ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЧУМНОГО МИКРОБА Российский патент 2010 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению питательных сред, которые создают оптимальные условия для культивирования чумного микроба.

Известна питательная среда для культивирования чумного микроба мясо-пептонный бульон для культивирования микроорганизмов, включающий, г/л: агар-агар - 20,0; пептон - 10,0; хлористого натрия - 5,0; 20% едкого натрия до рН 7,2, дистиллированная вода до 1 л (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. М.О.Биргер. Москва, 1972 г., с.49).

Недостатком данной среды является ее низкая продуктивность.

Наиболее близкой к предлагаемому изобретению является питательная среда для выращивания чумного микроба, в которой в качестве питательной основы используют ферментативный гидролизат мясокостного фарша тушек лисицы (20-25 г/л воды), а также агар-агар (15,0-20,0 г/л), NaCl (4,0-5,0), Na₂HPO₄ (1,0-1,1 г/л) и вода (RU 2083664. Бюллетень №19. Ч.2. 10.07.1997).

Недостатком среды можно считать непопулярность питательной основы.

Целью изобретения является получение качественной, прозрачной питательной среды для культивирования чумного микроба на основе 4-часового панкреатического гидролизата свежего говяжьего мяса.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что питательная среда в качестве питательной основы содержит 4-часовой панкреатический гидролизат свежего мяса и стимулирующую добавку натрий сернистокислый, питьевую воду при следующем содержании ингредиентов, г/л:

4-часовой панкреатический гидролизат   свежего говяжьего мяса 100,0-300,0 Натрий хлористый 4,0-6,0 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 3,0-5,0 Натрий сернистокислый 0,3-0,5 Агар микробиологический 10,0-14,0 Питьевая вода до 1 л

Для приготовления питательной основы в качестве исходного сырья используют свежее говяжье мясо, содержащее в среднем от 12,7% до 21,71% азотистых веществ, минеральные вещества мяса состоят из солей натрия, калия, кальция, фосфора и железа; общее их количество достигает 1%. Мясо содержит также витамины, микроэлементы. Свежее говяжье мясо содержит больше экстрактивных веществ, чем свежемороженое (Ю.А.Козлов. Питательные среды в медицинской микробиологии. Медгиз, 1950, с.46).

Из белковых веществ в свежем говяжьем мясе при ускоренном ферментативном гидролизе образуются следующие аминокислоты, г/л: лизин, метионин, триптофан, цистин, треонин, серин, фенилаланин, пролин, аланин, глицин, валин, лейцин, тирозин, гистидин, по количественному и качественному составу ничем не отличающиеся от аминокислот мясных гидролизатов, проведенных в течение 14 дней.

Питьевая вода - вода, которая предназначена для употребления людьми, не вредит их здоровью и соответствует санитарно-эпидемическим нормам по СанПин 2.1.4.1074-01. Настоящий СанПин, сохраняя преемственность гигиенических критериев СанПин 2.1.4.1074-01, дополнен рядом новых критериев и положений. Методические указания МУ 2.1.4.1184-83, пункт 4.3.1. - на основании ГОСТа 2761 «Источники централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения» и СП 2.1.5.1059-01 «Гигиенические требования к охране подземных вод от загрязнения». В случае использования воды централизованных систем водоснабжения качество исходной (сырьевой) воды должно соответствовать требованиям к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества. Пункт 9 -санитарные правила и нормы «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества. СанПин 2.1.4.1074-01».

Приготовление питательной основы предлагаемой питательной среды для выращивания микроорганизмов заключается в следующем.

В варочный котел заливали 15 л питьевой воды и доводили до кипения. Предварительно нарезанное свежее говяжье мясо в количестве 10 кг загружали в кипящую воду и кипятили 15 мин, в процессе кипения снимали жир. Затем подогрев прекращали и оставляли для отстаивания на 20 мин. Мясо измельчали мясорубкой, мясную воду охлаждали до температуры 45±1°С, корректировали величину рН до значения 8,5±0,1 натрием углекислым. Мясной фарш в количестве 2 кг, мясную воду 5 л и поджелудочную железу крупного рогатого скота в количестве 0,2 кг помещали в 10 литровые бутыли, закрывали ватно-марлевыми пробками накрывали пергаментной бумагой, укрепляли резиновыми кольцами. В качестве консерванта в бутыли добавляли хлороформ до конечной концентрации 1%.

Процесс гидролиза вели в термокамере при температуре 37°С. Смесь перемешивали вручную через каждые 15 мин в течение 4 ч. Динамику процесса гидролиза контролировали путем определения аминного азота и по достижении 0,5-0,7% подогрев прекращали, перевар отстаивали. Отстоявшийся верхний слой гидролизата сливали в котел и выдерживали при температуре 100°С в течение 10 мин. Затем вручную фильтровали через тканевые фильтры. Сбор фильтрата вели в стеклянные баллоны емкостью 10 л. Для консервации добавляли хлороформ в количестве 1% к объему фильтрата, закрывали резиновыми пробками, этикетировали и транспортировали в холодовую камеру, где хранили при температуре от 2-8°С.

Питательную среду на основе 4-часового панкреатического гидролизата свежего говяжьего мяса для выращивания микроорганизмов готовят следующим способом. Берут 4-часовой панкреатический гидролизат свежего говяжьего мяса, разбавленного питьевой водой до показания аминного азота 0,12% - 200,0 мл; натрий хлористый - 5,0 г; натрий фосфорнокислый двузамещенный - 4,0 г. Для осветления полученной жидкости используют активированный уголь марки «УО-А» в количестве 2% к объему среды, который ссыпают в эмалированную кастрюлю, доливают питьевую воду до 1 л, среду тщательно перемешивают до образования однородной массы. Подогревают до 56°С, затем устанавливают рН до 8,2±0,1 с помощью 20% раствора гидроокиси натрия в количестве 8,0 мл, кипятят в течение 5 мин. Фильтруют через полотно и 8-16 слоев фильтровальной бумаги, сбор фильтрата проводят в эмалированную кастрюлю. В готовый фильтрат светло-желтого цвета добавляют агара микробиологического 12 г/л. Смесь доводят до 100°С и кипятят до полного расплавления агара в течение 10 мин. рН корректируют раствором соляной кислоты (1:1) до рН 7,2±0,1, добавляют натрий сернистокислый в концентрации 0,4 г/л.

Приготовленную среду разливают в градуированные флаконы по 200±0,5 мл, которые герметично укупоривают ватно-марлевыми пробками и бумагой крафт. Стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин. Стерильную среду после расплавления в кипящей бане разливают в стерильные чашки Петри, просушивают в течение 30 мин и используют для посева.

В качестве примера испытывали культуру вакцинного штамма чумного микроба ЕВ, выращенную на пластинках 2% агара Хоттингера, рН 7,2 при температуре 28°С в течение 24 ч. Из суточной агаровой культуры тест-штамма чумного микроба готовят взвесь в 0,9% растворе хлористого натрия густотой 1,0·10⁹ м.к./мл по стандартному образцу мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича, ОСО 422859-86 П, - 10 единиц и делают 10-кратные последовательные разведения, перенося 0,5 мл взвеси в 4,5 мл 0,9% раствора хлористого натрия до разведения 10^-7 (1·10² м.к./мл), тщательно перемешивая, меняя стерильную пипетку после каждого разведения. Культуру из разведения 10^-6 (1000 м.к./мл) и 10^-7 (100 м.к./мл) наносят по 0,1 мл на 3 свежеприготовленные и хорошо просушенные агаровые пластинки. Распределяют посеянную культуру по поверхности агара покачиванием чашки Петри. Учет результатов скорости роста культуры в каждом разведении микробной взвеси производят через 48 ч инкубации при 28°С. Показатель скорости роста определяют по минимальному времени инкубации посевов, за которое при соответствующем разведении обеспечен отчетливо видимый рост культуры во всех засеянных чашках с плотной средой и формирование типичных, легко дифференцируемых при микроскопии колоний на чашках с плотной средой.

Оценку ростовых свойств питательной среды для культивирования чумного микроба проводят путем подсчета количества выросших колоний на пластинках агара.

Пример 1

Тест-штамм выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: 4-часовой панкреатический гидролизат свежего говяжьего мяса - 100,0; натрий хлористый - 4,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный - 3,0; натрий сернистокислый - 0,3; агар микробиологический - 10,0; питьевая вода - до 1 л.

При таком соотношении ингредиентов наблюдался типичный рост колоний, выросших на пластинках агара, для чумного микроба при посевной дозе 100 и 10 м.к. составило через 48 ч соответственно 55 и 5 диаметром 1,0 мм.

Пример 2

Тест-штамм выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: 4-часовой панкреатический гидролизат свежего говяжьего мяса - 200,0; натрий хлористый - 5,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный - 4,0; натрий сернистокислый - 0,4; агар микробиологический - 12,0; питьевая вода - до 1 л.

При таком соотношении ингредиентов наблюдался типичный рост колоний, выросших на пластинках агара, для чумного микроба при посевной дозе 100 и 10 м.к. составило через 48 ч соответственно 65 и 6 диаметром 1,5 мм.

Пример 3

Тест-штамм выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: 4-часовой панкреатический гидролизат свежего говяжьего мяса - 300,0; натрий хлористый - 6,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный - 5,0; натрий сернистокислый - 0,5; агар микробиологический - 14,0; питьевая вода - до 1 л.

При таком соотношении ингредиентов наблюдался типичный рост колоний чумного микроба, при посевной дозе 100 и 10 м.к. составило через 48 ч соответственно 50 и 5 диаметром 1,0 мм.

Таким образом, заявленная питательная среда для культивирования чумного микроба (пример 2), приготовленная на 4-часовом панкреатическом гидролизате свежего говяжьего мяса, может заменить по ростовым качествам питательную среду на ферментативной основе мясного гидролизата, приготовленную за 14 дней.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологии. Питательная среда для культивирования чумного микроба содержит, г/л: 4-часовой панкреатический гидролизат свежего говяжьего мяса - 100,0-300,0, натрий хлористый - 4,0-6,0, натрий фосфорнокислый двузамещенный - 3,0-5,0, натрий сернистокислый - 0,3-0,5, агар микробиологический - 10,0-14,0 и питьевую воду до 1 л. Это обеспечивает повышение качества питательной среды, ускорение ее приготовления и расширение арсенала питательных сред для культивирования чумного микроба, т.к. может заменить по ростовым качествам питательную среду на ферментативной основе мясного гидролизата, приготовленную за 14 дней.

Питательная среда для культивирования чумного микроба, содержащая питательную основу, агар микробиологический, натрий хлористый, натрий фосфорно-кислый двузамещенный, воду, отличающаяся тем, что она дополнительно в качестве стимулирующей добавки содержит натрий сернисто-кислый, в качестве питательной основы - 4-часовой панкреатический гидролизат свежего говяжьего мяса, а в качестве воды - питьевую воду при следующем соотношении ингредиентов, г/л:
4-часовой панкреатический гидролизат   свежего говяжьего мяса 100,0-300,0 натрий хлористый 4,0-6,0 натрий фосфорно-кислый двузамещенный 3,0-5,0 натрий сернисто-кислый 0,3-0,5 агар микробиологический 10,0-14,0 питьевая вода до 1 л