ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ЖИДКАЯ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА Российский патент 2007 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к микробиологии, именно к получению питательных сред, которые создают оптимальные условия для выделения и культивирования холерного вибриона.

При бактериологическом исследовании на холеру используют различные питательные среды: жидкие среды обогащения, элективные, дифференциально-диагностические среды и набор сред для идентификации (Лабинская А.С., 1978; Методически указания, МУ 44.22.11097-02). Основой известных питательных сред являются продукты животного происхождения - пептон, мясная вода, экстракт молодого мяса др.

Недостатком данной среды является ее дороговизна.

Наиболее близкой к предлагаемой питательной среде является среда для культивирования холерного вибриона, содержащая, г/л: панкреатический гидролизат казеина 4,0; панкреатический гидролизат кормовых дрожжей 4,0; в качестве питательной основы - натрий хлористый 5,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,4; натрий пиросернистокислый (мета-бисульфит) 0,5; и дистиллированную воду до литра. (Справочник по микробиологическим питательным средам. Под ред. Меджидова М.М. Махачкала, 1989. с.66.).

Недостатком данной среды является ее высокая себестоимость, сложность приготовления.

Целью изобретения является получение качественной, дешевой питательной среды для культивирования холерного вибриона.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что питательная среда содержит питательную основу - ферментативный гидролизат соевых бобов и стимулирующую добавку - натрий сернистокислый.

В качестве исходного сырья используют сою, плоды которой - бобы содержат в среднем 40% белка, кроме того, соя богата микроэлементами и витаминами. Как известно (Y.P.Yupta, 1987), соевые белки характеризуются повышенным содержанием глутаминовой и аспарагиновой кислот, поставляющих макроэргические связи. Соевые белки содержат также большое количество таких незаменимых аминокислот, как лизин, лейцин, аргинин. Имеются также сведения о способности лейцина как аминокислоты с разветвленной белковой цепью инициировать синтез белка (Е.И.Чазов, X.С.Морган, /США/ 1989).

Приготовление питательной основы для выращивания микроорганизмов заключается в следующем. Плоды сои-бобов в количестве 0,5 кг, пятикратно вымачивают в 5 л горячей воды в течение 1 суток, причем последний настой с бобами кипятят в течение 40 мин. Затем настой сливают в 10 л баллон, охлаждают, бобы измельчают мясорубкой и помещают в настой. Добавляют поджелудочную железу КРС из расчета 20,0 на 1 л, устанавливают рН до 8,2 20% раствором натрия гидроокиси в количестве 3 мл, добавляют 1% хлорофома. Гидролиз ведут в термокамере при температуре 37°С в течение 3 сут. Первые 2 ч смесь перемешивают через каждые 15 мин, по 5 мин в последующем смесь перемешивают через каждые 6 ч. Ежедневно измеряют уровень аминного азота, который на 3 сутки составил 0,6±0,05%.

Питательную среду на основе соевого ферментативного гидролизата для выращивания микроорганизмов готовят следующим способом. Ферментативный гидролизат из соевых бобов, разбавленный дистиллированной водой до показания аминного азота 0,08% 110 мл, натрий хлористый 5,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный 4,0; дистиллированная вода - до 1 литра.

Среду кипятят до полного растворения ингредиентов, фильтруют через полотно и фильтровальную бумагу, затем устанавливают рН 7,8±0,1 с помощью 20% раствора натрия гидроокиси, добавляют стимулятор: натрий сернокислый в концентрации 0-4 г/л. Готовую среду разливают в градуированные флаконы по 100 мл и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм 30 мин. Согласно методических указаний по определению качества питательных сред для выращивания холерного вибриона (Инструкция по бактериологическому контролю диагностических питательных сред для холерного вибриона) готовят культуру авирулентного штамма НАГ - вибрион Р-9741. Для чего культуру, хранящуюся на полужидком агаре, высевают в 1% пептонную воду или бульон Мартена (рН 7,6-7,8). Через 18-20 ч роста с агара отбирают гладкие колонии НАГ вибриона Р-9741, пересевают их на агаровые пластинки (2-пассаж). Культуру выращивают 3-6 ч при 37°С, после чего используют для контроля. Из суточной культуры готовили взвесь 4 м.т., равной 5 ед. по оптическому стандарту мутности по ГИСК им.Л.А.Тарасевича. Затем серийными десятикратными разведениями в физиологическом растворе в объеме 4,5 мл доводили до содержания в 1 мл 1000 и 100 м.к. Из данных разведении взвеси культур высевали по 0-1 мл стерильной бактериологической пипеткой по 3 флакона опытной и контрольной среды. В качестве последней используется заранее проверенная высококачественная 1% пептонная вода, приготовленная на дистиллированной воде. Посевы инкубируют при 37°С 6 ч, после чего из каждого флакона с поверхности высевают петлей №5 по Чаплевскому на чашку Петри с заранее поверенной высококачественной плотной средой. Выращивание производят при 37°С. Питательная среда жидкая считается пригодной в том случае, если при посеве 100 м.к. тест-штамма в 100 мл через 6 ч выращивания и последующего высева на агаровые пластинки вырастают соответственно не менее 10 и 1 колонии. Оценку ростовых свойств питательной среды поводят путем подсчета количества выросших колоний холерного вибриона при посеве содержимого флаконов на пластинки с плотной питательной средой.

Пример 1. Тест-штамм выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат сои (бобы) 60,0; натрий хлористый 4,0; кислый фосфорнокислый натрий двузамещенный 3,0; натрий сернистокислый 0,3; дистиллированная вода до 1 л. При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара, для холерного вибриона высеянных из флаконов при посевной дозе 100 и 10 м.к., составило соответственно 10 и 1 колонии.

Пример 2. Тест-штамм выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат сои (бобы) - 110,0; натрий хлористый 5,0; кислый фосфорнокислый натрий двузамещенный 4,0; натрий сернистокислый 0,4; дистиллированная вода - до 1 л. При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара, для холерного вибриона высеянных из флаконов при посевной дозе 100 и 10 м.к., составило соответственно 39 и 8 колонии.

Пример 3. Тест-штамм выращивали на питательной среде, содержащей, г/л; ферментативный гидролизат сои (бобы) 160,0; натрий хлористый 6,0; кислый фосфорнокислый натрий двузамещенный 5-0; натрий сернистокислый 0,5; дистиллированная вода - до 1 л. При таком соотношение ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинах агара, для холерного вибриона высеянных из флаконов при посевной дозе 100 и 10 м.к., составило соответственно 13 и 1 колоний.

Таким образом, заявленная питательная среда жидкая для культивирования холерного вибриона, пример 2, приготовленная на основе ферментативного гидролизата сои (бобы), может применяться для культивирования холерного вибриона как экономически выгодная.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении питательных сред для выделения и культивирования холерного вибриона. Питательная среда содержит ферментативный гидролизат бобов сои с содержанием аминного азота 0,08%, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, натрий сернистокислый, дистиллированную воду. Изобретение позволяет получить качественную и дешевую питательную среду для культивирования холерного вибриона.

Питательная среда жидкая для культивирования холерного вибриона, содержащая питательную основу, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит в качестве стимулирующей добавки натрий сернистокислый, а в качестве питательной основы - ферментативный гидролизат бобов сои с содержанием аминного азота 0,08% при следующем соотношении компонентов, г/л:

ферментативный гидролизат бобов сои с содержанием аминного азота 0,08%60,0-160,0натрий хлористый4,0-6,0натрий фосфорнокислый двузамещенный3,0-5,0натрий сернистокислый0,3-0,5дистиллированная водаостальное