (смывы почвы или фуража) в объеме 0,2 мл равномерно распределяют на поверхности пластин элективной питательной среды, содержащей г/л: агар микробиологический - 14,0; ферментативный гидролизат говяжьего мяса - 420,0; натрий хлористый - 6,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный - 5,0; натрий сернистокислый - 5,0; натрий трехзамещенный фосфорнокислый - 7,0; вода водопроводная - остальное. Посевы инкубируют при 37°С. Через 24-48 часов от начала исследования обнаруживают возбудитель псевдотуберкулеза.

Как показали экспериментальные исследования, заявляемые пределы содержания ингредиентов, входящих в состав предлагаемой питательной среды (пример 2), являются оптимальными для достижения поставленной цели, так как при уменьшении их содержания менее заявляемых пределов не происходит ингибиции роста посторонней микрофлоры, а при их увеличении подавляется рост возбудителя псевдотуберкулеза.

Таким образом, изобретение практически осуществимо, его использование в бактериологических исследованиях позволит в кратчайшие сроки получить чистую культуру возбудителя псевдотуберкулеза с последующим ускоренным проведением дифференциации возбудителя и определением антибиотикочувствительности.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской и промышленной микробиологии. Питательная среда содержит ферментативный гидролизат говяжьего мяса, агар микробиологический, натрий сернистокислый, натрий трехзамещенный фосфорнокислый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, натрий хлористый и воду водопроводную в заданном соотношении ингредиентов. Изобретение обеспечивает получение в наикратчайшие сроки чистой культуры возбудителя туберкулеза с последующим ускоренным проведением дифференциации возбудителя и определением антибиотикочувствительности.

Элективная питательная среда для выделения возбудителя псевдотуберкулеза, содержащая питательную основу, агар микробиологический, натрий хлористый, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит натрий фосфорнокислый двузамещенный, в качестве стимулирующей добавки натрий сернистокислый, натрий трехзамещенный фосфорнокислый как ингибитор роста посторонней микрофлоры, а в качестве питательной основы - ферментативный гидролизат говяжьего мяса, воду водопроводную при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Ферментативный гидролизат говяжьего мяса320,0-420,0Натрий хлористый4,0-6,0Натрий сернистокислый3,0-5,0Натрий трехзамещенный фосфорнокислый5,0-7,0Натрий фосфорнокислый двузамещенный3,0-5,0Агар микробиологический10,0-14,0Вода водопроводнаядо 1 л